PhenoImager HT는 Radboud University Medical Center와 Radboud Technology Center for Microscopy에서 제공하는 자금을 통해 구입했습니다. CF는 네덜란드 암 협회 보조금(10673)과 ERC Adv 보조금 ARTimmune (834618)의 재정 지원을 받습니다. JT는 NWO Vidi 보조금(VI.Vidi.192.084)으로 재정적으로 지원됩니다. 저자들은 멀티플렉스 IHC 데이터를 저장하기 위한 워크플로우를 만드는 데 도움을 준 Eric van Dinther와 Ankur Ankan에게 감사를 표하고, Bengt Phung은 ROI 도면을 위해 QuPath에서 멀티플렉스 IHC 데이터를 구현하는 방법에 대한 지침을 제공해 주었습니다.

종양 면역 환경 매핑: 심층 멀티플렉스 IHC 분석 프로토콜

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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+microenvironment+shows+an+immunological+abscopal+effect+in+patients+with+NSCLC+treated+with+pembrolizumab-radiotherapy+combination.">Tumor microenvironment shows an immunological abscopal effect in patients with NSCLC treated with pembrolizumab-radiotherapy combination.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (10), e005248 (2022).</li><li>Graham Martinez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+microenvironment+landscape+shows+treatment-specific+differences+in+rectal+cancer+patients.">The immune microenvironment landscape shows treatment-specific differences in rectal cancer patients.</a> Frontiers in Immunology. 13, 1011498 (2022).</li><li>Cortenbach, K. R. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired+primary+and+metastatic+lesions+of+patients+with+ipilimumab-treated+melanoma:+high+variation+in+lymphocyte+infiltration+and+HLA-ABC+expression+whereas+tumor+mutational+load+is+similar+and+correlates+with+clinical+outcome.">Paired primary and metastatic lesions of patients with ipilimumab-treated melanoma: high variation in lymphocyte infiltration and HLA-ABC expression whereas tumor mutational load is similar and correlates with clinical outcome.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (5), e004329 (2022).</li><li>van Wilpe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumoral+T+cell+depletion+following+neoadjuvant+chemotherapy+in+patients+with+muscle-invasive+bladder+cancer+is+associated+with+poor+clinical+outcome.">Intratumoral T cell depletion following neoadjuvant chemotherapy in patients with muscle-invasive bladder cancer is associated with poor clinical outcome.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 72 (1), 137-149 (2023).</li><li>Sultan, S., Gorris, M. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+multiplex+immunofluorescence+panels+using+multispectral+microscopy+for+immune-profiling+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+human+tumor+tissues.">Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).</li><li>Sun, Z., Nyberg, R., Wu, Y., Bernard, B., Redmond, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+an+enhanced+7-color+multiplex+IHC+protocol+to+dissect+immune+infiltration+in+human+cancers.">Developing an enhanced 7-color multiplex IHC protocol to dissect immune infiltration in human cancers.</a> PLoS One. 16 (2), e0247238 (2021).</li><li>LeicaBiosystems. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BOND+RX+Fully+Automated+Research+Stainer+Protocols.">BOND RX Fully Automated Research Stainer Protocols.</a> , (2022).</li></ol>

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

TME의 공간 분석은 특히 면역 종양학 분야에서 면역 세포 구획에 대해 자세히 알아보고 새로운 예후 및 예측 바이오마커를 발견하기 위해 인기 있는 기법입니다16. 이러한 목적을 위해 단백질, mRNA 전사체 또는 이 둘의 조합을 검출하는 등 최대 100-1,000개의 표적을 추정하는 다양한 기술이 개발되고 있습니다. 그러나 멀티플렉싱이 높을수록 처리량이 적은 실험, 더 높은 실험 비용 및 기술적 문제가 발생하며 TME의 작은 부분만 분석할 수 있는 경우가 많습니다. 여기에서 설명하는 TSA 기반 방법을 사용하는 멀티플렉스 IHC는 6개의 서로 다른 마커 + DAPI를 동시에 검출하고, 수행 비용이 상대적으로 저렴하며, 전체 조직 절편이 20분 이내에 이미징되어 완전히 분석할 준비가 됩니다. 이 기술은 염색 절차의 자동화로 덜 복잡해졌습니다. 두 개의 추가 필터 추가를 포함한 다중 스펙트럼 현미경의 개선으로 스펙트럼 불혼합 및 스캔 시간이 크게 개선되었습니다. 최대 8개의 서로 다른 마커 + DAPI를 동시에 감지할 수 있습니다. 그러나 더 많은 마커로 멀티플렉싱을 확장하면 스펙트럼 불혼합이 더 어려워지고 전체 슬라이드의 스캔 시간이 크게 증가함에 따라 앞서 언급한 이점이 사라집니다. 진단 환경에서 보다 쉽게 구현할 수 있도록 서로 다른 기관 간의 멀티플렉스 IHC를 표준화하기 위한 노력이 진행되고 있습니다. 이러한 멀티플렉스 IHC의 표준화를 위해 사용자는 6개의 서로 다른 마커 + DAPI를 사용하여 보다 접근하기 쉬운 프로토콜을 준수하는 것이 좋습니다. 그럼에도 불구하고 여전히 상당한 기술적 노하우가 필요하고 다운스트림 분석이 어려울 수 있으므로 이 프로토콜에 설명된 방법론을 개발했습니다.
표준화는 멀티플렉스 IHC 패널 개발에서 시작됩니다. 특정 단백질 표적을 검출하는 1차 항체 선택의 중요성은17년 이전부터 강조되어 왔습니다. 당사의 멀티플렉스 IHC 패널은 대부분 당사의 진단 부서에서 IHC에 사용되고 검증된 1차 항체 클론으로 개발됩니다. 그러나, 수지상세포 다중화 IHC 패널의 경우, 대부분의 항체는 진단 환경에서 사용되지 않았다(van der Hoorn et al., manuscript in submission). 특이성을 보장하고 배치 차이를 최소화하기 위해 다클론 항체보다 단클론 항체를 사용하기로 결정했으며 transfection된 세포주와 일차 세포를 사용하여 대부분의 항체를 검증했습니다. 수년에 걸쳐 Vectra 3 시스템 18,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32를 사용하는 수많은 연구에서 다양한 버전의 멀티플렉스 IHC 패널이 사용되었습니다.. PhenoImager HT 시스템에서 이러한 멀티플렉스 IHC 패널을 최적으로 구현하기 위해 1차 항체 및 형광단 조합에서 일부 조정이 이루어져야 했습니다. 더 나은 스펙트럼 불혼합과 전체 조직 절편의 더 빠른 스캐닝 시간을 활용하려면 최신 Opal480 및 Opal780 형광단을 구현하고 7색 다중 IHC 패널에서 Opal540 및 Opal650 형광단을 사용하지 않아야 합니다. 스캐닝 시간은 조직 절편의 크기에 따라 3~10배 더 빠릅니다. 멀티플렉스 IHC 패널 조정은 매우 쉽게 달성할 수 있었지만 몇 가지 고려 사항을 염두에 두어야 합니다. Opal480의 형광 스펙트럼은 자가형광 스펙트럼과 많이 겹치므로 적혈구 및 기타 자가형광 구조의 스펙트럼 불혼합을 방해합니다. Opal480과 함께 증가된 농도의 1차 항체를 사용하면 대부분의 경우 이 문제가 해결되었습니다. PhenoImager HT에 독점적인 샘플 AF 필터를 구현하면 Opal480과 자가형광의 언믹스가 용이해집니다. 그러나 Opal480과 함께 사용할 때 명확한 신호를 생성하는 1차 항체를 사용하여 신호가 자가형광보다 높도록 하는 것이 가장 좋습니다.
이러한 멀티플렉스 IHC 패널이 구축되더라도 배치 간 변동을 고려해야 합니다. 전체 멀티플렉스 IHC 실험을 시작하기 전에 모노플렉스 IHC 대조군을 수행함으로써, 우리는 때때로 1차 항체가 실험마다 더 강하거나 더 약하게 수행되는 것을 관찰했습니다. 그 이유는 피펫팅 오류, 최적화되지 않은 시약 보관 조건 및 보관 수명일 수 있습니다. 우리는 우리의 경험을 바탕으로 1차 항체 용액을 조정하여 이 문제를 해결했습니다. 앞서 언급한 조정 중 어느 것도 할 필요가 없는 경우에도 모든 멀티플렉스 IHC 배치 실험에서 모노플렉스 IHC 염색 대조군 슬라이드를 기반으로 노출 시간을 설정하는 것이 중요합니다.
우리의 연구는 초기에 다양한 유형의 암종과 흑색종에 초점을 맞추었기 때문에 최소한의 조정으로 종양 유형 간에 상호 교환할 수 있는 멀티플렉스 IHC 패널이 필요했습니다. 따라서 우리는 항상 최적화 과정에 여러 (종양) 조직 유형을 포함시켰고 면역 세포 마커에 대한 1차 항체에 대한 희석이 서로 다른 종양 유형 간에 유사하게 유지될 수 있음을 관찰했습니다. 그러나 암종과 흑색종 사이의 종양 조직 검출에는 다른 종양 마커가 필요합니다. 따라서, 종양 마커는 항상 각 멀티플렉스 IHC 패널의 끝에서 작동하도록 최적화되었으며, 현재 항상 Opal780과 함께 사용되며, 이는 공교롭게도 멀티플렉스 IHC 염색 절차에서 마지막 형광단에 있어야 합니다. 결과적으로 멀티플렉스 IHC의 말단에 종양 마커를 사용함으로써, 이러한 멀티플렉스 IHC 패널은 교모세포종(즉, GFAP) 및 호지킨 림프종(즉, CD30)과 같은 다른 종양 유형으로 쉽게 교환될 수 있습니다. 혈관육종의 경우, 적혈구 형질전환 특이적 유전자(ERG)가 있는 이 림프구 다중성 IHC 패널을 종양 마커로 사용했으며, 단 두 번의 최적화 실험으로25. 최적화에는 ERG 1차 항체의 적정과 끝에 ERG가 있는 멀티플렉스 IHC 패널 테스트가 포함되었습니다.
이러한 멀티플렉스 IHC 패널에 대한 다른 조정은 특정 면역 세포 마커를 다른 면역 또는 기능 마커로 교환함으로써 이루어질 수도 있습니다. 모든 변화에는 최적화가 필요합니다. 최적화를 위한 프로토콜은 앞서 설명한 바와 같이 따를 수 있다17. 제안된 멀티플렉스 IHC 패널에 대한 특정 변경 사항은 우리가 만든 ImmuNet 알고리즘을 방해할 것입니다. 이러한 변경 사항을 알고리즘에 구현하기 위해 충분한 데이터가 생성되어야 하며 시간이 소요되어야 합니다(모든 새로운 마커 및/또는 세포 표현형에 대해 최소 750개의 주석, 이전에 훈련된 마커의 검증을 위한 150개의 주석). 여기에 제시된 패널에는 기능성 마커가 포함되어 있지 않지만, PD-1 및 PD-L1과 같은 면역 관문 마커를 다중 IHC 패널에 구현하는 작업이 우리 실험실에서 수행됩니다. 그러나 음수 신호와 양수 신호에서 덜 이분법적인 마커를 분석하는 것은 더 어려운 것으로 입증되었으며 우리 그룹에서 활발한 연구 영역입니다.
멀티플렉스 IHC로 동시에 평가할 수 있는 마커의 수는 다른 새로운 기술에 비해 제한적입니다. FFPE 블록의 연속된 슬라이스에서 서로 다른 패널을 분석하여 이를 피할 수 있지만 이러한 슬라이스를 공간적으로 비교하는 것은 어렵습니다. 방향과 접힌 아티팩트는 슬라이드 준비 후에 동일하지 않을 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 멀티플렉스 IHC는 접근성이 뛰어나 더 많은 기관과 연구자에게 매력적인 도구가 될 수 있으므로 향후 진단 환경에서 구현하기에 더 적합합니다. 여러 종양 유형 및 다운스트림 분석 파이프라인에 대한 멀티플렉스 IHC 면역 세포 패널의 표준화를 통해 환자와 종양 유형 간의 TME의 차이에 대해 더 많은 지식을 얻을 수 있습니다. 예를 들어, 이는 특정 치료에 대한 항종양 반응에서 TME의 역할에 대한 더 많은 통찰력으로 이어질 수 있습니다. 이는 치료에 대한 반응 및 예상 생존과 같은 요인을 예측하기 위한 새로운 바이오마커를 발생시킬 수도 있습니다. 전반적으로, 이를 통해 멀티플렉스 IHC는 맞춤형 의료 접근 방식에서 임상 의사 결정을 지원하는 임상 도구가 될 수 있습니다. 물론, 분석 절차의 더 많은 단계를 자동화하고 표준화하여 일상적인 진단 환경에서 사용할 수 있도록 해야 하므로 아직까지는 대부분 미래 지향적인 관점입니다.
단일 샘플 슬라이드에서 여러 마커를 분석하는 것은 기술적 어려움에도 불구하고 매우 강력한 도구가 될 수 있습니다. 여기에서 ImmuNet을 사용하여 설명한 바와 같이 표준화된 실험 프로토콜과 강력한 분석 방법을 사용하면 여러 마커의 정량화가 기존 IHC보다 더 많은 정보를 제공하는 반면, 멀티플렉스 IHC는 새로운 고플렉스 실험 방법에 비해 상대적으로 높은 처리량을 유지합니다.

면역 세포는 바이러스 및 박테리아와 같은 병원체뿐만 아니라 암세포에 대한 보호에도 중요한 역할을 합니다1. 따라서 종양미세환경(tumor microenvironment, TME) 내의 면역체계는 예후 및 예측 바이오마커를 발견하는 데 많은 가능성을 가지고 있다2. 면역 세포 침윤은 다양한 유형의 암에서 예후와 상관 관계가 있지만 아직 임상 치료에서 구현되지 않았습니다 3,4. 대부분의 종양 유형에서 세포독성 T 세포와 T helper 1 세포의 수가 많거나 조절 T 세포의 수가 적으면 예후가 양호합니다. 소위 "면역 점수"를 대장암의 TNM 병기에 통합하여 TNM-I 병기 5,6으로 전환하기 위한 노력이 진행 중입니다. 면역 점수는 서로 다른 두 종양 영역, 즉 종양 코어와 종양의 침습적 가장자리(IM)에 있는 T 세포(CD3로 검출)와 세포독성 T 세포(CD8로 검출)의 총 수에서 파생됩니다. 면역 점수는 또한 흑색종, 폐암 및 유방암과 같은 다른 유형의 암에서 예후 가치가 있는 것으로 제안되었습니다 6,7,8,9. 또한, 면역세포 침투는 관문봉쇄면역요법에 대한 반응과도 상관관계가 있을 수있다 10. 그러나 이러한 예측 바이오마커는 임상 실습에서 일상적으로 구현되기 전에 전향적 연구에서 검증되어야 합니다. 또한, 단일 바이오마커가 의미 있는 예측에 불충분하다는 것도 제안되었다11. 따라서 서로 다른 바이오마커를 결합하여 환자 샘플의 완전한 맵을 생성하는 것이 소위 "암 면역도"12에서 보다 포괄적인 예측 바이오마커로 제안되었습니다.
TME 내에서 면역 세포를 연구하는 방법 중 가장 오래되고 가장 잘 알려진 기술은 면역조직화학(IHC)으로, 여러 질병, 특히 암의 진단 검사에 일상적으로 사용된다13. 이 기법은 오랫동안 하나 또는 소수의 마커(14 )의 사용으로 제한되었기 때문에, 유세포분석 및 유전자 발현 프로파일링(GEP)과 같은 다른 기법에 의해 연구 환경에서 경쟁에서 뒤처졌다. 그러나 일상적인 진단 및 연구에 일반적으로 사용되는 포르말린 고정 및 파라핀 포매(FFPE) 종양 조직은 유세포 분석 및 GEP에 (최적으로) 적합하지 않습니다. 또한 GEP 및 유세포 분석은 세포 표현형 및 기능에 대한 많은 통찰력을 제공하지만 공간 정보가 부족하다는 것이 주요 단점입니다. 따라서 종양의 면역 세포 침투 영역과 면역 세포 배제 영역의 차이와 같은 샘플 내 이질성은 감지되지 않을 수 있습니다15. 조직 절편16 내에서 여러 마커를 동시에 검출하는 데 사용할 수 있는 멀티플렉스 IHC, 이미징 질량 세포 분석 및 CO-Detection by indEXing(CO-Detection by indEXing)과 같은 FFPE 조직의 다중 분석을 위해 새로운 플랫폼이 개발되었습니다. TME의 면역 세포는 면역 요법을 위한 최상의 바이오마커를 찾기 위해 널리 연구되고 있습니다. 그러나 멀티플렉스 기술과 자동화된 이미지 분석은 그 자체로 장애물이 있습니다.
우리 실험실은 Opal/Tyramide 신호 증폭(TSA) 방법을 사용한 멀티플렉스 IHC 염색에 대한 광범위한 경험을 보유하고 있으며 IHC 플랫폼(재료 표 참조)에서 이를 자동화했습니다.17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28, 29,30,31. 당사는 림프구, 골수성 세포 및 수지상 세포(DC)의 다양한 하위 집합을 검출하기 위해 면역 세포 패널을 최적화했습니다. 림프구 또는 복잡한 세포 형태(즉, 골수성 세포 및 DC)와 같은 조밀한 면역 세포 영역을 포함하는 조직은 존재하는 면역 세포의 수를 과대평가하거나 과소평가할 위험이 있어 분석이 특히 까다롭습니다. 이 문제를 극복하기 위해 그룹32는 ImmuNet 분석 소프트웨어를 개발했으며, 이 머신 러닝 파이프라인은 이러한 다양한 유형의 면역 세포의 검출 품질을 크게 향상시켰습니다. FFPE 물질을 얻는 것부터 다양한 조직 구획의 면역 세포 밀도 및 면역 세포 유형 간의 거리 분석에 이르는 자세한 프로토콜이 여기에 설명되어 있습니다.
이 프로토콜은 2022년 디지털 병리학 이미저가 구현된 이후 Radboud University Medical Center에서 멀티플렉스 IHC 패널이 어떻게 수행되는지 간략하게 설명합니다. 설명된 멀티플렉스 IHC 패널은 종양 마커로서 팬-사이토케라틴 항체를 사용하는 다양한 암종(예를 들어, 폐, 전립선, 결장직장, 방광, 유방)에 사용할 수 있으며, 멜라닌 세포 관련 항체를 종양 마커로 사용하는 흑색종에 사용할 수 있다. 이러한 멀티플렉스 IHC 프로토콜은 1차 항체 농도, 형광단 조합 및 염색 절차의 순서 측면에서 신중하게 최적화되었습니다. 우리와 다른 사람들은 이전에 17,33,34,35 년에 멀티플렉스 IHC 패널 최적화에 대해 설명했습니다. 멀티플렉스 IHC 패널은 조정할 수 있지만, 설명된 분석 파이프라인을 평가하고 그에 따라 잠재적으로 조정하거나 재교육해야 합니다. 설명된 7색 멀티플렉스 IHC 프로토콜은 Opal 형광단 Opal480, Opal520, Opal570, Opal620, Opal690, Opal780 및 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)을 사용하므로 "Multispectral One Touch ImmunoFluorescence"(MOTiF)를 통해 이미저에서 쉬운 혼합 해제 및 빠른 스캔이 가능합니다. 9색 염색 및 스캐닝은 실험 설정을 더욱 미세 조정하고 액정 조정 가능 필터를 사용하는 이미저에서 다른 스캐닝 모드를 더 세밀하게 조정해야 하기 때문에 이 프로토콜에서는 설명되지 않습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>anti-CD14</td>
			<td>Cell Marque&#160;</td>
			<td>114R-16</td>
			<td>section 3, clone EPR3653</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD163</td>
			<td>Cell Marque&#160;</td>
			<td>163M-15</td>
			<td>section 3, clone MRQ-26</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD19</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab134114</td>
			<td>section 3, clone EPR5906</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD1c (BDCA1)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TA505411</td>
			<td>section 3, clone OTI2F4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD20</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MS-340-S</td>
			<td>section 3, clone L26</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD3</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>RM-9107</td>
			<td>section 3, clone sp7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD303/BDCA2</td>
			<td>Dendritics via Enzo Lifesciences/Axxora</td>
			<td>DDX0043</td>
			<td>section 3, clone 124B3.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD56</td>
			<td>Cell Marque&#160;</td>
			<td>156R-94</td>
			<td>section 3, clone MRQ-42</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD66b</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555723</td>
			<td>section 3, clone G10F5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD68</td>
			<td>Dako Agilent</td>
			<td>M087601</td>
			<td>section 3, clone PG-M1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD8</td>
			<td>Dako Agilent</td>
			<td>M7103</td>
			<td>section 3, clone C8/144B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Foxp3</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>14-4777</td>
			<td>section 3, clone 236A/E7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Gp100</td>
			<td>Dako Agilent</td>
			<td>M063401</td>
			<td>section 3, clone HMB45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-HLA-DR, DP, DQ</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-53302</td>
			<td>section 3, clone CR3/43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-MART-1</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MS-799</td>
			<td>section 3, clone A103</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-pan cytokeratin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab86734</td>
			<td>section 3, clone AE1/AE3 + 5D3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-SOX10</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>383R</td>
			<td>section 3, clone EP268</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Tyrosinase</td>
			<td>Sanbio</td>
			<td>MONX10591</td>
			<td>section 3, clone T311</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-XCR1</td>
			<td>Cell Signaling Technologies via Biok&#233;</td>
			<td>44665S</td>
			<td>section 3, clone D2F8T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antibody diluent</td>
			<td>Akoya BioSciences</td>
			<td>SKU&#160;ARD1001EA</td>
			<td>section 3, from Opal 7-Color Automation IHC Kit 50 slide (can optionally also be replaced by TBST with 10% BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond Aspirating Probe</td>
			<td>Leica Biosciences</td>
			<td>S21.0605</td>
			<td>section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond Aspirating Probe Cleaning</td>
			<td>Leica Biosciences</td>
			<td>CS9100</td>
			<td>section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond Dewax Solution</td>
			<td>Leica Biosciences</td>
			<td>AR9222</td>
			<td>section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond Objectglas label + print lint</td>
			<td>Leica Biosciences</td>
			<td>S21.4564.A</td>
			<td>section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond Research Detection System 2</td>
			<td>Leica Biosciences</td>
			<td>DS9777</td>
			<td>section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond RX autostainer&#160;</td>
			<td>Leica Biosciences</td>
			<td>-</td>
			<td>section 3, automated platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond TM Epitope Retrieval 1 - 1 L</td>
			<td>Leica Biosciences</td>
			<td>AR9961</td>
			<td>section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond TM Epitope Retrieval 2 - 1 L</td>
			<td>Leica Biosciences</td>
			<td>AR9640</td>
			<td>section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond TM Wash Solution 10x - 1 L</td>
			<td>Leica Biosciences</td>
			<td>AR9590</td>
			<td>section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOND Universal Covertile</td>
			<td>Leica Biosciences</td>
			<td>S21.4611</td>
			<td>section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond(TM) Titration Kit</td>
			<td>Leica Biosciences</td>
			<td>OPT9049</td>
			<td>section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip 24 x 32 mm #1 (0.13-0.16 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15717592</td>
			<td>section 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslip 24 x 50 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0146</td>
			<td>section 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Fluoromount-G</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0100-20</td>
			<td>section 3, whenever monoplex slides need to be quickly checked, not for official analysis, then DAPI is stained seperately for better results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>section 2, home made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 99.5%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>4099.9005</td>
			<td>section 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>section 3&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>haematoxyline</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>section 2, home made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmuNet</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>immune cell detection and phenotyping pipeline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inForm software 2.4.10</td>
			<td>Akoya BioSciences</td>
			<td>-</td>
			<td>section 4 &#38; 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPAL 480 reagent pack</td>
			<td>Akoya BioSciences</td>
			<td>FP1500001KT</td>
			<td>section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPAL 520 reagent pack</td>
			<td>Akoya BioSciences</td>
			<td>FP1487001KT</td>
			<td>section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPAL 570 reagent pack</td>
			<td>Akoya BioSciences</td>
			<td>FP1488001KT</td>
			<td>section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPAL 620 reagent pack</td>
			<td>Akoya BioSciences</td>
			<td>FP1495001KT</td>
			<td>section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPAL 690 reagent pack</td>
			<td>Akoya BioSciences</td>
			<td>FP1497001KT</td>
			<td>section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPAL 780 reagent pack</td>
			<td>Akoya BioSciences</td>
			<td>FP1501001KT</td>
			<td>section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 7-Color Automation IHC Kit 50 slide</td>
			<td>Akoya BioSciences</td>
			<td>NEL821001KT</td>
			<td>section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhenoChart 1.1.0</td>
			<td>Akoya BioSciences</td>
			<td>-</td>
			<td>section 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhenoImagerHT</td>
			<td>Akoya BioSciences</td>
			<td>CLS143455</td>
			<td>section 4, digital pathology imager with slide viewer and imaging software (formerly known as Vectra Polaris)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-D mounting medium</td>
			<td>Klinipath</td>
			<td>7280</td>
			<td>section 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuPath 0.3.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>whole slide image analysis software platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R 4.1.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide boxes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0737</td>
			<td>section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus</td>
			<td>Thermo Scientific through VWR</td>
			<td>631-9483</td>
			<td>section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectra Polaris software 1.0.13</td>
			<td>Akoya BioSciences</td>
			<td>-</td>
			<td>section 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>4055-9005</td>
			<td>section 2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplex immunohistochemical analysis of the spatial immune cell landscape of the tumor microenvironment

종양 미세환경의 면역 세포 환경에는 예후 및 예측 바이오마커의 발견을 위한 정보가 포함될 수 있습니다. Multiplex immunohistochemistry는 공간 정보를 유지하면서 종양 조직에서 다양한 유형의 면역 세포를 시각화하고 식별할 수 있는 유용한 도구입니다. 여기에서는 조직 절편에서 림프구, 골수성 및 수지상 세포 집단을 분석하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 포르말린 고정 파라핀이 포매된 절편 절단, 자동화된 플랫폼에서의 자동 멀티플렉스 염색 절차, 다중 스펙트럼 이미징 현미경으로 슬라이드 스캔, 자체 개발한 머신 러닝 알고리즘 ImmuNet을 사용한 이미지 분석에 이르기까지. 이러한 프로토콜은 단순히 종양 마커를 전환하여 샘플의 다른 구획(종양 대 침습적 가장자리)에 있는 면역 세포를 분석하고 가장 가까운 이웃 분석을 적용함으로써 다양한 종양 검체에 적용할 수 있습니다. 이 분석은 종양 샘플에 국한되지 않고 다른 (비)병원성 조직에도 적용할 수 있습니다. 지난 몇 년 동안 장비 및 작업 흐름이 개선되어 처리 시간이 크게 단축되었으며, 이는 향후 진단 환경에서 이 절차를 쉽게 적용할 수 있도록 합니다.

Immune cells play a crucial role in the protection against pathogens such as viruses and bacteria, but also against cancerous cells1. Therefore, the immune system within the tumor microenvironment (TME) holds a lot of promise for discovering prognostic and predictive biomarkers2. Immune cell infiltrates have been correlated to prognosis in various types of cancer, although this has not been implemented in clinical care yet3,4. In most tumor types, high numbers of cytotoxic T cells and T helper 1 cells and/or low numbers of regulatory T cells are linked to good prognoses. Efforts are ongoing to incorporate a so-called &#34;Immunoscore&#34; into the TNM staging of colorectal cancer, turning it into TNM-I staging5,6. The Immunoscore is derived from the total number of T cells (detected with CD3) and cytotoxic T cells (detected with CD8) in two different tumor regions: the tumor core versus the invasive margin (IM) of tumors. The Immunoscore has also been proposed to be of prognostic value in other cancer types, such as melanoma, lung cancer, and breast cancer6,7,8,9. Furthermore, immune cell infiltrates may also correlate to response to checkpoint blockade immunotherapy10. However, these predictive biomarkers must be validated in prospective studies before they can be routinely implemented in clinical practice. Moreover, it has also been proposed that a single biomarker will be insufficient for meaningful prediction11. Therefore, creating a complete map of a patient sample by combining different biomarkers has been proposed as a more comprehensive predictive biomarker in a so-called &#34;cancer immunogram&#34;12.
Among the methods for studying immune cells within the TME, the oldest and most well-known technique is immunohistochemistry (IHC), routinely used for diagnostic testing in several diseases, especially cancer13. This technique was limited to the use of one or only a few markers14 for a long time and therefore, was outcompeted in research settings by other techniques such as flow cytometry and gene expression profiling (GEP). However, the formalin-fixed and paraffin-embedded (FFPE) tumor tissues typically used in routine diagnostics and research are not (optimally) suitable for flow cytometry and GEP. Furthermore, although GEP and flow cytometry provide a lot of insight into cell phenotype and function, the lack of spatial information is a major disadvantage. Therefore, heterogeneity within a sample, such as differences in immune cell-infiltrated versus immune cell-excluded areas of a tumor, could go undetected15. Novel platforms have been developed for multiplex analysis of FFPE tissues, such as multiplex IHC, imaging mass cytometry, and CO-Detection by indEXing (CODEX) that can be used to detect multiple markers simultaneously within a tissue section16. Immune cells in the TME are being widely studied to find the best biomarkers for immunotherapy. However, multiplex techniques and automated image analysis pose hurdles of their own.
Our laboratory has extensive experience in multiplex IHC staining using the Opal/Tyramide signal amplification (TSA) method and has automated this on a&#160;IHC platform (see the Table of Materials)17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31. We have optimized immune cell panels for the detection of different subsets of lymphocytes, myeloid cells, and dendritic cells (DCs). Tissues that contain dense immune cell areas - for lymphocytes or complex cell morphologies (i.e., myeloid cells and DCs) - are particularly challenging to analyze, with a risk of over- or underestimating the number of immune cells present. To overcome this problem, ImmuNet analysis software was developed by our group32, and this machine-learning pipeline improved the quality of the detection of these different types of immune cells immensely. A detailed protocol from obtaining the FFPE material to the analysis of immune cell densities in different tissue compartments and distances between immune cell types is described here.
This protocol outlines how the multiplex IHC panels are performed at the Radboud University Medical Center since the implementation of the digital pathology imager in 2022. The described multiplex IHC panels can be used for different carcinomas (e.g., lung, prostate, colorectal, bladder, breast) with the use of a pan-cytokeratin antibody as a tumor marker or for melanoma with the use of melanocyte-associated antibodies as tumor markers. These multiplex IHC protocols have been carefully optimized in terms of primary antibody concentration, fluorophore combinations, and the sequence of the staining procedure. We and others have described multiplex IHC panel optimization earlier17,33,34,35. Multiplex IHC panels can be adapted, but the described analysis pipelines need to be evaluated and potentially adjusted or retrained accordingly. The described seven-color multiplex IHC protocols make use of the Opal fluorophores Opal480, Opal520, Opal570, Opal620, Opal690, Opal780, and 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), so that easy unmixing and fast scanning on the imager is enabled with &#34;Multispectral One Touch ImmunoFluorescence&#34; (MOTiF). Nine-color staining and scanning is not described in this protocol as this requires even more finetuning of the experimental setup and another mode of scanning on the imager that uses the liquid crystal tunable filter.

저자 스포트라이트: 종양의 면역 세포 환경에 대한 통찰력 확보

종양 미세환경의 공간 면역 세포 풍경에 대한 다중 면역조직화학적 분석

Read this Scientific Article Protocol about Multiplex Immunohistochemical Analysis of the Spatial Immune Cell Landscape of the Tumor Microenvironment at JoVE.com

이 프로토콜은 다중 면역조직화학을 사용하여 종양 미세환경의 면역 세포 특성 분석을 수행하는 방법을 자세히 설명합니다.

The immune cell landscape of the tumor microenvironment potentially contains information for the discovery of prognostic and predictive biomarkers. ...

우리의 목표는 종양 미세환경 내에서 면역 세포의 양, 유형 및 위치를 식별하는 것입니다. 면역 화학 분야에서는 최근 몇 년 동안 기술이 크게 발전했습니다. 멀티플렉스 면역화학 기술의 발전으로 더 많은 마커를 신뢰성 있게 연구할 수 있습니다.현재의 실험적 과제는 종양 샘플 내에서 특정 유형의 면역 세포를 시각화하는 것인데, 이는 다중 면역 화학 방법을 사용하여 극복되었습니다. 그러나 이러한 이미지의 정확한 자동 분석은 여전히 우리가 작업하고 있는 과제입니다. 원발성 종양과 전이성 종양 사이의 면역 세포 환경 차이는 어떤 종양 내재적 특성이 이러한 차이를 유발하는지, 그리고 이러한 차이가 면역 체계를 표적으로 하는 치료법에 어떤 의미가 있는지와 같은 질문을 생성합니다.우리의 탐색적 연구와 더불어, 우리는 종양의 면역 세포 환경이 다양한 유형의 항암 요법에 의해 어떻게 영향을 받는지, 면역 세포 환경이 치료 결과를 예측할 수 있는지 여부와 같은 임상적으로 관련된 질문에 초점을 맞출 것입니다.

multiplex-immunohistochemical-analysis-spatial-immune-cell-landscape

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Multiplex Immunohistochemical Analysis of the Spatial Immune Cell Landscape of the Tumor Microenvironment

1.4K 조회수.  Radboudumc. 우리의 목표는 종양 미세환경 내에서 면역 세포의 양, 유형 및 위치를 식별하는 것입니다. 면역 화학 분야에서는 최근 몇 년 동안 기술이 크게 발전했습니다. 멀티플렉스 면역화학 기술의 발전으로 더 많은 마커를 신뢰성 있게 연구할 수 있습니다.현재의 실험적 과제는 종양 샘플 내에서 특정 유형의 면역 세포를 시각화하는 것인데, 이는 다중 면역 화학 방법을 사용하?...

비디오: 저자 스포트라이트: 종양의 면역 세포 환경에 대한 통찰력 확보

The immune cell landscape of the tumor microenvironment potentially contains information for the discovery of prognostic and predictive biomarkers. Multiplex immunohistochemistry is a valuable tool to visualize and identify different types of immune cells in tumor tissues while retaining its spatial information. Here we provide detailed protocols to analyze lymphocyte, myeloid, and dendritic cell populations in tissue sections. Starting from cutting formalin-fixed paraffin-embedded sections, automatic multiplex staining procedures on an automated platform, scanning of the slides on a multispectral imaging microscope, to the analysis of images using an in-house-developed machine learning algorithm ImmuNet. These protocols can be applied to a variety of tumor specimens by simply switching tumor markers to analyze immune cells in different compartments of the sample (tumor versus invasive margin) and apply nearest-neighbor analysis. This analysis is not limited to tumor samples but can also be applied to other (non-)pathogenic tissues. Improvements to the equipment and workflow over the past few years have significantly shortened throughput times, which facilitates the future application of this procedure in the diagnostic setting.

This protocol describes in detail how immune cell characterization of the tumor microenvironment using multiplex immunohistochemistry is carried out.