PhenoImager HT נרכש באמצעות מימון שסופק על ידי המרכז הרפואי האוניברסיטאי Radboud והמרכז הטכנולוגי Radboud למיקרוסקופיה. CF נתמך כספית על ידי מענק האגודה ההולנדית לסרטן (10673) ומענק ERC Adv ARTimmune (834618). JT נתמכת כספית על ידי מענק NWO Vidi (VI.Vidi.192.084). המחברים רוצים להודות לאריק ואן דינתר ואנקור אנקן על עזרתם ביצירת זרימות עבודה לאחסון נתוני IHC מרובים ובנגט פונג מודה על ההוראות כיצד ליישם נתוני IHC מרובים ב- QuPath לציור ROI.

מיפוי הנוף החיסוני של הגידול: פרוטוקול ניתוח IHC מולטיפלקס מעמיק

<ol>
	<li>Dunn, G. P., Bruce, A. T., Ikeda, H., Old, L. J., Schreiber, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunoediting:+from+immunosurveillance+to+tumor+escape.">Cancer immunoediting: from immunosurveillance to tumor escape.</a> Nature Immunology. 3 (11), 991-998 (2002).</li><li>van der Woude, L. L., Gorris, M. A. J., Halilovic, A., Figdor, C. G., de Vries, I. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migrating+into+the+tumor:+a+roadmap+for+T+cells.">Migrating into the tumor: a roadmap for T cells.</a> Trends in Cancer. 3 (11), 797-808 (2017).</li><li>Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+contexture+in+human+tumours:+impact+on+clinical+outcome.">The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome.</a> Nature Reviews. Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).</li><li>Fridman, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+microenvironment+of+human+tumors:+general+significance+and+clinical+impact.">The immune microenvironment of human tumors: general significance and clinical impact.</a> Cancer Microenvironment. 6 (2), 117-122 (2013).</li><li>Pages, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+validation+of+the+consensus+Immunoscore+for+the+classification+of+colon+cancer:+a+prognostic+and+accuracy+study.">International validation of the consensus Immunoscore for the classification of colon cancer: a prognostic and accuracy study.</a> Lancet. 391 (10135), 2128-2139 (2018).</li><li>Angell, H. K., Bruni, D., Barrett, J. C., Herbst, R., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Immunoscore:+colon+cancer+and+beyond.">The Immunoscore: colon cancer and beyond.</a> Clinical Cancer Research. 26 (2), 332-339 (2020).</li><li>Angell, H., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+immune+contexture+to+the+Immunoscore:+the+role+of+prognostic+and+predictive+immune+markers+in+cancer.">From the immune contexture to the Immunoscore: the role of prognostic and predictive immune markers in cancer.</a> Current Opinion in Immunology. 25 (2), 261-267 (2013).</li><li>Galon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+classification+using+the+Immunoscore:+a+worldwide+task+force.">Cancer classification using the Immunoscore: a worldwide task force.</a> Journal of Translational Medicine. 10, 205 (2012).</li><li>Galon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=World-wide+Immunoscore+Task+Force:+meeting+report+from+the+34;Melanoma+Bridge&amp;#34,+Napoli,+November+30th-December+3rd,+2016.">World-wide Immunoscore Task Force: meeting report from the 34;Melanoma Bridge&amp;#34, Napoli, November 30th-December 3rd, 2016.</a> Journal of Translational Medicine. 15 (1), 212 (2017).</li><li>Tumeh, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+blockade+induces+responses+by+inhibiting+adaptive+immune+resistance.">PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance.</a> Nature. 515 (7528), 568-571 (2014).</li><li>Creemers, J. H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tipping+point+in+cancer-immune+dynamics+leads+to+divergent+immunotherapy+responses+and+hampers+biomarker+discovery.">A tipping point in cancer-immune dynamics leads to divergent immunotherapy responses and hampers biomarker discovery.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002032 (2021).</li><li>Blank, C. U., Haanen, J. B., Ribas, A., Schumacher, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CANCER+IMMUNOLOGY.+The+&amp;#34;cancer+immunogram&amp;#34;.">CANCER IMMUNOLOGY. The &amp;#34;cancer immunogram&amp;#34;.</a> Science. 352 (6286), 658-660 (2016).</li><li>Teruya-Feldstein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunohistochemistry+laboratory+looking+at+molecules+and+preparing+for+tomorrow.">The immunohistochemistry laboratory looking at molecules and preparing for tomorrow.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 134 (11), 1659-1665 (2010).</li><li>Ramos-Vara, J. A., Miller, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+tissue+antigens+and+antibodies+get+along:+revisiting+the+technical+aspects+of+immunohistochemistry--the+red,+brown,+and+blue+technique.">When tissue antigens and antibodies get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry--the red, brown, and blue technique.</a> Veterinary Pathology. 51 (1), 42-87 (2014).</li><li>Hegde, P. S., Karanikas, V., Evers, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+where,+the+when,+and+the+how+of+immune+monitoring+for+cancer+immunotherapies+in+the+era+of+checkpoint+inhibition.">The where, the when, and the how of immune monitoring for cancer immunotherapies in the era of checkpoint inhibition.</a> Clinical Cancer Research. 22 (8), 1865-1874 (2016).</li><li>Parra, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+platforms+of+multiplexed+immunofluorescence+for+study+of+paraffin+tumor+tissues.">Novel platforms of multiplexed immunofluorescence for study of paraffin tumor tissues.</a> Journal of Cancer Treatment and Diagnosis. 2 (1), 43-53 (2018).</li><li>Gorris, M. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eight-color+multiplex+immunohistochemistry+for+simultaneous+detection+of+multiple+immune+checkpoint+molecules+within+the+tumor+microenvironment.">Eight-color multiplex immunohistochemistry for simultaneous detection of multiple immune checkpoint molecules within the tumor microenvironment.</a> Journal of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).</li><li>Roelofsen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+regression+of+ovarian+carcinoma+after+septic+peritonitis;+a+unique+case+report.">Spontaneous regression of ovarian carcinoma after septic peritonitis; a unique case report.</a> Frontiers in Oncology. 8, 562 (2018).</li><li>van den Brand, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide-mediated+delivery+of+therapeutic+mRNA+in+ovarian+cancer.">Peptide-mediated delivery of therapeutic mRNA in ovarian cancer.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 141, 180-190 (2019).</li><li>van den Brand, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EpCAM-binding+DARPins+for+targeted+photodynamic+therapy+of+ovarian+cancer.">EpCAM-binding DARPins for targeted photodynamic therapy of ovarian cancer.</a> Cancers. 12 (7), 1762 (2020).</li><li>Di Blasio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumour+microenvironment+shapes+dendritic+cell+plasticity+in+a+human+organotypic+melanoma+culture.">The tumour microenvironment shapes dendritic cell plasticity in a human organotypic melanoma culture.</a> Nature Communications. 11 (1), 2749 (2020).</li><li>van Beek, J. J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pDCs+are+superior+to+cDC2s+in+attracting+cytolytic+lymphocytes+in+melanoma+patients+receiving+DC+vaccination.">Human pDCs are superior to cDC2s in attracting cytolytic lymphocytes in melanoma patients receiving DC vaccination.</a> Cell Reports. 30 (4), 1027-1038 (2020).</li><li>Rodriguez-Rosales, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+aged+neutrophils+are+augmented+in+blood+and+skin+of+psoriasis+patients.">Immunomodulatory aged neutrophils are augmented in blood and skin of psoriasis patients.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 148 (4), 1030-1040 (2021).</li><li>Hoeijmakers, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell+composition+in+the+endometrium+of+patients+with+a+complete+molar+pregnancy:+Effects+on+outcome.">Immune cell composition in the endometrium of patients with a complete molar pregnancy: Effects on outcome.</a> Gynecologic Oncology. 160 (2), 450-456 (2021).</li><li>van Ravensteijn, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+and+genomic+analysis+reveals+clinically+relevant+distinctions+between+angiosarcoma+subgroups.">Immunological and genomic analysis reveals clinically relevant distinctions between angiosarcoma subgroups.</a> Cancers. 14 (23), 5938 (2022).</li><li>van der Woude, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+microenvironment+shows+an+immunological+abscopal+effect+in+patients+with+NSCLC+treated+with+pembrolizumab-radiotherapy+combination.">Tumor microenvironment shows an immunological abscopal effect in patients with NSCLC treated with pembrolizumab-radiotherapy combination.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (10), e005248 (2022).</li><li>Graham Martinez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+microenvironment+landscape+shows+treatment-specific+differences+in+rectal+cancer+patients.">The immune microenvironment landscape shows treatment-specific differences in rectal cancer patients.</a> Frontiers in Immunology. 13, 1011498 (2022).</li><li>Cortenbach, K. R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topography+of+immune+cell+infiltration+in+different+stages+of+coronary+atherosclerosis+revealed+by+multiplex+immunohistochemistry.">Topography of immune cell infiltration in different stages of coronary atherosclerosis revealed by multiplex immunohistochemistry.</a> International Journal of Cardiology. Heart &amp; Vasculature. 44, 101111 (2023).</li><li>van Wilpe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+recombination+repair+deficient+prostate+cancer+represents+an+immunologically+distinct+subtype.">Homologous recombination repair deficient prostate cancer represents an immunologically distinct subtype.</a> Oncoimmunology. 11 (1), 2094133 (2022).</li><li>Gorris, M. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired+primary+and+metastatic+lesions+of+patients+with+ipilimumab-treated+melanoma:+high+variation+in+lymphocyte+infiltration+and+HLA-ABC+expression+whereas+tumor+mutational+load+is+similar+and+correlates+with+clinical+outcome.">Paired primary and metastatic lesions of patients with ipilimumab-treated melanoma: high variation in lymphocyte infiltration and HLA-ABC expression whereas tumor mutational load is similar and correlates with clinical outcome.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (5), e004329 (2022).</li><li>van Wilpe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumoral+T+cell+depletion+following+neoadjuvant+chemotherapy+in+patients+with+muscle-invasive+bladder+cancer+is+associated+with+poor+clinical+outcome.">Intratumoral T cell depletion following neoadjuvant chemotherapy in patients with muscle-invasive bladder cancer is associated with poor clinical outcome.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 72 (1), 137-149 (2023).</li><li>Sultan, S., Gorris, M. A. J., Buytenhuijs, F., Lvan de Woude, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Segmentation-free+machine+learning+architecture+for+immune+land-scape+phenotyping+in+solid+tumors+by+multichannel+imaging.">A Segmentation-free machine learning architecture for immune land-scape phenotyping in solid tumors by multichannel imaging.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immuno-profiling+and+cellular+spatial+analysis+using+five+immune+oncology+multiplex+immunofluorescence+panels+for+paraffin+tumor+tissue.">Immuno-profiling and cellular spatial analysis using five immune oncology multiplex immunofluorescence panels for paraffin tumor tissue.</a> Scientific Reports. 11 (1), 8511 (2021).</li><li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+multiplex+immunofluorescence+panels+using+multispectral+microscopy+for+immune-profiling+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+human+tumor+tissues.">Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).</li><li>Sun, Z., Nyberg, R., Wu, Y., Bernard, B., Redmond, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+an+enhanced+7-color+multiplex+IHC+protocol+to+dissect+immune+infiltration+in+human+cancers.">Developing an enhanced 7-color multiplex IHC protocol to dissect immune infiltration in human cancers.</a> PLoS One. 16 (2), e0247238 (2021).</li><li>LeicaBiosystems. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BOND+RX+Fully+Automated+Research+Stainer+Protocols.">BOND RX Fully Automated Research Stainer Protocols.</a> , (2022).</li></ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

ניתוח מרחבי של TME הוא טכניקה מבוקשת כדי ללמוד יותר על תא תאי החיסון ולגלות סמנים ביולוגיים פרוגנוסטיים ומנבאים חדשים, במיוחד בתחום האימונו-אונקולוגיה16. טכניקות רבות ושונות מפותחות למטרה זו, הכוללות זיהוי חלבונים, תעתיקי mRNA, או שילוב של השניים, עם הערכות של עד 100-1,000 מטרות. עם זאת, ריבוב גבוה יותר מגיע במחיר של ניסויים בעלי תפוקה נמוכה יותר, עלויות ניסוי גבוהות יותר ואתגרים טכניים, ולעתים קרובות ניתן לנתח רק חלק קטן מה-TME. Multiplex IHC בשיטה מבוססת TSA שאנו מתארים כאן, מזהה שישה סמנים שונים + DAPI בו זמנית, הוא יחסית זול יותר לביצוע, ומקטעי רקמות שלמים מצולמים תוך פחות מ -20 דקות, מוכנים לניתוח מלא. טכניקה זו הפכה פחות מורכבת עם אוטומציה של הליך הצביעה. שיפורים במיקרוסקופ המולטיספקטרלי, הכוללים תוספת של שני מסננים נוספים, שיפרו מאוד את זמני הערבוב והסריקה הספקטרליים. ניתן לזהות עד שמונה סמנים שונים + DAPI בו זמנית. עם זאת, על ידי הרחבת המרבב עם יותר סמנים, היתרונות הנ"ל נעלמים ככל שהערבוב הספקטרלי הופך למאתגר יותר וזמני הסריקה של שקופיות שלמות גדלים באופן משמעותי. נעשים מאמצים לתקנן IHC מולטיפלקס בין מוסדות שונים כדי להקל על היישום בהגדרת האבחון ביתר קלות. עבור סטנדרטיזציה זו של IHC מולטיפלקס, אנו ממליצים למשתמשים לדבוק בפרוטוקול נגיש יותר עם שישה סמנים שונים + DAPI. עם זאת, עדיין יש צורך בידע טכני לא מבוטל וניתוח במורד הזרם יכול להיות מאתגר, עבורו פיתחנו מתודולוגיות המתוארות בפרוטוקול זה.
התקינה מתחילה בפיתוח פאנל IHC מרובה אולמות. חשיבות הבחירה של נוגדנים ראשוניים המזהים מטרות חלבון מסוימות הודגשה לפניגיל 17. לוחות IHC המולטיפלקס שלנו מפותחים בעיקר עם שיבוטים ראשוניים של נוגדנים המשמשים ומאומתים גם עבור IHC במחלקת האבחון שלנו. עם זאת, במקרה של פאנל IHC מרובה תאים דנדריטיים, רוב הנוגדנים לא שימשו במסגרת האבחון (Van der Hoorn et al., כתב יד בהגשה). כדי להבטיח ספציפיות ולמזער את הבדלי האצווה, בחרנו להשתמש בנוגדנים חד-שבטיים על פני נוגדנים רב-שבטיים וגם תיקפנו את רוב הנוגדנים באמצעות קווי תאים נגועים ותאים ראשוניים. במהלך השנים נעשה שימוש בגרסאות שונות של לוחות IHC מרובי אולמות במחקרים רבים באמצעות מערכת Vectra 3 18,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32. כדי ליישם לוחות IHC מרובים אלה בצורה אופטימלית על מערכת PhenoImager HT, היה צורך לבצע התאמות מסוימות בשילובי נוגדנים ראשוניים ופלואורופורים. כדי ליהנות מפירוק ספקטרלי טוב יותר וזמני סריקה מהירים יותר של חלקי רקמות שלמות, יש צורך ביישום הפלואורופורים העדכניים ביותר של Opal480 ו-Opal780 והימנעות משימוש בפלואורופורים של Opal540 ו-Opal650 בלוחות IHC מרובי צבעים בעלי שבעה צבעים. זמני הסריקה מהירים פי 3-10 בהתאם לגודל קטע הרקמה. התאמות פאנל IHC מרובות היו די קלות להשגה, אך יש לזכור כמה שיקולים. הספקטרום הפלואורסצנטי של Opal480 חופף הרבה עם ספקטרום אוטופלואורסצנטי ולכן, מפריע לערבוב ספקטרלי של אריתרוציטים ומבנים אוטופלואורסצנטיים אחרים. שימוש בריכוז מוגבר של הנוגדן הראשוני בשילוב עם Opal480 פתר בעיה זו ברוב המקרים. היישום של מסנן המיקוד האוטומטי לדוגמה הקנייני על PhenoImager HT מקל על ביטול הערבוב של Opal480 ו autofluorescence. עם זאת, עדיף להשתמש בנוגדן ראשוני המניב אות ברור בעת שימוש עם Opal480, כך שהאות שלו גבוה יותר מאשר autofluorescence.
למרות שלוחות IHC מרובים אלה מבוססים, וריאציה מאצווה לאצווה היא משהו שצריך לקחת בחשבון. על ידי ביצוע בקרות מונופלקס IHC לפני תחילת ניסוי IHC המרובב המלא, ראינו לפעמים כי נוגדנים ראשוניים מתפקדים חזקים או חלשים יותר מניסוי לניסוי. הסיבות לכך יכולות להיות טעויות צנרת, תנאי אחסון ריאגנטים לא אופטימליים וחיי מדף. פתרנו זאת על ידי התאמת תמיסת הנוגדנים הראשונית על סמך הניסיון שלנו. גם כאשר לא היה צורך לבצע אף אחת מההתאמות הנ"ל, בכל ניסוי אצווה של IHC מולטיפלקס, חשוב לקבוע זמני חשיפה בהתבסס על שקופיות בקרה מוכתמות במונופלקס IHC.
מכיוון שהמחקר שלנו התמקד בתחילה בסוגים שונים של קרצינומה ומלנומה, לוחות IHC מרובים נדרשו להיות ניתנים להחלפה בין סוגי גידולים עם התאמות מינימליות. לכן, תמיד כללנו סוגים מרובים של רקמות (גידולים) בתהליך האופטימיזציה וראינו כי דילול נוגדנים ראשוניים לסמנים של תאי מערכת החיסון יכול להישמר דומה בין סוגי גידולים שונים. עם זאת, גילוי רקמת הגידול בין קרצינומה למלנומה דורש סמני גידול שונים. בהתאם לכך, סמן הגידול תמיד הותאם לעבודה בסוף כל פאנל IHC מולטיפלקס וכיום משמש תמיד בשילוב עם אופל780, שבמקרה גם צריך להיות בפלואורופור האחרון בהליך צביעת IHC מולטיפלקס. על ידי שימוש בסמן הגידול בסוף המולטיפלקס IHC, לוחות IHC מרובים אלה יכולים להיות מוחלפים בקלות עבור סוגי גידולים אחרים, כגון גליובלסטומה (כלומר, GFAP) ולימפומה הודג'קין (כלומר, CD30). עבור אנגיוסרקומה, השתמשנו בפאנל IHC מרובה לימפוציטים זה עם גן הקשור לטרנספורמציה אריתרובלסטית ספציפית (ERG) כסמן הגידול עם שני ניסויי אופטימיזציה בלבד25. האופטימיזציה כללה טיטרציה של הנוגדן הראשוני ERG ובדיקת פאנל IHC מולטיפלקס עם ERG בקצהו.
התאמות אחרות ללוחות IHC מרובים אלה יכולות להתבצע גם על ידי החלפת סמן תאי חיסון מסוים בסמן חיסוני או פונקציונלי אחר. כל שינוי דורש אופטימיזציה. ניתן לעקוב אחר פרוטוקול האופטימיזציה כמתואר קודם17. שינויים מסוימים בלוחות IHC המרובבים המוצעים יפריעו לאלגוריתמים של ImmuNet שיצרנו. יש להפיק מספיק נתונים ולהקדיש זמן להטמעת שינויים אלה באלגוריתם (לפחות 750 ביאורים לכל סמן חדש ו/או פנוטיפים של תאים, ו-150 ביאורים לאימות סמנים שאומנו בעבר). הפאנלים המוצגים כאן אינם מכילים סמנים פונקציונליים, אם כי הטמעת סמני בקרה חיסונית כגון PD-1 ו- PD-L1 בלוחות IHC מרובים מתבצעת במעבדה שלנו. עם זאת, ניתוח סמנים שהם פחות בינאריים באותות שליליים וחיוביים הוכח כקשה יותר והוא תחום מחקר פעיל בקבוצה שלנו.
מספר הסמנים שניתן להעריך בו זמנית עם IHC מולטיפלקס מוגבל בהשוואה לטכניקות חדשניות אחרות. בעוד שניתן לעקוף זאת על ידי ניתוח לוחות שונים על פרוסות עוקבות של גוש FFPE, יהיה קשה להשוות פרוסות אלה באופן מרחבי. סביר להניח שהכיוון והממצאים המקופלים אינם זהים לאחר הכנת השקופית. עם זאת, מולטיפלקס IHC נגיש למדי, מה שהופך אותו לכלי אטרקטיבי עבור מוסדות וחוקרים נוספים ולכן מתאים יותר ליישום עתידי במסגרת אבחון. עם הסטנדרטיזציה של לוחות תאי חיסון IHC מרובים עבור סוגי גידולים מרובים וצינורות ניתוח במורד הזרם, ניתן היה לצבור ידע נוסף על הבדלים ב- TME בין חולים וסוגי גידולים. זה יכול, למשל, להוביל לתובנות נוספות לגבי התפקיד של TME בתגובה אנטי-סרטנית לטיפולים ספציפיים. זה עשוי אפילו להצמיח סמנים ביולוגיים חדשים כדי לחזות גורמים כגון תגובה לטיפול והישרדות צפויה. בסך הכל, זה יכול לאפשר למולטיפלקס IHC להפוך לכלי קליני המסייע בקבלת החלטות קליניות, בגישת רפואה מותאמת אישית. אמנם, שלבים נוספים של הליך הניתוח צריכים כנראה להיות אוטומטיים וסטנדרטיים כדי שיהיה אפשרי לשימוש בסביבה אבחנתית יומית, כך שנכון לעכשיו, זו בעיקר פרספקטיבה עתידנית.
ניתוח של סמנים מרובים בשקופית מדגם אחת יכול להיות כלי רב עוצמה למרות האתגרים הטכניים שלו. עם פרוטוקולים ניסיוניים סטנדרטיים ושיטת ניתוח חזקה, כפי שתיארנו כאן באמצעות ImmuNet, הכימות של סמנים מרובים הופך אותו לאינפורמטיבי יותר מאשר IHC קלאסי, בעוד IHC מולטיפלקס נשאר בתפוקה גבוהה יחסית בהשוואה לשיטות ניסוי חדשניות עם plex גבוה יותר.

תאי מערכת החיסון ממלאים תפקיד מכריע בהגנה מפני פתוגנים כגון וירוסים וחיידקים, אך גם מפני תאים סרטניים1. לכן, מערכת החיסון בתוך המיקרו-סביבה של הגידול (TME) טומנת בחובה הבטחה רבה לגילוי סמנים ביולוגיים פרוגנוסטיים ומנבאים2. חדירות תאי מערכת החיסון נמצאו בקורלציה לפרוגנוזה בסוגים שונים של סרטן, אם כי זה עדיין לא יושם בטיפול קליני 3,4. ברוב סוגי הגידולים, מספר גבוה של תאי T ציטוטוקסיים ותאי T עוזר 1 ו/או מספר נמוך של תאי T רגולטוריים קשורים לפרוגנוזות טובות. נמשכים המאמצים לשלב את מה שמכונה "Immunoscore" בבימוי TNM של סרטן המעי הגס, ולהפוך אותו ל-TNM-I בימוי 5,6. ה- Immunoscore נגזר מהמספר הכולל של תאי T (שזוהו עם CD3) ותאי T ציטוטוקסיים (שזוהו עם CD8) בשני אזורי גידול שונים: ליבת הגידול לעומת השוליים הפולשניים (IM) של גידולים. הדירוג החיסוני הוצע גם להיות בעל ערך פרוגנוסטי בסוגי סרטן אחרים, כגון מלנומה, סרטן ריאות וסרטן השד 6,7,8,9. יתר על כן, חדירות תאי מערכת החיסון עשויות גם להיות בקורלציה לתגובה לאימונותרפיה של חסימת נקודות ביקורת10. עם זאת, סמנים ביולוגיים מנבאים אלה חייבים להיות מאומתים במחקרים פרוספקטיביים לפני שניתן יהיה ליישם אותם באופן שגרתי בפרקטיקה קלינית. יתר על כן, הוצע גם כי סמן ביולוגי יחיד לא יספיק לחיזוי משמעותי11. לכן, יצירת מפה מלאה של דגימת חולה על ידי שילוב סמנים ביולוגיים שונים הוצעה כסמן ביולוגי מנבא מקיף יותר במה שמכונה "אימונוגרמה של סרטן"12.
בין השיטות לחקר תאי מערכת החיסון בתוך TME, הטכניקה הוותיקה והידועה ביותר היא אימונוהיסטוכימיה (IHC), המשמשת באופן שגרתי לבדיקות אבחון במספר מחלות, במיוחד סרטן13. טכניקה זו הוגבלה לשימוש בסמן אחד או רק כמה סמנים14 במשך זמן רב, ולכן התחרתה במסגרות מחקר על ידי טכניקות אחרות כגון ציטומטריית זרימה ופרופיל ביטוי גנים (GEP). עם זאת, רקמות הגידול הקבועות בפורמלין ומשובצות פרפין (FFPE) המשמשות בדרך כלל באבחון ומחקר שגרתיים אינן מתאימות (באופן אופטימלי) לציטומטריית זרימה ו- GEP. יתר על כן, למרות GEP וציטומטריית זרימה לספק הרבה תובנה על פנוטיפ התא ותפקוד, חוסר מידע מרחבי הוא חסרון גדול. לכן, הטרוגניות בתוך דגימה, כגון הבדלים באזורים שחדרו לתאי מערכת החיסון לעומת אזורים שאינם נכללים בתאי מערכת החיסון של גידול, עלולה להיעלם15. פלטפורמות חדשניות פותחו לניתוח מולטיפלקס של רקמות FFPE, כגון מולטיפלקס IHC, ציטומטריית מסה של הדמיה וזיהוי CO-Detection על ידי indEXing (CODEX) שניתן להשתמש בהן כדי לזהות סמנים מרובים בו זמנית בתוך קטערקמות 16. תאי מערכת החיסון ב-TME נחקרים באופן נרחב כדי למצוא את הסמנים הביולוגיים הטובים ביותר לאימונותרפיה. עם זאת, טכניקות מולטיפלקס וניתוח תמונה אוטומטי מציבים מכשולים משלהם.
למעבדה שלנו ניסיון רב בצביעת IHC מולטיפלקס בשיטת הגברת אותות אופל/טירמיד (TSA) והפכה זאת לאוטומטי על פלטפורמת IHC (ראה טבלת חומרים)17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28, 29,30,31. יש לנו פאנלים אופטימליים של תאי מערכת החיסון לזיהוי תת-קבוצות שונות של לימפוציטים, תאים מיאלואידים ותאים דנדריטיים (DC). רקמות המכילות אזורים צפופים של תאי מערכת החיסון - עבור לימפוציטים או מורפולוגיות מורכבות של תאים (כלומר, תאים מיאלואידים ו-DC) - מאתגרות במיוחד לניתוח, עם סיכון להערכת יתר או חסר של מספר תאי החיסון הנוכחים. כדי להתגבר על בעיה זו, תוכנת הניתוח ImmuNet פותחה על ידי קבוצה32 שלנו, וצינור למידת מכונה זה שיפר מאוד את איכות הזיהוי של סוגים שונים אלה של תאי חיסון. פרוטוקול מפורט החל מקבלת החומר FFPE ועד לניתוח צפיפות תאי החיסון בתאי רקמה שונים ומרחקים בין סוגי תאי מערכת החיסון מתואר כאן.
פרוטוקול זה מתאר כיצד מבוצעים לוחות IHC מרובים במרכז הרפואי האוניברסיטאי Radboud מאז יישום הדמיית הפתולוגיה הדיגיטלית בשנת 2022. לוחות IHC הרב-תכליתיים המתוארים יכולים לשמש עבור קרצינומות שונות (למשל, ריאות, ערמונית, מעי גס, שלפוחית השתן, שד) עם שימוש בנוגדן pan-cytokeratin כסמן גידול או עבור מלנומה עם שימוש בנוגדנים הקשורים למלנוציטים כסמנים סרטניים. פרוטוקולי IHC מרובים אלה עברו אופטימיזציה קפדנית במונחים של ריכוז נוגדנים ראשוני, שילובים פלואורופוריים ורצף הליך הצביעה. אנו ואחרים תיארנו אופטימיזציה של פאנל IHC מרובה מוקדם יותר 17,33,34,35. ניתן להתאים לוחות IHC מרובים, אך יש להעריך את צינורות הניתוח המתוארים ואולי להתאים אותם או להכשיר אותם בהתאם. פרוטוקולי IHC מרובי הצבעים המתוארים עושים שימוש בפלואורופורים של אופל Opal480, Opal520, Opal570, Opal620, Opal690, Opal780 ו- 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), כך שפירוק קל של ערבוב וסריקה מהירה במכונת ההדמיה מופעלים באמצעות "Multispectral One Touch ImmunoFluorescence" (MOTiF). צביעה וסריקה של תשעה צבעים אינן מתוארות בפרוטוקול זה מכיוון שהדבר דורש כוונון עדין עוד יותר של מערך הניסוי ומצב סריקה נוסף במכונת ההדמיה המשתמשת במסנן הגביש הנוזלי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>anti-CD14</td>
			<td>Cell Marque&#160;</td>
			<td>114R-16</td>
			<td>section 3, clone EPR3653</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD163</td>
			<td>Cell Marque&#160;</td>
			<td>163M-15</td>
			<td>section 3, clone MRQ-26</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD19</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab134114</td>
			<td>section 3, clone EPR5906</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD1c (BDCA1)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TA505411</td>
			<td>section 3, clone OTI2F4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD20</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MS-340-S</td>
			<td>section 3, clone L26</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD3</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>RM-9107</td>
			<td>section 3, clone sp7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD303/BDCA2</td>
			<td>Dendritics via Enzo Lifesciences/Axxora</td>
			<td>DDX0043</td>
			<td>section 3, clone 124B3.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD56</td>
			<td>Cell Marque&#160;</td>
			<td>156R-94</td>
			<td>section 3, clone MRQ-42</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD66b</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555723</td>
			<td>section 3, clone G10F5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD68</td>
			<td>Dako Agilent</td>
			<td>M087601</td>
			<td>section 3, clone PG-M1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD8</td>
			<td>Dako Agilent</td>
			<td>M7103</td>
			<td>section 3, clone C8/144B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Foxp3</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>14-4777</td>
			<td>section 3, clone 236A/E7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Gp100</td>
			<td>Dako Agilent</td>
			<td>M063401</td>
			<td>section 3, clone HMB45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-HLA-DR, DP, DQ</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-53302</td>
			<td>section 3, clone CR3/43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-MART-1</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MS-799</td>
			<td>section 3, clone A103</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-pan cytokeratin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab86734</td>
			<td>section 3, clone AE1/AE3 + 5D3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-SOX10</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>383R</td>
			<td>section 3, clone EP268</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Tyrosinase</td>
			<td>Sanbio</td>
			<td>MONX10591</td>
			<td>section 3, clone T311</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-XCR1</td>
			<td>Cell Signaling Technologies via Biok&#233;</td>
			<td>44665S</td>
			<td>section 3, clone D2F8T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antibody diluent</td>
			<td>Akoya BioSciences</td>
			<td>SKU&#160;ARD1001EA</td>
			<td>section 3, from Opal 7-Color Automation IHC Kit 50 slide (can optionally also be replaced by TBST with 10% BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond Aspirating Probe</td>
			<td>Leica Biosciences</td>
			<td>S21.0605</td>
			<td>section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond Aspirating Probe Cleaning</td>
			<td>Leica Biosciences</td>
			<td>CS9100</td>
			<td>section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond Dewax Solution</td>
			<td>Leica Biosciences</td>
			<td>AR9222</td>
			<td>section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond Objectglas label + print lint</td>
			<td>Leica Biosciences</td>
			<td>S21.4564.A</td>
			<td>section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond Research Detection System 2</td>
			<td>Leica Biosciences</td>
			<td>DS9777</td>
			<td>section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond RX autostainer&#160;</td>
			<td>Leica Biosciences</td>
			<td>-</td>
			<td>section 3, automated platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond TM Epitope Retrieval 1 - 1 L</td>
			<td>Leica Biosciences</td>
			<td>AR9961</td>
			<td>section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond TM Epitope Retrieval 2 - 1 L</td>
			<td>Leica Biosciences</td>
			<td>AR9640</td>
			<td>section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond TM Wash Solution 10x - 1 L</td>
			<td>Leica Biosciences</td>
			<td>AR9590</td>
			<td>section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOND Universal Covertile</td>
			<td>Leica Biosciences</td>
			<td>S21.4611</td>
			<td>section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond(TM) Titration Kit</td>
			<td>Leica Biosciences</td>
			<td>OPT9049</td>
			<td>section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip 24 x 32 mm #1 (0.13-0.16 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15717592</td>
			<td>section 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslip 24 x 50 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0146</td>
			<td>section 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Fluoromount-G</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0100-20</td>
			<td>section 3, whenever monoplex slides need to be quickly checked, not for official analysis, then DAPI is stained seperately for better results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>section 2, home made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 99.5%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>4099.9005</td>
			<td>section 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>section 3&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>haematoxyline</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>section 2, home made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmuNet</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>immune cell detection and phenotyping pipeline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inForm software 2.4.10</td>
			<td>Akoya BioSciences</td>
			<td>-</td>
			<td>section 4 &#38; 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPAL 480 reagent pack</td>
			<td>Akoya BioSciences</td>
			<td>FP1500001KT</td>
			<td>section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPAL 520 reagent pack</td>
			<td>Akoya BioSciences</td>
			<td>FP1487001KT</td>
			<td>section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPAL 570 reagent pack</td>
			<td>Akoya BioSciences</td>
			<td>FP1488001KT</td>
			<td>section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPAL 620 reagent pack</td>
			<td>Akoya BioSciences</td>
			<td>FP1495001KT</td>
			<td>section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPAL 690 reagent pack</td>
			<td>Akoya BioSciences</td>
			<td>FP1497001KT</td>
			<td>section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPAL 780 reagent pack</td>
			<td>Akoya BioSciences</td>
			<td>FP1501001KT</td>
			<td>section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 7-Color Automation IHC Kit 50 slide</td>
			<td>Akoya BioSciences</td>
			<td>NEL821001KT</td>
			<td>section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhenoChart 1.1.0</td>
			<td>Akoya BioSciences</td>
			<td>-</td>
			<td>section 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhenoImagerHT</td>
			<td>Akoya BioSciences</td>
			<td>CLS143455</td>
			<td>section 4, digital pathology imager with slide viewer and imaging software (formerly known as Vectra Polaris)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-D mounting medium</td>
			<td>Klinipath</td>
			<td>7280</td>
			<td>section 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuPath 0.3.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>whole slide image analysis software platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R 4.1.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide boxes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0737</td>
			<td>section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus</td>
			<td>Thermo Scientific through VWR</td>
			<td>631-9483</td>
			<td>section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectra Polaris software 1.0.13</td>
			<td>Akoya BioSciences</td>
			<td>-</td>
			<td>section 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>4055-9005</td>
			<td>section 2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplex immunohistochemical analysis of the spatial immune cell landscape of the tumor microenvironment

נוף תאי החיסון של המיקרו-סביבה של הגידול עשוי להכיל מידע לגילוי סמנים ביולוגיים פרוגנוסטיים ומנבאים. אימונוהיסטוכימיה מולטיפלקס היא כלי רב ערך לדמיין ולזהות סוגים שונים של תאים חיסוניים ברקמות הגידול תוך שמירה על המידע המרחבי שלה. כאן אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים לניתוח אוכלוסיות לימפוציטים, מיאלואידים ותאים דנדריטיים בקטעי רקמות. החל מחיתוך מקטעים משובצי פרפין קבועים בפורמלין, הליכי צביעת מולטיפלקס אוטומטיים על פלטפורמה אוטומטית, סריקת השקופיות במיקרוסקופ הדמיה מולטיספקטרלי, ועד ניתוח תמונות באמצעות אלגוריתם למידת מכונה שפותח בתוך החברה ImmuNet. פרוטוקולים אלה יכולים להיות מיושמים על מגוון רחב של דגימות גידול פשוט על ידי החלפת סמני הגידול כדי לנתח תאים חיסוניים בתאים שונים של הדגימה (גידול לעומת שוליים פולשניים) וליישם ניתוח השכן הקרוב ביותר. ניתוח זה אינו מוגבל לדגימות גידול, אלא יכול להיות מיושם גם על רקמות אחרות (שאינן ) פתוגניות. שיפורים בציוד ובזרימת העבודה בשנים האחרונות קיצרו באופן משמעותי את זמני התפוקה, מה שמקל על היישום העתידי של הליך זה במסגרת האבחון.

Immune cells play a crucial role in the protection against pathogens such as viruses and bacteria, but also against cancerous cells1. Therefore, the immune system within the tumor microenvironment (TME) holds a lot of promise for discovering prognostic and predictive biomarkers2. Immune cell infiltrates have been correlated to prognosis in various types of cancer, although this has not been implemented in clinical care yet3,4. In most tumor types, high numbers of cytotoxic T cells and T helper 1 cells and/or low numbers of regulatory T cells are linked to good prognoses. Efforts are ongoing to incorporate a so-called &#34;Immunoscore&#34; into the TNM staging of colorectal cancer, turning it into TNM-I staging5,6. The Immunoscore is derived from the total number of T cells (detected with CD3) and cytotoxic T cells (detected with CD8) in two different tumor regions: the tumor core versus the invasive margin (IM) of tumors. The Immunoscore has also been proposed to be of prognostic value in other cancer types, such as melanoma, lung cancer, and breast cancer6,7,8,9. Furthermore, immune cell infiltrates may also correlate to response to checkpoint blockade immunotherapy10. However, these predictive biomarkers must be validated in prospective studies before they can be routinely implemented in clinical practice. Moreover, it has also been proposed that a single biomarker will be insufficient for meaningful prediction11. Therefore, creating a complete map of a patient sample by combining different biomarkers has been proposed as a more comprehensive predictive biomarker in a so-called &#34;cancer immunogram&#34;12.
Among the methods for studying immune cells within the TME, the oldest and most well-known technique is immunohistochemistry (IHC), routinely used for diagnostic testing in several diseases, especially cancer13. This technique was limited to the use of one or only a few markers14 for a long time and therefore, was outcompeted in research settings by other techniques such as flow cytometry and gene expression profiling (GEP). However, the formalin-fixed and paraffin-embedded (FFPE) tumor tissues typically used in routine diagnostics and research are not (optimally) suitable for flow cytometry and GEP. Furthermore, although GEP and flow cytometry provide a lot of insight into cell phenotype and function, the lack of spatial information is a major disadvantage. Therefore, heterogeneity within a sample, such as differences in immune cell-infiltrated versus immune cell-excluded areas of a tumor, could go undetected15. Novel platforms have been developed for multiplex analysis of FFPE tissues, such as multiplex IHC, imaging mass cytometry, and CO-Detection by indEXing (CODEX) that can be used to detect multiple markers simultaneously within a tissue section16. Immune cells in the TME are being widely studied to find the best biomarkers for immunotherapy. However, multiplex techniques and automated image analysis pose hurdles of their own.
Our laboratory has extensive experience in multiplex IHC staining using the Opal/Tyramide signal amplification (TSA) method and has automated this on a&#160;IHC platform (see the Table of Materials)17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31. We have optimized immune cell panels for the detection of different subsets of lymphocytes, myeloid cells, and dendritic cells (DCs). Tissues that contain dense immune cell areas - for lymphocytes or complex cell morphologies (i.e., myeloid cells and DCs) - are particularly challenging to analyze, with a risk of over- or underestimating the number of immune cells present. To overcome this problem, ImmuNet analysis software was developed by our group32, and this machine-learning pipeline improved the quality of the detection of these different types of immune cells immensely. A detailed protocol from obtaining the FFPE material to the analysis of immune cell densities in different tissue compartments and distances between immune cell types is described here.
This protocol outlines how the multiplex IHC panels are performed at the Radboud University Medical Center since the implementation of the digital pathology imager in 2022. The described multiplex IHC panels can be used for different carcinomas (e.g., lung, prostate, colorectal, bladder, breast) with the use of a pan-cytokeratin antibody as a tumor marker or for melanoma with the use of melanocyte-associated antibodies as tumor markers. These multiplex IHC protocols have been carefully optimized in terms of primary antibody concentration, fluorophore combinations, and the sequence of the staining procedure. We and others have described multiplex IHC panel optimization earlier17,33,34,35. Multiplex IHC panels can be adapted, but the described analysis pipelines need to be evaluated and potentially adjusted or retrained accordingly. The described seven-color multiplex IHC protocols make use of the Opal fluorophores Opal480, Opal520, Opal570, Opal620, Opal690, Opal780, and 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), so that easy unmixing and fast scanning on the imager is enabled with &#34;Multispectral One Touch ImmunoFluorescence&#34; (MOTiF). Nine-color staining and scanning is not described in this protocol as this requires even more finetuning of the experimental setup and another mode of scanning on the imager that uses the liquid crystal tunable filter.

מחבר זרקור: גילוי תובנות על נוף תאי החיסון של גידולים

ניתוח אימונוהיסטוכימי מולטיפלקס של נוף תאי החיסון המרחביים של מיקרו-סביבה סרטנית

Our aim is to identify the amount, type, and location of immune cells within the tumor microenvironments. In the field of immunochemistry, there have been major advance in technology in recent years. Advance in multiplex immunochemistry technology allow for more markers to be reliably studied.Current experimental challenges are visualize specific types of immune cells within tumor samples, which have been overcome by using the multiplex immunochemistry methods. However, accurate automatic analysis of these images is still a challenge that we're working on. The differences between immune cell landscape between primary and metastatic tumors generate questions such as, what tumor intrinsic properties drive these differences, and what do these differences mean for therapies that target the immune system?Next to our exploratory work, we will also focus on clinically relevant questions such as how the immune cell landscape of the tumor is affected by different types of anti-cancer therapies and whether the immune cell landscape could predict the outcome of therapy.

Read this Scientific Article Protocol about Multiplex Immunohistochemical Analysis of the Spatial Immune Cell Landscape of the Tumor Microenvironment at JoVE.com

פרוטוקול זה מתאר בפירוט כיצד מתבצע אפיון תאי החיסון של המיקרו-סביבה של הגידול באמצעות אימונוהיסטוכימיה מרובה.

The immune cell landscape of the tumor microenvironment potentially contains information for the discovery of prognostic and predictive biomarkers. ...

מטרתנו היא לזהות את הכמות, הסוג והמיקום של תאי החיסון בתוך המיקרו-סביבות של הגידול. בתחום האימונוכימיה חלה התקדמות טכנולוגית משמעותית בשנים האחרונות. התקדמות בטכנולוגיית אימונוכימיה מרובת מרבבים מאפשרת לחקור סמנים נוספים באופן אמין.אתגרי הניסוי הנוכחיים הם לדמיין סוגים ספציפיים של תאים חיסוניים בתוך דגימות גידול, אשר התגברו באמצעות שיטות אימונוכימיה מרובה. עם זאת, ניתוח אוטומטי מדויק של תמונות אלה הוא עדיין אתגר שאנחנו עובדים עליו. ההבדלים בין נוף תאי החיסון בין גידולים ראשוניים לגרורתיים מעוררים שאלות כגון, אילו תכונות מהותיות של הגידול מניעות הבדלים אלה, ומה המשמעות של הבדלים אלה עבור טיפולים המכוונים למערכת החיסון?לצד עבודת הגישוש שלנו, נתמקד גם בשאלות רלוונטיות מבחינה קלינית כגון כיצד נוף תאי החיסון של הגידול מושפע מסוגים שונים של טיפולים אנטי-סרטניים והאם נוף תאי החיסון יכול לחזות את תוצאות הטיפול.

multiplex-immunohistochemical-analysis-spatial-immune-cell-landscape

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Multiplex Immunohistochemical Analysis of the Spatial Immune Cell Landscape of the Tumor Microenvironment

1.3K Views.  Radboudumc. מטרתנו היא לזהות את הכמות, הסוג והמיקום של תאי החיסון בתוך המיקרו-סביבות של הגידול. בתחום האימונוכימיה חלה התקדמות טכנולוגית משמעותית בשנים האחרונות. התקדמות בטכנולוגיית אימונוכימיה מרובת מרבבים מאפשרת לחקור סמנים נוספים באופן אמין.אתגרי הניסוי הנוכחיים הם לדמיין סו...

Video: מחבר זרקור: גילוי תובנות על נוף תאי החיסון של גידולים

The immune cell landscape of the tumor microenvironment potentially contains information for the discovery of prognostic and predictive biomarkers. Multiplex immunohistochemistry is a valuable tool to visualize and identify different types of immune cells in tumor tissues while retaining its spatial information. Here we provide detailed protocols to analyze lymphocyte, myeloid, and dendritic cell populations in tissue sections. Starting from cutting formalin-fixed paraffin-embedded sections, automatic multiplex staining procedures on an automated platform, scanning of the slides on a multispectral imaging microscope, to the analysis of images using an in-house-developed machine learning algorithm ImmuNet. These protocols can be applied to a variety of tumor specimens by simply switching tumor markers to analyze immune cells in different compartments of the sample (tumor versus invasive margin) and apply nearest-neighbor analysis. This analysis is not limited to tumor samples but can also be applied to other (non-)pathogenic tissues. Improvements to the equipment and workflow over the past few years have significantly shortened throughput times, which facilitates the future application of this procedure in the diagnostic setting.

This protocol describes in detail how immune cell characterization of the tumor microenvironment using multiplex immunohistochemistry is carried out.

Workflow for Immune Cells Detection Using the Machine Learning Algorithm ImmuNet

After performing immunohistochemistry on the FFPE tissues, image the sections using the digital pathology imager. Launch the software to perform spectral unmixing of the annotated images. Select File, then click Open Image, and choose the QPTIFF files to upload the images into the software.Allow the stamps marked as informed projects to upload into the project. Load the QPTIFF files prepared for the autofluorescence compensation. Select the autofluorescence on the image tool to draw a line on the image from the unstained slide through autofluorescent structures like erythrocytes and collagen to compensate for autofluorescence.Then navigate to the Edit Markers and Colors section. Assign marker names that match the Opal fluorophore, and adjust the color settings to your preferred option. Select Prepare All located in the lower left corner of the interface to initiate the unmixing of fluorophores.Examine all images to check the visibility of all signals and the successful completion of the unmixing process. Select the eyeball icon to turn off and on all the markers one by one to check the quality. Now navigate to the Export tab and create a new empty export directory by clicking the Browse button located under the Export directory.Select composite image and component images multi-image TIFF under the images to export tab. Navigate to the Batch Analysis tab found vertically on the left for batch processing of slides and select create separate directories for each item under the export options. To add slides for analysis, select QPTIFF files under the Add Slides button and load these into the batch analysis.Select Run to commence the batch processing of slides. Create a new folder containing only the component files from spectral unmixing, ensuring the hierarchical folder structure remains intact. Launch the whole slide viewer software.Click Create Project on the left side and create or select a new empty folder with an appropriate name. Then click Automate and choose Show script editor. Copy and paste the existing script and modify the location to direct it toward the folder that contains all the slide component files.Select Run to begin the process of batch stitching slides, and then allow it to complete. Now move the recently generated OME TIFF files into the QuPath project and save them as a new project. When a new window appears, select set image type as fluorescence, then click the Import button.Navigate to the menu on the left, select a sample from the list and double click to open the chosen sample. Adjust the intensity of the channels by clicking the Contrast icon to enhance visibility. Select all channels and opt to reset.Ensure the autofluorescence is toggled off. To draw a region of interest or ROI for the tumor, click the contrast icon again then select Show grayscale. After that, select the tumor marker channel and adjust the intensity for optimal visibility.Click the brush tool to draw an ROI around the tumor. Click the one tool and adjust the ROI while pressing the alt key to smooth the ROI from the outside. When finished, merge any separated parts of the tumor into the same ROI.Right click the ROI annotation in the list on the left, select Set Properties, and provide a suitable name. For instance, Tumor. Expand the ROI for the invasive margin from the tumor region by selecting Objects, then Annotations, followed by Expand Annotations.Choose the desired size for the expansion radius. Select remove interior and constrain to parent. Click on the contrast icon, select the autofluorescence channel and adjust the intensity for optimal visibility.Click the wand and adjust the ROI while pressing the alt key to smooth the ROI from the outside and remove any background that should not be part of this ROI. Right click the annotation in the list on the left. Then select Set Properties to assign a suitable name, such as invasive margin or IM to the ROI.If desired, change its color. To export the annotations, navigate to the File option, click Object Data, Export as GeoJSON, and select Export All Objects. Continue with the default selection on export as feature collection, and save it in a preferred location.