Los estudios y Nicolai J. Wewer Albrechtsen fueron apoyados por la Beca de Excelencia para Investigadores Emergentes de la Fundación Novo Nordisk - Endocrinología y Metabolismo (Solicitud No. NNF19OC0055001), Premio al Futuro Líder de la Fundación Europea para el Estudio de la Diabetes (NNF21SA0072746) y Fondo de Investigación Independiente de Dinamarca, Sapere Aude (1052-00003B). El Centro de Investigación de Proteínas de la Fundación Novo Nordisk cuenta con el apoyo financiero de la Fundación Novo Nordisk (acuerdo de subvención NNF14CC0001). La figura 1B se creó con biorender.com. Agradecemos al Dr. Rune E. Kuhre (Novo Nordisk A/S) por sus fructíferas discusiones sobre el hígado de ratón perfundido.

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo con el permiso de la Inspección Danesa de Experimentos con Animales, Ministerio de Medio Ambiente y Alimentación de Dinamarca (permiso 2018-15-0201-01397) y el comité de ética local de acuerdo con la directiva de la UE 2010/63/UE, los Institutos Nacionales de Salud (publicación n.º 85-3) y siguiendo las directrices de la legislación danesa que rige la experimentación con animales (1987). Se trata de un procedimiento terminal, y la causa de la muerte es la exanguinación y perforación del diafragma bajo anestesia profunda.
1. Animales de experimentación
<ol><li>Obtenga ratones de la cepa, edad y sexo deseados. En este estudio se utilizaron ratones machos C57BL/6JRj de entre 11 y 16 semanas de edad. Aloje hasta 5 ratones machos u 8 hembras por jaula con acceso ad libitum a comida y agua y mantenga un ciclo de luz-oscuridad de 12 h / 12 h con luces encendidas de 6 a.m. a 6 p.m.</li>
</ol>2. Preparativos preoperatorios
<ol><li>Prepare un tampón de perfusión hepática.<ol><li>Búfer Krebs-Henseleit. Mezclar y disolver 118 mmol/L de NaCl, 4,7 mmol/L de KCl, 1,2 mmol/L de MgSO 4 y 1,2 mmol/L de KH 2 PO4 en dH 2 O. Disolver 1,25 mmol/L de CaCl2en un vaso de precipitados aparte y añadir el tampón.</li>
		<li>Disuelva 25 mmol/L de NaHCO3 y agréguelo lentamente al tampón mientras revuelve. Guarde el tampón a 4 grados. El búfer es estable durante al menos 1 mes. NOTA: La precipitación puede ocurrir si el CaCl2 y el NaHCO3 no se disuelven individualmente antes de ser agregados.</li>
	</ol></li>
	<li>Filtrar el tampón de perfusión a través de un filtro de 2 μm y ajustar el pH a 7,5 utilizando HCl. NOTA: Este paso debe realizarse el día experimental, ya que el pH aumenta con el tiempo, incluso cuando se almacena en matraces cerrados.</li>
	<li>Preparar los compuestos de ensayo en una concentración superior a la concentración final deseada (p. ej., concentración de 20x cuando se infunde a una velocidad de 0,175 ml/min a través de una bomba de brazo lateral) en tampón de perfusión Krebs-Henseleit filtrado y ajustado al pH. Si procede, diluir los compuestos problema en tampón de perfusión Krebs-Henseleit con un 1 % de BSA añadido como portador (para evitar la adhesión a tubos y cristalería, esencial para todos los péptidos), filtrado a través de un filtro de tamaño adecuado.</li>
</ol>3. Funcionamiento y perfusión
NOTA: En la Figura 1 se proporciona una ilustración de la configuración de perfusión utilizada en este estudio.
<ol><li>Gasear el tampón de perfusión (95% O 2, 5% CO2) durante al menos 30 minutos para suministrar suficiente oxígeno al hígado y mantener el pH correcto desde el inicio de la operación (el sistema tampón de bicarbonato alcanzará un pH de 7,4 bajo gasificación continua, ver Figura 1 suplementaria).</li>
	<li>Anestesiar a un ratón mediante la administración de ketamina (90 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg) mediante inyección intraperitoneal.</li>
	<li>Coloque el ratón en decúbito supino sobre una mesa de operaciones calentada y confirme la falta de reflejos en respuesta al pellizco del dedo del pie. Rocíe con etanol al 70% para evitar que el cabello se pegue a las tijeras. Fijar el mouse a la superficie caliente ayuda a aumentar la estabilidad para los siguientes procedimientos.</li>
	<li>Haga una incisión con unas tijeras en la base del abdomen y corte hacia arriba hasta la caja torácica en ambos lados para exponer la cavidad abdominal. Mueva los intestinos hacia la derecha con un hisopo de algodón, exponiendo la vena porta.</li>
	<li>Coloque dos ligaduras debajo de la vena porta con pinzas curvas y prepare un nudo suelto para cada ligadura.</li>
	<li>Inserte un catéter de 0,7 mm en la vena porta. Una vez perforada, retire la aguja del catéter y guíe el catéter a través de la vena hasta que la punta del catéter esté cerca del hígado, como se ilustra en la Figura 2. La sangre fluye hacia el catéter.</li>
	<li>Apriete las ligaduras. Si el catéter no está lleno de sangre, llénelo con tampón de perfusión para evitar la introducción de una burbuja de aire.</li>
	<li>Conecte el tubo de perfusión e inicie la perfusión del hígado con tampón de bicarbonato Krebs-Henseleit a 37 °C poniendo en marcha la bomba de rodillos a un caudal de perfusión de 0,8 ml/min. El hígado palidece en cuestión de segundos.</li>
	<li>Corta la caja torácica y el diafragma con unas tijeras. En este punto, el animal es sacrificado. Coloque una ligadura debajo de la vena cava inferior suprahepática con pinzas de punta fina. Coloque un bolígrafo, una gasa enrollada u otro artículo desechable debajo de la parte posterior del ratón para que la vena sea más accesible.</li>
	<li>Insertar un catéter en la vena cava inferior suprahepática a través de la aurícula derecha del corazón. Cuando esté perforado, retire la aguja del catéter y guíe el catéter a través de la vena hasta que la punta del catéter esté cerca del hígado. El tampón de sangre y perfusión se agota inmediatamente.</li>
	<li>Apriete la abrazadera y coloque un tubo para la recolección del efluente de perfusión. Asegure todos los tubos con cinta impermeable (cinta adhesiva lisa o similar).</li>
	<li>Utilice un adaptador de pinza vascular para colocar una pinza vascular a través de la vena cava infrahepática inmediatamente por encima de la vena renal derecha para evitar la mezcla (Figura 2).</li>
	<li>Aumente el caudal de perfusión a 3,5 ml/min y ponga en marcha un temporizador. Inicie el registro de presión. La perfusión exitosa generalmente resulta en una presión de ~ 10 mm / Hg.</li>
	<li>Cubra el hígado con un paño estéril humedecido con solución salina y agregue solución salina durante el experimento para evitar que se seque.</li>
	<li>Recoja el efluente de perfusión durante 1 minuto y mida el volumen. El volumen debe ser de aproximadamente 3,5 ml/min. No se espera una mezcla de sangre en esta etapa, y el corazón ya no bombea.</li>
	<li>Espere un período de equilibrio de 30 minutos antes de comenzar el experimento.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65596/65596fig01.jpg"> Figura 1: Ilustración de la configuración de perfusión . (A)La mesa de operaciones se eleva sobre un soporte de trípode y se calienta a 37 °C. El tampón de perfusión se gasifica (95%O2, 5% CO2), se bombea a través de una bomba de rodillos peristálticos y se calienta en el intercambiador de calor con una trampa de burbujas incorporada. Además, el sistema consta de un manómetro y una bomba de husillo para ajustar la presión de perfusión. La presión de perfusión se registra y visualiza continuamente a través de un transductor en un PC, un programa de registro de presión. (B) El recuadro rojo captura las conexiones de las llaves de paso de tres vías. La primera llave de paso de tres vías está abierta para la infusión de un compuesto de prueba a través de una bomba de jeringa, y la segunda está cerrada. El tercero está abierto para mediciones continuas de presión. La cuarta llave de paso se puede utilizar para recoger muestras de entrada, por ejemplo, análisis de gases en el hígado perfundido. Los conectores se pueden modificar según sea necesario para experimentos específicos que requieren más o menos líneas de infusión. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65596/65596fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65596/65596fig02.jpg"> Figura 2: Fotos de la cavidad abdominal del ratón antes y durante la perfusión hepática. (A)El punto verde indica la ubicación de la punta del catéter de la vena porta. Es importante que la punta del catéter se coloque justo debajo del punto de ramificación de la vena porta en las venas portas hepáticas izquierda y derecha, pero por encima de la rama pancreato-duodenal para evitar fugas. El punto amarillo indica la ubicación correcta de la pinza del vaso en la vena cava inferior infrahepática entre la vena renal derecha y el hígado para evitar el reflujo de sangre hacia el hígado perfundido. (B, C) Hígado de ratón perfundido con los dos catéteres insertados en la vena porta (B) y la vena cava inferior suprahepática (C) y la pinza del vaso en la vena cava inferior infrahepática (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65596/65596fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
4. Experimenta
<ol><li>Comience el experimento recolectando las primeras muestras de referencia utilizando un colector de fracciones al final del período de equilibrio. Recoja las muestras en el intervalo de tiempo deseado y colóquelas en hielo inmediatamente.</li>
	<li>Revise la trampa de burbujas con regularidad y rellénela con tampón de perfusión cuando esté cerca de vaciarse.</li>
	<li>Recoger una muestra del tampón a través de una llave de paso de tres vías inmediatamente antes de que entre en el órgano y del catéter colector insertado en la vena cava inferior (después de que se haya perfundido a través del hígado).</li>
	<li>Mida las muestras con un analizador de gases en sangre para confirmar que el órgano es metabólicamente activo (indicado por un aumento de la presión parcial de CO2 y una disminución del pH).</li>
	<li>Repita los pasos 4.3-4.4 al final del experimento para evaluar la viabilidad a lo largo del experimento (Figura complementaria 2). NOTA: La disminución de la presión parcial de oxígeno no proporciona una medida confiable de la respiración debido a las pérdidas de oxígeno de los tubos, el órgano, etc.</li>
	<li>Después de 15 min de perfusión basal, iniciar la primera estimulación mediante la infusión de una sustancia problema a través de una llave de paso de tres vías al caudal deseado utilizando una bomba de jeringa (p. ej., concentración 20 veces mayor de la sustancia problema cuando se infunde a una velocidad de 0,175 ml/min a través de una bomba de brazo lateral). Alternativamente, cambiar el tampón de referencia por un nuevo tampón (oxigenado y calentado) que contenga el compuesto problema en la concentración final.</li>
	<li>Detenga la estimulación y recoja muestras de referencia durante 20-30 minutos antes de comenzar la segunda estimulación.</li>
	<li>Al final del experimento, infundir un control positivo apropiado durante 5-10 min.</li>
	<li>Después del experimento, extirpe el hígado perfundido y péselo para normalizar la salida al peso del hígado. Congele el hígado en nitrógeno líquido para la medición potencial del contenido de proteínas para normalizar la producción al contenido de proteínas.</li>
</ol>5. Mediciones bioquímicas
<ol><li>Cuantificar la concentración de la molécula de interés mediante ensayos apropiados para mediciones en tampón de perfusión (ensayos colorimétricos o ELISA internos o disponibles comercialmente). El tampón es compatible con la mayoría de las técnicas basadas en ómicas, como la metabolómica y la proteómica. NOTA: En este estudio, la urea se midió con base en un ensayo colorimétrico descrito anteriormente14. La glucosa y los ácidos grasos no esterificados se cuantificaron utilizando kits disponibles en el mercado.</li>
</ol>6. Análisis de datos
<ol><li>Presente los datos en gráficos XY que muestren la salida secretora a lo largo del tiempo. NOTA: Una de las virtudes del sistema de perfusión in vitro es que es posible expresar los datos como la salida real (concentración × caudal, por ejemplo, μmol/min) en lugar de la concentración medida en la salida (mmol/L) como en los estudios in vivo . Considere la posibilidad de normalizar la producción del peso del hígado cuando se comparen diferentes modelos de ratón o del contenido total de proteínas (medido por BCA) cuando se comparen ratones de control con modelos de ratón con obesidad o enfermedades hepáticas en las que un aumento del peso del hígado puede deberse a un mayor contenido de grasa.</li>
	<li>Presentar los datos resumidos como puntos individuales por animal que representen la media o la producción total durante el inicio del estudio y durante un período de estimulación (normalmente de 15 a 30 minutos) o la producción incremental utilizando la línea de base anterior para cada período de estimulación, dependiendo del diseño del estudio.</li>
	<li>Analice los datos mediante una prueba t pareada (dos grupos) o ANOVA de un factor con estimulaciones repetidas (más de dos grupos) con una prueba post-hoc adecuada para pruebas múltiples.</li>
</ol>

In Situ Mouse Liver Perfusion Model to Study Metabolic Responses to Substrates

<ol>
	<li>Bale, S. S., Geerts, S., Jindal, R., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+co-culture+of+rat+parenchymal+and+non-parenchymal+liver+cells+to+evaluate+cellular+interactions+and+response.">Isolation and co-culture of rat parenchymal and non-parenchymal liver cells to evaluate cellular interactions and response.</a> Scientific Reports. 6, 25329 (2016).</li><li>Lauschke, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massive+rearrangements+of+cellular+MicroRNA+signatures+are+key+drivers+of+hepatocyte+dedifferentiation.">Massive rearrangements of cellular MicroRNA signatures are key drivers of hepatocyte dedifferentiation.</a> Hepatology. 64 (5), 1743-1756 (2016).</li><li>Seirup, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+changes+in+chromatin+structure+during+dedifferentiation+of+primary+hepatocytes+in+vitro.">Rapid changes in chromatin structure during dedifferentiation of primary hepatocytes in vitro.</a> Genomics. 114 (3), 110330 (2022).</li><li>Gupta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+in+vitro+human+liver+models+to+in+vivo+human+liver+using+RNA-Seq.">Comparing in vitro human liver models to in vivo human liver using RNA-Seq.</a> Archive of Toxicology. 95 (2), 573-589 (2021).</li><li>Bell, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+primary+human+hepatocyte+spheroids+as+a+model+system+for+drug-induced+liver+injury,+liver+function,+and+disease.">Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function, and disease.</a> Scientific Reports. 6, 25187 (2016).</li><li>Dewyse, L., Reynaert, H., van Grunsven, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+practices+and+progress+in+precision-cut+liver+slice+cultures.">Best practices and progress in precision-cut liver slice cultures.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 7137 (2021).</li><li>Li, X., George, S. M., Vernetti, L., Gough, A. H., Taylor, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glass-based,+continuously+zonated+and+vascularized+human+liver+acinus+microphysiological+system+(vLAMPS)+designed+for+experimental+modeling+of+diseases+and+ADME/TOX.">A glass-based, continuously zonated and vascularized human liver acinus microphysiological system (vLAMPS) designed for experimental modeling of diseases and ADME/TOX.</a> Lab on a Chip. 18 (17), 2614-2631 (2018).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation.">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1724-1743 (2016).</li><li>Barto&#353;ek, I., Guaitani, A., Miller, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Isolated Liver Perfusion and its Applications. , (1973).</li><li>Gores, G. J., Kost, L. J., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolated+perfused+rat+liver:+conceptual+and+practical+considerations.">The isolated perfused rat liver: conceptual and practical considerations.</a> Hepatology. 6 (3), 511-517 (1986).</li><li>Mischinger, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+technique+for+isolated+perfusion+of+rat+livers+and+an+evaluation+of+perfusates.">An improved technique for isolated perfusion of rat livers and an evaluation of perfusates.</a> Journal of Surgical Research. 53 (2), 158-165 (1992).</li><li>Vairetti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+the+liver+temperature+employed+during+machine+perfusion+and+reperfusion+damage:+role+of+Ca2.">Correlation between the liver temperature employed during machine perfusion and reperfusion damage: role of Ca2.</a> Liver Transplantation. 14 (4), 494-503 (2008).</li><li>Ferrigno, A., Richelmi, P., Vairetti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troubleshooting+and+improving+the+mouse+and+rat+isolated+perfused+liver+preparation.">Troubleshooting and improving the mouse and rat isolated perfused liver preparation.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 107-114 (2013).</li><li>Zawada, R. J. X., Kwan, P., Olszewski, K. L., Llinas, M., Huang, S. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+determination+of+urea+concentrations+in+cell+culture+medium.">Quantitative determination of urea concentrations in cell culture medium.</a> Biochemistry and Cell Biology. 87 (3), 541-544 (2009).</li></ol>

Los autores declaran no tener conflictos de intereses relevantes para este artículo.

El hígado de ratón aislado y perfundido es una herramienta de investigación sólida para el estudio de la dinámica y los mecanismos moleculares del metabolismo hepático. La posibilidad de recoger muestras minuto a minuto proporciona una evaluación detallada del efecto directo de un compuesto problema en el hígado. En comparación con los estudios in vivo, el hígado perfundido nos permite estudiar el metabolismo hepático de forma aislada, evitando factores extrahepáticos transportados por la sangre y co...

El hígado es un órgano esencial en el metabolismo. Desempeña un papel clave en el control del equilibrio energético de todo el cuerpo mediante la regulación del metabolismo de la glucosa, los lípidos y los aminoácidos. El aumento de las enfermedades hepáticas en todo el mundo se está convirtiendo en una importante carga para la salud mundial, y se necesita más conocimiento sobre la fisiopatología y sus consecuencias para las funciones hepáticas.
Se han desarrollado varios modelos in vitro para la investigación en el hígado como complemento de los estudios in vivo. Los hepatocitos primarios aislados y cultivados de roedores y humanos son ampliamente utilizados. Las células no parenquimatosas se pueden separar de los hepatocitos mediante centrifugación diferencial y de gradiente, y el cocultivo de diferentes tipos celulares es útil para estudiar la diafonía intercelular1. A pesar de que los hepatocitos humanos primarios se consideran el estándar de oro para probar la toxicidad de los fármacos, varios estudios han demostrado que los hepatocitos se desdiferencian rápidamente en el cultivo de tejidos, lo que resulta en la pérdida de las funciones hepáticas 2,3,4. El cultivo de hepatocitos en un sistema esferoide 3D mejora la desdiferenciación, es más estable y parece imitar al hígado in vivo en un grado mayor que los sistemas de cultivo 2D tradicionales5. Los cortes de hígado cortados con precisión son otro modelo in vitro bien establecido que mantiene intacta la arquitectura del tejido y contiene las células no parenquimatosas presentes en el hígado6. Los modelos in vitro más avanzados incluyen el hígado en un chip7 y los organoides hepáticos8. Sin embargo, con todos estos enfoques, hay una pérdida de integridad estructural y dinámica de flujo, incluido el flujo vectorial de la vena portal-hepática, lo que probablemente afecte la generalización.
El hígado de rata perfundido aislado fue descrito por primera vez por Claude Bernard en 18559, y todavía se utiliza en varios campos científicos para estudios de biología hepática, toxicología y fisiopatología. Las ventajas del hígado perfundido en comparación con los modelos in vitro mencionados anteriormente incluyen el mantenimiento de la arquitectura hepática, el flujo vascular, la polaridad y zonación de los hepatocitos, y las interacciones entre los hepatocitos y las células no parenquimatosas. En comparación con los estudios in vivo, el hígado perfundido permite el estudio del metabolismo hepático de forma aislada, evitando factores extrahepáticos transportados por la sangre y con un control completo sobre las condiciones experimentales. A lo largo de los años se han realizado varias modificaciones para mejorar el modelo de perfusión hepática de rata 10,11,12,13. Aunque se han utilizado ratones para estudios de hígado perfundido aislado, hay menos bibliografía disponible. Aquí, presentamos un método para la perfusión in situ del hígado de ratón mediante canulación de la vena porta y la vena cava suprahepática inferior para estudiar las respuestas metabólicas agudas y directas a sustratos metabólicos y hormonas medidas en el efluente venoso hepático del hígado de ratón en tiempo real.

hepatic glucose production, ureagenesis, and lipolysis quantified using the perfused mouse liver model

El hígado tiene numerosas funciones, incluido el metabolismo de los nutrientes. A diferencia de otros modelos in vitro e in vivo de investigación hepática, el hígado perfundido aislado permite el estudio de la biología hepática y el metabolismo en todo el hígado con una arquitectura hepática intacta, separada de la influencia de factores extrahepáticos. Las perfusiones hepáticas se desarrollaron originalmente para ratas, pero el método también se ha adaptado a ratones. Aquí describimos un protocolo para la perfusión in situ del hígado de ratón. El hígado se perfunde antegrágradamente a través de la vena porta con tampón bicarbonato Krebs-Henseleit oxigenado, y la salida se recoge de la vena cava inferior suprahepática con pinzamiento de la vena cava inferior infrahepática para cerrar el circuito. Con este método, los efectos hepáticos directos de un compuesto problema pueden evaluarse con una resolución temporal detallada. La función hepática y la viabilidad son estables durante al menos 3 h, lo que permite la inclusión de controles internos en el mismo experimento. Las posibilidades experimentales que utilizan este modelo son numerosas y pueden inferir información sobre la fisiología hepática y las enfermedades hepáticas.

The liver is an essential organ in metabolism. It plays a key role in the control of whole-body energy balance by regulating glucose, lipid, and amino acid metabolism. The increase in liver diseases worldwide is emerging as a major global health burden, and more knowledge is needed about the pathophysiology and its consequences for liver functions.
Various in vitro models have been developed for research on the liver to complement in vivo studies. Isolated and cultured primary hepatocytes from rodents and humans are widely used. Non-parenchymal cells can be separated from hepatocytes using differential and gradient centrifugation, and the co-culture of different cell types is useful for studying intercellular crosstalk1. Although primary human hepatocytes are considered the golden standard for testing drug toxicity, several studies have shown that the hepatocytes rapidly dedifferentiate in tissue culture resulting in loss of hepatic functions2,3,4. Hepatocyte culture in a 3D spheroid system ameliorates the dedifferentiation, is more stable, and appears to mimic the liver in vivo to a higher degree than the traditional 2D culture systems5. Precision-cut liver slices are another well-established in vitro model that keeps the tissue architecture intact and contains the non-parenchymal cells present in the liver6. More advanced in vitro models include liver-on-a-chip7 and liver organoids8. However, with all these approaches, there is a loss of structural integrity and flow dynamics, including vectorial portal-hepatic vein flow, which likely impacts the generalizability.
The isolated perfused rat liver was first described by Claude Bernard in 18559, and is still used in various scientific fields for studies of liver biology, toxicology, and pathophysiology. Advantages of the perfused liver compared to the above-mentioned in vitro models include the maintenance of the hepatic architecture, the vascular flow, the hepatocyte polarity and zonation, and the interactions between hepatocytes and non-parenchymal cells. Compared to in vivo studies, the perfused liver allows the study of liver metabolism in an isolated manner avoiding extra-hepatic factors carried by the blood and with complete control over the experimental conditions. Several modifications have been made to improve the rat liver perfusion model over the years10,11,12,13. Although mice have been used for isolated perfused liver studies, less literature is available. Here, we present a method for in situ perfusion of the mouse liver by cannulation of the portal vein and the suprahepatic vena cava inferior to study the acute and direct metabolic responses to metabolic substrates and hormones as measured in the hepatic venous effluent from the mouse liver in real-time.

Author Spotlight: Investigating Hepatic Adaptations and Prediabetic Progression in Liver Diseases 

Producción hepática de glucosa, ureagénesis y lipólisis cuantificadas mediante el modelo de hígado de ratón perfundido

Se requiere una línea de base estable para determinar si un estímulo o sustrato conduce a la liberación de la molécula de interés. La figura 3A muestra un ejemplo de un experimento exitoso. La producción de urea en el hígado perfundido se mide en intervalos de 2 minutos y se muestra como media ± SEM. Los períodos de referencia que preceden a cada uno de los dos períodos de estimulación son constantes. La producción media de urea durante los dos pe...

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Aquí, presentamos un método robusto para la perfusión in situ del hígado de ratón para estudiar la regulación aguda y directa del metabolismo hepático sin alterar la arquitectura hepática pero en ausencia de factores extrahepáticos.

The liver has numerous functions, including nutrient metabolism. In contrast to other in vitro and in vivo models of liver research, the isolated perfused ...

En nuestro laboratorio, investigamos cómo responde el hígado a las enfermedades hepáticas comunes y raras, y cómo estas adaptaciones pueden predisponer a un estado prediabetogénico. El hígado responde a los cambios en la disponibilidad de nutrientes y las concentraciones de hormonas con un aumento de la transcripción de genes relevantes, pero lo que es más importante, también con una regulación aguda y no transcripcional. Con el hígado perfundido, podemos cuantificar todos los aspectos del metabolismo, incluida la liberación de metabolitos en una resolución minuto a minuto.Las ventajas de esta técnica frente a otros modelos in vitro son que el hígado queda in situ con una arquitectura hepática intacta. Y que el hígado sea viable durante al menos tres horas, lo que permite que cada hígado de ratón sea su propio control. Por último, aumentar la relevancia traslacional.Utilizando el sistema hepático perfundido en ratones, somos capaces de identificar y caracterizar una nueva cascada de señalización de la hormona glucagón. Esto puede ser importante ya que el glucagón, así como otras hormonas, pueden desempeñar un papel vital en las condiciones dismetabólicas del hígado en pacientes con enfermedad del hígado graso y diabetes.

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Hepatic Glucose Production, Ureagenesis, and Lipolysis Quantified using the Perfused Mouse Liver Model

Pharmacokinetics: Drug Biotransformation

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1.1K vistas.  University of Copenhagen. En nuestro laboratorio, investigamos cómo responde el hígado a las enfermedades hepáticas comunes y raras, y cómo estas adaptaciones pueden predisponer a un estado prediabetogénico. El hígado responde a los cambios en la disponibilidad de nutrientes y las concentraciones de hormonas con un aumento de la transcripción de genes relevantes, pero lo que es más importante, también con una regulación aguda y no transcripcional. Con el hígado perfundido, podemos cuantificar todos los aspe...

Video: Author Spotlight: Investigating Hepatic Adaptations and Prediabetic Progression in Liver Diseases 

The liver has numerous functions, including nutrient metabolism. In contrast to other in vitro and in vivo models of liver research, the isolated perfused liver allows the study of liver biology and metabolism in the whole liver with an intact hepatic architecture, separated from the influence of extra-hepatic factors. Liver perfusions were originally developed for rats, but the method has been adapted to mice as well. Here we describe a protocol for in situ perfusion of the mouse liver. The liver is perfused antegradely through the portal vein with oxygenated Krebs-Henseleit bicarbonate buffer, and the output is collected from the suprahepatic inferior vena cava with clamping of the infrahepatic inferior vena cava to close the circuit. Using this method, the direct hepatic effects of a test compound can be evaluated with a detailed time resolution. Liver function and viability are stable for at least 3 h, allowing the inclusion of internal controls in the same experiment. The experimental possibilities using this model are numerous and may infer insight into liver physiology and liver diseases.

Here, we present a robust method for in situ perfusion of the mouse liver to study the acute and direct regulation of liver metabolism without disturbing the hepatic architecture but in the absence of extra-hepatic factors.

Investigación

Medicina

Mouse Liver Operation and Perfusion for Studying Hepatic Metabolism 

To begin, place the anesthetized C57 Black/6 JRj mouse. Supine on a heated operation table. Confirm the absence of reflex responses to toe pinching.Spray the mouse with 70%ethanol to prevent hair from sticking to the scissors. Using scissors, make an abdominal incision at the base, cutting upwards on both sides to the rib cage to expose the abdominal cavity. Use a cotton swab to move the intestines to the right, exposing the portal vein.Using curved forceps, place two ligatures under the portal vein and loosely tie each ligature. Next, insert a 0.7-millimeter catheter into the portal vein. When perforated, remove the needle from the catheter and guide the catheter through the vein until the tip of the catheter is close to the liver.Then, tighten the ligatures. Observe the liver. Set the flow rate from the roller pump and attach the profusion tube.Initiate the profusion of the liver at 37 degrees Celsius. Once the liver turns pale, use scissors to cut the rib cage and diaphragm. Then, using fine point forceps, place ligature under the suprahepatic inferior vena cava.Next, insert a catheter into the suprahepatic inferior vena cava through the right atrium of the heart. When perforated, remove the needle and guide the catheter through the vein closer to the liver. Then, tighten the ligature.Attach a tube for the collection of perfusion effluent and secure all tubes with waterproof tape. Using a vessel clamp adapter, place a vessel clamp across the infrahepatic vena cava immediately above the right renal vein to prevent dead mixture. Next, increase the perfusion flow rate to 3.5 milliliters per minute.Start the timer and pressure recording. Cover the liver with a sterile drape moistened with saline, equilibrate for 30 minutes, and measure the volume of effluent. After 30 minutes of equilibration, initiate the experiment for the first baseline sample collection in the fraction collector.Monitor the bubble trap regularly and refill with perfusion buffer when close to empty. Collect a buffer sample via a three-way stopcock immediately before it enters the organ and from the collecting catheter inserted in the inferior vena cava. Using a blood gas analyzer, measure the collected sample to confirm that the organ is metabolically active.After 15 minutes of baseline perfusion, using a syringe pump, start the first stimulation by infusing a test substance through a three-way stopcock at desired flow rate. After the simulation, collect baseline samples for 20 to 30 minutes before starting the second stimulation. The production of urea in the perfused liver with steady baseline periods preceding each of two stimulation periods suggested that the response of urea to two consecutive stimulations with mixed amino acids is consistent.A steady basal release of glucose and non-esterified fatty acids was observed. Before a robust increase in glucose and non-ED fatty acids during the glucagon infusion. The mean value at the basal state and during the glucagon infusion suggests that glucagon rapidly stimulates hepatic glycogenolysis and lipolysis.However, without steady basal periods, it becomes impossible to distinguish one urea response from the next.