Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı, hibe no. 81930031, 81901525. Ayrıca, bize makine ve teknik rehberlik sağladığı için Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd.'ye teşekkür ederiz.

İnsan örneklerinin toplanması, Tianjin Tıp Üniversitesi Genel Hastanesi Tıbbi Etik Komitesi tarafından onaylandı. İnsan venöz kanının toplanması, Çin Ulusal Sağlık Komisyonu tarafından yayınlanan kılavuzu, yani WS/T 661-2020 Venöz Kan Örneklerinin Toplanması Kılavuzunu sıkı bir şekilde takip etti. Kısaca, sağlıklı bireylerden bilgilendirilmiş onam ile anterior brakiyal bölge veninden kan alındı ve örnekler 1:9 oranında %3.2'lik sodyum sitrat antikoagülan kullanılarak karıştırıldı. Sadece sodyum sitrat antikoagülan örnekleri toplandığında, ilk toplama kabı atıldı. İşleme akışı, numune alındıktan sonraki 0,5 saat içinde başlatıldı. Yetişkin sağlıklı denekler, bilgilendirilmiş onam alındıktan sonra numune toplama için işe alındı. Hasta dışlama kriterleri şunlardı: (1) yakın zamanda intravasküler tromboz, (2) karaciğer ve böbrek fonksiyon bozukluğu, (3) hipertansiyon, hiperlipidemi, diyabet ve diğer kronik hastalıklar, (4) aspirin veya antikoagülan tedavi, (5) menstrüasyon ve gebelik.
1. EV'den zengin plazmanın izolasyonu
<ol><li>Kan hücrelerini çıkarmak için numuneleri oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 120 x g'da santrifüjleyin. Süpernatant, trombositten zengin plazmadır. Ardından, süpernatantın üst 1/2'sini bir pipetle yeni bir santrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>Trombositleri çıkarmak için trombositten zengin plazmayı oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 1500 x g'da santrifüjleyin. Süpernatant, trombositten fakir plazmadır. Ardından süpernatantın üst 1/2'sini yeni bir santrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>Hücre kalıntılarını gidermek için trombositten fakir plazmayı oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 13000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatant, EV açısından zengin plazmadır. Ardından, süpernatantın üst 1/2'sini sonraki testler için yeni bir santrifüj tüpüne aktarın.</li>
</ol>2. Analizör tarafından numunenin EV-ACT'sinin tespiti
<ol><li>Pıhtı analizörünü açın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve cihazı önceden 37 °C'ye ısıtın. Tek kullanımlık probu ve test kabını takın, ardından makinenin kalite kontrol prosedürünü başlatın. NOT: Ekrandaki viskoz direnç sinyal değeri düz bir çizgi olarak görüntülendiğinde, algılamaya müdahale edilmediği ve analizör durumunun kalite kontrolünün kalifiye olduğu anlamına gelir. Test prosedürü, kendi kendine test onaylandıktan sonra başlatılabilir.</li>
	<li>Örnek bilgileri sisteme girin. Ardından, 200 μL EV açısından zengin plazmayı test kabına aktarın, ardından 20 mM 170 μL kalsiyum klorür ekleyin. Başlat düğmesine tıklayın. Test kabındaki manyetik karıştırma çubuğu, numuneyi ve kalsiyum klorürü tamamen karıştıracaktır. Kapağı kapatın ve prob numune direncindeki değişikliği algılamaya başlayacaktır. NOT: Test bittikten sonra, analizör otomatik olarak "test tamamlandı" uyarısı verecektir. EV-ACT'nin zamanı sistem tarafından görüntülenir ve kaydedilir. Sonuç, "saniye" zaman birimi cinsinden ifade edilir. Probu atın ve kabı test edin.</li>
</ol>3. EV'den zengin plazma numunesinin akış sitometrisine dayalı kalite kontrolü
<ol><li>EV'ler ilk olarak boyutlarına göre tanımlandı (0.1-1 μm). Akış sitometresinin parametrelerini önceden ayarlayın ve piyasada bulunan polistiren boncukları (0.5, 0.9 ve 3.0 μm) kullanarak EV'nin " kapısını" ayarlayın (bkz. NOT: Boncuk karışımı, mikro-parçacıkların (0,5 ve 0,9 μm) ve trombositlerin (0,9 μm ve 3 μm) boyut aralığını kapsayan farklı çaplarda floresan kürelerden oluşur.</li>
	<li>İleri Saçılma ve Yan Saçılma voltajını ayarlayın ve 0,9 μm mikro küreciklerin uygun bölgeye düştüğünden emin olun. EV bölgesi, mikrokürenin çapına göre çizilebilir.</li>
	<li>50 μL EV bakımından zengin plazmayı akış tüpüne aktarın, ardından 450 μL filtrelenmiş fosfat tampon salin ekleyin. Sıvıyı akış borusunda iyice karıştırın. Son olarak, akış sitometrisi25 kullanarak örnekleri tespit edin.</li>
	<li>Kısa EVs.In sayısını ölçmek için Ultra Gökkuşağı Floresan Parçacıklarını ( Malzeme Tablosuna bakın) kullanın, akış algılamadan önce numuneye 10 μL partikül ekleyin ve numune tespiti tamamlandıktan sonra aşağıdaki formülü kullanarak EV konsantrasyonunu hesaplayın: 10,120 * EV (#) / (mikro boncuklar * hacim) * seyreltme faktörü26.</li>
</ol>

EV'den Zengin Plazmanın Kan Hiperkoagülasyonunun Değerlendirilmesi

<ol>
	<li>Zhang, J., Zhang, F., Dong, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coagulopathy+induced+by+traumatic+brain+injury:+systemic+manifestation+of+a+localized+injury.">Coagulopathy induced by traumatic brain injury: systemic manifestation of a localized injury.</a> Blood. 131 (18), 2001-2006 (2018).</li><li>Han, C., Chen, Y. Y., Dong, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prothrombotic+state+associated+with+preeclampsia.">Prothrombotic state associated with preeclampsia.</a> Current Opinion in Hematology. 28 (5), 323-330 (2021).</li><li>Campello, E., Bosch, F., Simion, C., Spiezia, L., Simioni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+thrombosis+in+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Mechanisms of thrombosis in pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Best Practice &amp; Research Clinical Haematology. 35 (1), 101346 (2022).</li><li>You, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+hypercoagulability+with+thrombelastography+in+patients+with+hip+fracture+receiving+thromboprophylaxis.">Identification of hypercoagulability with thrombelastography in patients with hip fracture receiving thromboprophylaxis.</a> Canadian Journal of Surgery. 64 (3), E324-E329 (2021).</li><li>Shah, R., Patel, T., Freedman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+extracellular+vesicles+in+human+disease.">Circulating extracellular vesicles in human disease.</a> The New England Journal of Medicine. 379 (10), 958-966 (2018).</li><li>Zang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte-derived+microparticles+as+novel+biomarkers+for+the+diagnosis+of+deep+venous+thrombosis+in+trauma+patients.">Hepatocyte-derived microparticles as novel biomarkers for the diagnosis of deep venous thrombosis in trauma patients.</a> Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 29, 10760296231153400 (2023).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annexin+V(-)+and+tissue+factor(+)+microparticles+as+biomarkers+for+predicting+deep+vein+thrombosis+in+patients+after+joint+arthroplasty.">Annexin V(-) and tissue factor(+) microparticles as biomarkers for predicting deep vein thrombosis in patients after joint arthroplasty.</a> Clinica Chimica Acta. 536, 169-179 (2022).</li><li>Wang, C., Yu, C., Novakovic, V. A., Xie, R., Shi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microparticles+in+the+pathogenesis+and+early+anticoagulation+of+thrombosis+in+COVID-19+with+kidney+injury.">Circulating microparticles in the pathogenesis and early anticoagulation of thrombosis in COVID-19 with kidney injury.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 784505 (2021).</li><li>Lacroix, R., Dubois, C., Leroyer, A. S., Sabatier, F., Dignat-George, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisited+role+of+microparticles+in+arterial+and+venous+thrombosis.">Revisited role of microparticles in arterial and venous thrombosis.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (Suppl 1), 24-35 (2013).</li><li>Cointe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+microparticle+enumeration+across+different+flow+cytometry+platforms:+results+of+a+multicenter+collaborative+workshop.">Standardization of microparticle enumeration across different flow cytometry platforms: results of a multicenter collaborative workshop.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 15 (1), 187-193 (2017).</li><li>Ayers, L., Harrison, P., Kohler, M., Ferry, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procoagulant+and+platelet-derived+microvesicle+absolute+counts+determined+by+flow+cytometry+correlates+with+a+measurement+of+their+functional+capacity.">Procoagulant and platelet-derived microvesicle absolute counts determined by flow cytometry correlates with a measurement of their functional capacity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 25348 (2014).</li><li>Mooberry, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procoagulant+microparticles+promote+coagulation+in+a+factor+XI-dependent+manner+in+human+endotoxemia.">Procoagulant microparticles promote coagulation in a factor XI-dependent manner in human endotoxemia.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (5), 1031-1042 (2016).</li><li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+microparticles+and+pathophysiology+of+traumatic+brain+injury.">Cellular microparticles and pathophysiology of traumatic brain injury.</a> Protein &amp; Cell. 8 (11), 801-810 (2017).</li><li>Bolliger, D., Tanaka, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point-of-care+coagulation+testing+in+cardiac+surgery.">Point-of-care coagulation testing in cardiac surgery.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 43 (4), 386-396 (2017).</li><li>Ganter, M. T., Hofer, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coagulation+monitoring:+current+techniques+and+clinical+use+of+viscoelastic+point-of-care+coagulation+devices.">Coagulation monitoring: current techniques and clinical use of viscoelastic point-of-care coagulation devices.</a> Anesthesia &amp; Analgesia. 106 (5), 1366-1375 (2008).</li><li>Samuelson, B. T., Cuker, A., Siegal, D. M., Crowther, M., Garcia, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+assessment+of+the+anticoagulant+activity+of+direct+oral+anticoagulants:+a+systematic+review.">Laboratory assessment of the anticoagulant activity of direct oral anticoagulants: a systematic review.</a> Chest. 151 (1), 127-138 (2017).</li><li>Maier, C. L., Sniecinski, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anticoagulation+monitoring+for+perioperative+physicians.">Anticoagulation monitoring for perioperative physicians.</a> Anesthesiology. 135 (4), 738-748 (2021).</li><li>Tuktamyshov, R., Zhdanov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+method+of+in+vivo+evaluation+of+hemostasis:+Spatial+thrombodynamics.">The method of in vivo evaluation of hemostasis: Spatial thrombodynamics.</a> Hematology. 20 (10), 584-586 (2015).</li><li>Tsantes, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+coagulation+activity+in+hip+fracture+patients:+A+case-control+study+using+rotational+thromboelastometry.">Higher coagulation activity in hip fracture patients: A case-control study using rotational thromboelastometry.</a> International Journal of Laboratory Hematology. 43 (3), 477-484 (2021).</li><li>Premkumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COVID-19-related+dynamic+coagulation+disturbances+and+anticoagulation+strategies+using+conventional+D-dimer+and+point-of-care+Sonoclot+tests:+a+prospective+cohort+study.">COVID-19-related dynamic coagulation disturbances and anticoagulation strategies using conventional D-dimer and point-of-care Sonoclot tests: a prospective cohort study.</a> BMJ Open. 12 (5), e051971 (2022).</li><li>Sakai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+thromboelastography+and+thromboelastometry.">Comparison between thromboelastography and thromboelastometry.</a> Minerva Anestesiologica. 85 (12), 1346-1356 (2019).</li><li>Yan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TMEM16F+mediated+phosphatidylserine+exposure+and+microparticle+release+on+erythrocyte+contribute+to+hypercoagulable+state+in+hyperuricemia.">TMEM16F mediated phosphatidylserine exposure and microparticle release on erythrocyte contribute to hypercoagulable state in hyperuricemia.</a> Blood Cells, Molecules and Diseases. 96, 102666 (2022).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperuricemia+enhances+procoagulant+activity+of+vascular+endothelial+cells+through+TMEM16F+regulated+phosphatidylserine+exposure+and+microparticle+release.">Hyperuricemia enhances procoagulant activity of vascular endothelial cells through TMEM16F regulated phosphatidylserine exposure and microparticle release.</a> The FASEB Journal. 35 (9), e21808 (2021).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MPs-ACT,+an+assay+to+evaluate+the+procoagulant+activity+of+microparticles.">MPs-ACT, an assay to evaluate the procoagulant activity of microparticles.</a> Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 29, 10760296231159374 (2023).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-derived+extracellular+vesicles+induce+vasoconstriction+and+reduce+cerebral+blood+flow+in+mice.">Brain-derived extracellular vesicles induce vasoconstriction and reduce cerebral blood flow in mice.</a> Journal of Neurotrauma. 39 (11-12), 879-890 (2022).</li><li>Tan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+circulating+microvesicles+levels+and+effects+of+associated+factors+in+elderly+patients+with+obstructive+sleep+apnea.">Analysis of circulating microvesicles levels and effects of associated factors in elderly patients with obstructive sleep apnea.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 13, 609282 (2021).</li><li>Kubo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+lung+disease.">Extracellular vesicles in lung disease.</a> Chest. 153 (1), 210-216 (2018).</li><li>Gilani, S. I., Weissgerber, T. L., Garovic, V. D., Jayachandran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preeclampsia+and+Extracellular+Vesicles.">Preeclampsia and Extracellular Vesicles.</a> Current Hypertension Reports. 18 (9), 68 (2016).</li><li>Pourakbari, R., Khodadadi, M., Aghebati-Maleki, A., Aghebati-Maleki, L., Yousefi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+exosomes+in+the+therapy+of+the+cartilage+and+bone+complications;+emphasis+on+osteoarthritis.">The potential of exosomes in the therapy of the cartilage and bone complications; emphasis on osteoarthritis.</a> Life Science. 236, 116861 (2019).</li><li>Shi, J., Gilbert, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactadherin+inhibits+enzyme+complexes+of+blood+coagulation+by+competing+for+phospholipid-binding+sites.">Lactadherin inhibits enzyme complexes of blood coagulation by competing for phospholipid-binding sites.</a> Blood. 101 (7), 2628-2636 (2003).</li><li>Dasgupta, S. K., Le, A., Chavakis, T., Rumbaut, R. E., Thiagarajan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+endothelial+locus-1+(Del-1)+mediates+clearance+of+platelet+microparticles+by+the+endothelium.">Developmental endothelial locus-1 (Del-1) mediates clearance of platelet microparticles by the endothelium.</a> Circulation. 125 (13), 1664-1672 (2012).</li><li>Frey, B., Gaipl, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+functions+of+phosphatidylserine+in+membranes+of+dying+cells+and+microvesicles.">The immune functions of phosphatidylserine in membranes of dying cells and microvesicles.</a> Seminars in Immunopathology. 33 (5), 497-516 (2011).</li><li>Rikkert, L. G., Coumans, F. A. W., Hau, C. M., Terstappen, L., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+removal+by+single-step+centrifugation.">Platelet removal by single-step centrifugation.</a> Platelets. 32 (4), 440-443 (2021).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+placenta-derived+extracellular+vesicles+with+pre-eclampsia+and+associated+hypercoagulability:+a+clinical+observational+study.">Association of placenta-derived extracellular vesicles with pre-eclampsia and associated hypercoagulability: a clinical observational study.</a> BJOG. 128 (6), 1037-1046 (2021).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+applications+of+microparticles+in+the+diagnosis,+treatment,+and+prognosis+of+lung+cancer.">The potential applications of microparticles in the diagnosis, treatment, and prognosis of lung cancer.</a> Journal of Translational Medicine. 20 (1), 404 (2022).</li><li>Piwkham, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+red+blood+cell+microvesiculation+exerts+procoagulant+activity+of+blood+cell+storage+in+Southeast+Asian+ovalocytosis.">The in vitro red blood cell microvesiculation exerts procoagulant activity of blood cell storage in Southeast Asian ovalocytosis.</a> Heliyon. 9 (1), e12714 (2023).</li><li>Patil, R., Ghosh, K., Shetty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+clot+based+assay+for+detection+of+procoagulant+cell-derived+microparticles.">A simple clot based assay for detection of procoagulant cell-derived microparticles.</a> Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 54 (5), 799-803 (2016).</li></ol>

Tüm yazarlar potansiyel bir çıkar çatışması olmadığını beyan etmişlerdir.

Bu çalışmada, EV'den zengin plazmanın hazırlanması tarif edildi ve yöntemin rasyonalitesi akış sitometrisi kullanılarak doğrulandı. Daha sonra, rekalsifiye plazma örnekleri, viskoelastisite ilkelerine dayalı bir pıhtı analizörü kullanılarak ACT süresi için analiz edildi24. Şekil 3A'da gösterildiği gibi, ultrasantrifüjleme yoluyla elde edilen EV'lerin konsantrasyonunun EV-ACT süresini kısalttığı, ultrasantrifüjlemeden sonra EV seviyelerin...

Hiper pıhtılaşmanın neden olduğu tromboz, beyin travması1, preeklampsi2, tümörler3 ve kırık hastaları4 dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarda önemli bir rol oynar. Hiper pıhtılaşmanın altında yatan mekanizma karmaşıktır ve son zamanlarda pıhtılaşma bozukluklarında hücre dışı veziküllerin (EV) rolüne vurgu yapılmıştır. EV'ler, çapı 10 nm ila 1000 nm arasında değişen, hücre zarından ayrılan iki katmanlı bir yapıya sahip vezikül benzeri cisimlerdir. Başta pıhtılaşma bozuklukları olmak üzere çeşitli hastalık süreçleriyle ilişkilidirler5. Birkaç çalışma, EV'leri tromboz riskinin umut verici bir belirleyicisi olarak tanımlamıştır 6,7. EV'lerin prokoagülan aktivitesi, başta doku faktörü (TF) ve fosfatidilserin (PS) olmak üzere pıhtılaşma faktörlerinin ekspresyonuna bağlıdır. Güçlü prokoagülan aktiviteye sahip EV'ler, tenaz ve protrombin kompleksinin katalitik etkinliğini önemli ölçüde arttırır, böylece trombin aracılı fibrinojen ve lokal trombozuteşvik eder 8. Çok sayıda hastalıkta yüksek EV seviyeleri ve bunların hiper pıhtılaşma ile nedensel ilişkisi gözlenmiştir9. Sonuç olarak, EV'lerin tespitinin standartlaştırılması ve prokoagülan aktivitelerinin raporlanması önemli bir araştırma alanıdır10.
Bugüne kadar, EV'lerin prokoagülan aktivitesini tespit etmek için sadece birkaç ticari kit mevcuttur. Ticari bir şirket tarafından üretilen MP-Aktivite testi ve MP-TF testi, EV'nin plazma11'deki prokoagülan aktivitesini ölçmek için kullanılan fonksiyonel testlerdir. Bu testler, EV'lerde PS ve TF'yi tespit etmek için enzime bağlı immünosorbent testlerine benzer bir prensip kullanır. Bununla birlikte, bu kitler pahalıdır ve birkaç üst düzey araştırma kurumuyla sınırlıdır. Süreç karmaşık ve zaman alıcıdır, bu da bunları klinik ortamlarda uygulamayı zorlaştırır. Ek olarak, ticari olarak geliştirilmiş bir prokoagülan fosfolipid (PPL) testi, PS pozitif EV'lerin12 seviyelerini kantitatif olarak tespit etmek için pıhtılaşma süresini ölçerek, PS içermeyen plazmayı test plazması ile karıştırır. Bununla birlikte, bu tahliller öncelikle EV'lerde PS ve TF'ye odaklanır ve dolaşımdaki EV'lerin12'de yer alabileceği diğer pıhtılaşma yollarını gözden kaçırır.
Plazma pıhtılaşma sistemi karmaşıktır ve pıhtılaştırıcılar, antikoagülanlar, fibrinolitik sistemler ve plazmada asılı EV'ler dahil olmak üzere hem "görünmez" hem de "görünür" bileşenleri içerir. Fizyolojik olarak, bu bileşenler dinamik bir denge sağlar. Patolojik durumlarda, dolaşımdaki önemli ölçüde artmış EV'ler, özellikle beyin travması, preeklampsi, kırık ve çeşitli kanser türleri olan hastalarda hiper pıhtılaşmaya katkıda bulunur13. Günümüzde klinik laboratuvarlarda pıhtılaşma durumunun değerlendirilmesi öncelikle pıhtılaşma sisteminin, antikoagülasyon sisteminin ve fibrinolizin değerlendirilmesini içermektedir 14,15,16,17. Protrombin zamanı, aktive parsiyel tromboplastin zamanı, trombin zamanı ve uluslararası normalleştirilmiş oran, pıhtılaşma sistemindeki pıhtılaşma faktörü düzeylerini değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır18. Ancak son zamanlarda yapılan çalışmalar, bu testlerin bazı hastalıkların hiper pıhtılaşabilirliğini tam olarak yansıtmadığını ortaya koymuştur19. Tromboelastometri (TEG), rotasyonel TEG ve Sonoklot analizi gibi diğer tahlil yöntemleri, tam kan viskoelastik değişikliklerini ölçer20,21. Tam kan örnekleri çok sayıda kan hücresi ve trombosit içerdiğinden, bu testlerin bir bütün olarak numunenin pıhtılaşma durumunu gösterme olasılığı daha yüksektir. Bazı araştırmacılar prokoagülan aktivitede kan hücrelerinin ve trombositlerin rolü hakkında rapor vermişlerdir 22,23. Yakın zamanda yapılan bir çalışma, önceki pıhtılaşma fonksiyon testlerinin mikropartiküllerin prokoagülan aktivitesindeki değişiklikleri tespit etmede zorluklarla karşılaştığını da keşfetti24. Bu nedenle, EV'lerin prokoagülan fonksiyonunun, EV'den zengin plazmada aktive edilmiş pıhtılaşma süresinin (ACT) viskoelastik ölçümleri ile değerlendirilebileceğine dair bir hipotez öne sürülmüştür.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AccuCount Ultra Rainbow Fluorescent Particles</td>
			<td>3.8 microm; Spherotech, Lake Forest, IL, USA</td>
			<td></td>
			<td>For quantitative detection of MP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Werfen (china)</td>
			<td>0020006800</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Century Clot analyzer</td>
			<td>Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td>The principle is to measure plasma viscosity by viscoelastic method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable probe and test cup</td>
			<td>Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSR Fortessa flow cytometer</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td></td>
			<td>Used to detect MP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megamix polystyrene beads</td>
			<td>Biocytex, Marseille, France</td>
			<td>7801</td>
			<td>The Megamix consists of a mixture of microbeads of selected diameters: 0.5 &#181;m, 0.9 &#181;m and 3 &#181;m.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of the procoagulant activity of extracellular vesicle (ev) using ev-activated clotting time (ev-act)

Hücre dışı veziküllerin (EV) çeşitli hastalıklardaki rolü, özellikle güçlü prokoagülan aktiviteleri nedeniyle artan bir ilgi görmektedir. Bununla birlikte, klinik ortamlarda EV'nin prokoagülan aktivitesini değerlendirmek için acil bir yatak başı testine ihtiyaç vardır. Bu çalışma, EV'nin prokoagülan aktivitesinin bir ölçüsü olarak EV'den zengin plazmanın trombin aktivasyon zamanının kullanılmasını önermektedir. Sodyum sitratlı tam kan elde etmek için standartlaştırılmış prosedürler kullanıldı, ardından EV'den zengin plazma elde etmek için diferansiyel santrifüjleme yapıldı. EV bakımından zengin plazma ve kalsiyum klorür test kabına eklendi ve viskoelastisitedeki değişiklikler bir analizör kullanılarak gerçek zamanlı olarak izlendi. EV-ACT olarak adlandırılan EV'den zengin plazmanın doğal pıhtılaşma süresi belirlendi. Sonuçlar, sağlıklı gönüllülerden elde edilen plazmadan EV çıkarıldığında EV-ACT'de önemli bir artış olduğunu ortaya koyarken, EV zenginleştirildiğinde önemli ölçüde azaldığını ortaya koydu. Ayrıca, preeklampsi, kalça kırığı ve akciğer kanserinden alınan insan örneklerinde EV-ACT önemli ölçüde kısaldı, bu da plazma EV seviyelerinin yükseldiğini ve kan hiperkoagülasyonunun desteklendiğini gösterdi. Basit ve hızlı prosedürü ile EV-ACT, yüksek plazma EV düzeyleri olan hastalarda pıhtılaşma fonksiyonunu değerlendirmek için bir yatak başı testi olarak umut vaat etmektedir.

Thrombosis, which is caused by hypercoagulability, plays a significant role in various diseases, including brain trauma1, pre-eclampsia2, tumors3, and fracture patients4. The mechanism underlying hypercoagulability is complex, and recent emphasis has been placed on the role of extracellular vesicles (EV) in coagulation disorders. EVs are vesicle-like bodies with a bilayer structure that detach from the cell membrane, ranging in diameter from 10 nm to 1000 nm. They are associated with a variety of disease processes, particularly coagulation disorders5. Several studies have identified EVs as a promising predictor of thrombosis risk6,7. The procoagulant activity of EVs depends on the expression of coagulation factors, primarily tissue factor (TF) and phosphatidylserine (PS). EVs with robust procoagulant activity significantly enhance the catalytic efficiency of tenase and prothrombin complex, thereby promoting thrombin-mediated fibrinogen and local thrombosis8. Elevated levels of EVs and their causal relationship with hypercoagulability have been observed in numerous diseases9. Consequently, standardizing the detection of EVs and reporting their procoagulant activity is an important area of investigation10.
To date, only a few commercial kits are available for detecting the procoagulant activity of EVs. The MP-Activity assay and the MP-TF assay, produced by a commercial company, are functional assays used to measure EV&#39;s procoagulant activity in plasma11. These assays employ a principle similar to that of enzyme-linked immunosorbent assays to detect PS and TF on EVs. However, these kits are expensive and limited to a few high-level research institutions. The process is complex and time-consuming, making it challenging to implement them in clinical settings. Additionally, a commercially developed procoagulant phospholipid (PPL) assay mixes PS-free plasma with test plasma, measuring clotting time to quantitatively detect levels of PS-positive EVs12. However, these assays primarily focus on PS and TF on EVs, overlooking other clotting pathways that circulating EVs may be involved in12.
The plasma coagulation system is intricate and comprises both &#34;invisible&#34; and &#34;visible&#34; components, including coagulants, anticoagulants, fibrinolytic systems, and EVs suspended in the plasma. Physiologically, these components maintain a dynamic balance. In pathological conditions, significantly increased EVs in circulation contribute to hypercoagulability, particularly in patients with brain trauma, preeclampsia, fractures, and various types of cancer13. Currently, the evaluation of coagulation status in clinical laboratories primarily involves assessing the coagulation system, anticoagulation system, and fibrinolysis14,15,16,17. Prothrombin time, activated partial thromboplastin time, thrombin time, and international normalized ratio are commonly used to evaluate coagulation factor levels in the coagulation system18. However, recent studies have revealed that these tests do not fully reflect the hypercoagulability of certain diseases19. Other assay methods, such as thromboelastometry (TEG), rotational TEG, and Sonoclot analysis, measure whole-blood viscoelastic changes20,21. Since whole blood samples contain numerous blood cells and platelets, these tests are more likely to indicate the clotting status of the sample as a whole. Some researchers have reported on the role of blood cells and platelets in procoagulant activity22,23. A recent study also discovered that previous coagulation function tests face difficulties in detecting changes in microparticles&#39; procoagulant activity24. Therefore, a hypothesis has been proposed that the procoagulant function of EVs can be evaluated by viscoelastic measurements of the activated clotting time (ACT) in EV-rich plasma.

Yazar Spotlight: Travmatik Beyin Hasarı Hastalarında Pıhtılaşma Bozukluklarının Deşifre Edilmesi 

EV ile Aktive Edilen Pıhtılaşma Süresi (EV-ACT) Kullanılarak Hücre Dışı Vezikülün (EV) Prokoagülan Aktivitesinin Belirlenmesi

Our primary focus is on coagulation disorders in patients who have suffered brain trauma. In this study, we try to monitor changes in the clotting function with extracellular vesical activity clotting time. Our teams put attention on the research of brain injury.And in the brain injury, they are a severe condition we call the hyper coagulated state. It's very difficult to measure. And we find in the blood of patient there are some micro vesicle we called extracellular vesicles, including the apoptosis body, micro vesicle, and exosome.And they are different in the pro coagulated ability. So we must find a method to measure the ability. And this method, we can acute quickly to find the difference of the extracellular vesicles.That's very important. Depend on this measure, we can do many things. We have make sure it in the TPI mice, and the clinical patient, especially in the peripheral circulation, it will cost some embolization.That is very, very serious in the clinical. Our protocol offered a significant advantage compared to other techniques due to its simplicity, cost effectiveness, and speed. It allows for a blood clotting test to be conducted at the bedside, eliminating the need for extensive laboratory processing.Our research have established a new method that can measure the hyper coagulated states of the peripheral blood. It can be used not only in the TPI, we can also used in other disease such as sepsis, pre-eclampsia, tumor, and hematology disease. In the future, we have planned to investigated the of in scanning for clinical hyper a condition that increases the risk of blood clot.

EV'den zengin plazmanın trombin aktivasyon süresi, plazma pıhtılaşma süresi ölçümü için viskoelastik yöntem analizörü kullanılarak ölçüldü. Makine dört ana bileşenden oluşur: bir elektronik sinyal dönüştürücü, bir prob, bir algılama tankı ve bir ısıtma elemanı (Şekil 1A,B). Prob, plazma viskozitesindeki değişiklikleri tespit etmek için yüksek frekanslı ve düşük genlikli salınımlar kullanır. Günlük kalite kontrolü, öncelikle te...

Watch this Scientific Journal Video about Deciphering Coagulation Disorders in Traumatic Brain Injury Patients at JoVE.com

Bu protokol, EV'nin pıhtılaşma yeteneğinin bir göstergesi olarak hücre dışı vezikülden (EV) zengin plazmanın kullanımını araştırır. EV'den zengin plazma, diferansiyel santrifüjleme ve ardından yeniden kalsifikasyon işlemi ile elde edilir.

The role of extracellular vesicles (EV) in various diseases is gaining increased attention, particularly due to their potent procoagulant activity. ...

Öncelikli odak noktamız beyin travması geçirmiş hastalarda pıhtılaşma bozukluklarıdır. Bu çalışmada hücre dışı vezikal aktivite pıhtılaşma süresi ile pıhtılaşma fonksiyonundaki değişiklikleri izlemeye çalıştık. Ekiplerimiz beyin hasarı araştırmalarına dikkat çekiyor.Ve beyin hasarında, hiper pıhtılaşma durumu dediğimiz ciddi bir durumdur. Ölçmek çok zor. Ve hastanın kanında hücre dışı vezikül dediğimiz bazı mikro veziküller olduğunu görüyoruz, bunlar arasında apoptoz cisimciği, mikro vezikül ve eksozom da var.Ve pıhtılaşma yeteneğinde farklıdırlar. Bu yüzden yeteneği ölçmek için bir yöntem bulmalıyız. Ve bu yöntemle, hücre dışı veziküllerin farkını bulmak için hızlı bir şekilde akut yapabiliriz.Bu çok önemli. Bu ölçüye bağlı olarak, birçok şey yapabiliriz. TPI farelerinde ve klinik hastada, özellikle periferik dolaşımda, bir miktar embolizasyona mal olacağından emin olduk.Bu klinikte çok, çok ciddi. Protokolümüz, basitliği, maliyet etkinliği ve hızı nedeniyle diğer tekniklere kıyasla önemli bir avantaj sağladı. Yatak başında kan pıhtılaşma testinin yapılmasına izin vererek, kapsamlı laboratuvar işlemlerine olan ihtiyacı ortadan kaldırır.Araştırmamız, periferik kanın hiper pıhtılaşmış durumlarını ölçebilen yeni bir yöntem oluşturmuştur. Sadece TPI'da değil, sepsis, preeklampsi, tümör ve hematoloji hastalığı gibi diğer hastalıklarda da kullanılabilir. Gelecekte, kan pıhtılaşması riskini artıran bir durum olan klinik hiper taramasını araştırmayı planladık.

determination-procoagulant-activity-extracellular-vesicle-ev-using-ev

Research

JoVE Journal

Medicine

Determination of the Procoagulant Activity of Extracellular Vesicle (EV) Using EV-Activated Clotting Time (EV-ACT)

546 Görüntüleme.  Tianjin Medical University General Hospital. Öncelikli odak noktamız beyin travması geçirmiş hastalarda pıhtılaşma bozukluklarıdır. Bu çalışmada hücre dışı vezikal aktivite pıhtılaşma süresi ile pıhtılaşma fonksiyonundaki değişiklikleri izlemeye çalıştık. Ekiplerimiz beyin hasarı araştırmalarına dikkat çekiyor.Ve beyin hasarında, hiper pıhtılaşma durumu dediğimiz ciddi bir durumdur. Ölçmek çok zor. Ve hastanın kanında hücre dışı vezikül dediğimiz bazı mikro veziküller olduğunu...

Video: Yazar Spotlight: Travmatik Beyin Hasarı Hastalarında Pıhtılaşma Bozukluklarının Deşifre Edilmesi 

The role of extracellular vesicles (EV) in various diseases is gaining increased attention, particularly due to their potent procoagulant activity. However, there is an urgent need for a bedside test to assess the procoagulant activity of EV in clinical settings. This study proposes the use of thrombin activation time of EV-rich plasma as a measure of EV's procoagulant activity. Standardized procedures were employed to obtain sodium-citrated whole blood, followed by differential centrifugation to obtain EV-rich plasma. The EV-rich plasma and calcium chloride were added to the test cup, and the changes in viscoelasticity were monitored in real-time using an analyzer. The natural coagulation time of EV-rich plasma, referred to as EV-ACT, was determined. The results revealed a significant increase in EV-ACT when EV was removed from plasma obtained from healthy volunteers, while it significantly decreased when EV was enriched. Furthermore, EV-ACT was considerably shortened in human samples from preeclampsia, hip fracture, and lung cancer, indicating elevated levels of plasma EV and promotion of blood hypercoagulation. With its simple and rapid procedure, EV-ACT shows promise as a bedside test for evaluating coagulation function in patients with high plasma EV levels.

This protocol investigates the use of extracellular vesicle (EV)-rich plasma as an indicator of the coagulative ability of EV. EV-rich plasma is obtained through a process of differential centrifugation and subsequent recalcification.

Tıp

Isolation of Extracellular Vesicle (EV)-Rich Plasma from Human Blood and Detection of Activated Clotting Time 

To begin, centrifuge the human blood at 120 G for 20 minutes at room temperature to remove the blood cells. Then transfer the upper half of the supernatant to a new tube. Next, centrifuge the platelet rich plasma to remove the platelets, and transfer the upper half of the supernatant to a new tube.Then remove the cell debris by centrifuging the platelet to our plasma at 13, 000 G for two minutes. Transfer the upper half of the supernatant to a new tube. Turn on the clot analyzer to detect extracellular vesicle, or EV activated clotting time, and preheat the instrument to 37 degrees Celsius.Install the disposable probe and test cup. Then start the quality control procedure of the machine. After the quality control run, enter sample information into the system.Then add 200 microliters of EV-rich plasma to the test cup, followed by 20 millimolar, 170 microliters of calcium chloride. Click the start button, close the cover, and allow the probe to detect the change in sample resistance. The unqualified EV samples exhibit a distinct cluster with a slightly larger particle size near the gate of EV.In contrast, qualified EV-rich samples showed most signals within the gate of EV as a single group.An increase in EV concentration shortened EV activated clotting time, while a decrease in EV concentration prolonged EV activated clotting time. EV-rich plasma samples from patients with preeclampsia, hip fractures, and lung cancer had significantly shorter EV activated clotting time compared to healthy volunteers.