Wei Sheng Tan, Luanne Chiang Xue Yen, Xinyi Lee ve Yingying Chung'a, kriyoprezervasyondan sonra 32 hESC'den türetilmiş fotoreseptör progenitörlerinin hazırlanması için teknik yardım sağladıkları için teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Ulusal Tıbbi Araştırma Konseyi Genç Araştırmacı Araştırma Hibe Ödülü (NMRC/OFYIRG/0042/2017) ve Ulusal Araştırma Vakfı24'üncü Rekabetçi Araştırma Programı Hibesi (CRP24-2020-0083) tarafından HGT'ye verilen hibelerle desteklenmiştir.

İn vivo deneyler, SingHealth Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) ve Görme ve Oftalmoloji Araştırmaları Derneği (ARVO) tarafından Oftalmik ve Görme Araştırmalarında hayvanların kullanımına ilişkin Bildiri tarafından onaylanan kılavuzlara ve protokole uygun olarak yapılmıştır. Yavrular, siklosporin (260 g / L) içeren içme suyuyla beslenerek P17'den (nakil öncesi) P30'a (nakil sonrası) kadar immünosuprese edildi.
1. Kriyoprezervasyon sonrası 32. gün hESC'den türetilen fotoreseptör progenitörlerinin hazırlanması
<ol><li>37 °C'lik bir su banyosunda ön ısıtma fotoreseptör farklılaşma ortamı (PRDM).</li>
	<li>Sıvı nitrojenden 32. gün hESC'den türetilmiş fotoreseptör progenitör hücreleri içeren bir kriyoviyal alın. Kuru buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Cryovial'i 37 °C'de bir su banyosunda 3-5 dakika çözdürün. Gün 32 hücreyi 1 mL PRDM'de tekrar süspanse edin ve 4 dakika boyunca 130 x g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı çıkarın ve hücreleri 1 mL PRDM'de yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Hücre sayımı için karışımın 10 μL'sini çıkarın. Üreticinin talimatlarına göre% 0.2 tripan mavisi kullanarak hücreleri karıştırın. Hücre karışımını hücre sayma haznesine pipetleyin slayt. Otomatik hücre sayacı ile hücre sayısını ve canlılığını belirleyin.</li>
	<li>Hücre canlılığı% 70'in üzerinde olduğunda bir sonraki adıma geçin. Kalan hücre süspansiyonunu 4 dakika boyunca 130 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve transplantasyon için 3 x 105 hücre / μL konsantrasyonunda PRDM'deki hücre peletini yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Görünür hücre kümelerini gözlemleyin. Görünür hücre kümelenmesi gözlenene kadar mikrofüj tüpünde 10 μL'lik bir pipet ucu kullanarak hücre kümelerini tekrar tekrar süspanse edin. Hücre çözeltisinin iğneden ekstrüzyonunu gözlemlemek için 33G enjeksiyon şırıngasına yükleyin.</li>
</ol>2. rd10 farelerde hESC'lerin retina altı verilmesi
<ol><li>Hayvanların hazırlanması<ol><li>İntraperitoneal yaklaşımla 27G iğneye bağlı 1 mL'lik bir tüberkülin şırıngasında ketamin (20 mg/kg vücut ağırlığı) ve ksilazin (2 mg/kg vücut ağırlığı) kombinasyonu kullanarak fareyi (P20, erkek/dişi, 3-6 g) uyuşturun. Önleyici bir analjezik olarak fareye deri altı buprenorfin (0.05 mg / kg) enjeksiyonu uygulayın.</li>
		<li>Anesteziyi uyguladıktan sonra, pupil dilatasyonu için% 1 tropikamid ve% 2.5 fenilefrin damlatın. Gözün kuruluğunu ve anesteziye bağlı kataraktı önlemek için korneaya oftalmik bir jel uygulayın.</li>
		<li>Tamamen uyuşturulana kadar fareyi boş bir kafese yerleştirin. Pençe yastığını sıkıştırarak uygun anestezi seviyesini değerlendirin ve hayvanın sert çimdiklemeye tepki verip vermediğini onaylayın.</li>
		<li>Fare tamamen uyuşturulduğunda, hayvanı 38 °C'ye ayarlanmış ılık bir ped üzerine yerleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Hücrelerin retina altı iletimi<ol><li>Burada yapıldığı gibi 1 portlu trans-vitreal pars plana yaklaşımını kullanmak için steril bir ortamda retina altı enjeksiyon yapın. Enjeksiyonu gerçekleştirmek için doğrudan ışık yoluna sahip dik bir ameliyat mikroskobu kullanın.</li>
		<li>İğne göbeğini çıkararak 10 μL'lik cam şırıngayı hazırlayın. 33G kör iğneyi cam şırıngaya monte edin. Metal göbek kapağını alın ve iğneyi şırıngaya dikkatlice sabitleyin.</li>
		<li>İğnede herhangi bir sızıntı belirtisi ve açıklığı olup olmadığını kontrol etmek için damıtılmış suyla yıkayın. Şırıngayı boşaltın ve dikkatlice yan tarafa koyun.</li>
		<li>Anestezi uygulanmış fareyi, tedavi gözü doğrudan mikroskobun hedefine bakacak şekilde bir yastığın üzerine yerleştirin. % 0.5 proparakain hidroklorür uygulayın ve 30 saniye bekleyin. Göze 150 μL oftalmik jel uygulayın ve üzerine yuvarlak bir örtü yerleştirin.</li>
		<li>Kornea, iris, göz bebeği, lens ve konjonktivayı gözlemleyerek gözün kaba bir muayenesini yapın. Göz bebeği aracılığıyla, odak düzlemini ayarlayarak fare gözünün fundusunu görselleştirin. Optik başlık göz bebeğinin ortasına yerleştirilene kadar başlığı ayarlayın ve yastığın üzerine uygun şekilde konumlandırarak başın hareketini en aza indirin.</li>
		<li>Düzgün bir hücre süspansiyonu elde etmek için tüpün tabanına hESC'lerle birden çok kez hafifçe vurun. 10 μL cam mikrolitrelik şırıngayı 33G künt iğne ile kullanarak 2 μL hücre/ortam çekin. Şırıngada hücre yerleşimini / kümelenmesini önlemek için enjeksiyondan hemen önce hücreleri geri çekin.</li>
		<li>30G tek kullanımlık bir iğne kullanarak, limbusun 2 mm arkasında bir sklerektomi yarası yapın. Lense dokunmamak için iğnenin açısını ~45°'de tutun. İğnenin ucu gözde görüntülendikten sonra iğneyi yavaşça geri çekin. İğne batmasını önlemek için kullandıktan sonra iğneyi keskin çöp kutusuna atın.</li>
		<li>Cam şırıngayı alın ve künt iğneyi sklerektomi yarasına yerleştirin. Lense dokunmadan, künt iğneyi giriş yarasının karşı retinasına ulaşana kadar ilerletin. Kanamayı önlemek için enjeksiyon alanının ana retina kan damarlarından arınmış olduğundan emin olun.</li>
		<li>Sklera üzerinde bir basınç dalı görülene kadar retinaya hafifçe nüfuz edin. Hücrelerin vitreus boşluğuna sızmasını önlemek için iğnenin kör ucunu skleraya paralel tutun.</li>
		<li>Şırınga üzerinde hafif bir basınç korunurken retina altı boşluğa 2 μL hücre süspansiyonu veya PRDM ortamı (kontrol) yavaşça enjekte edin. Başarılı bir enjeksiyonla, enjeksiyon bölgesinde görünür bir bleb (yani, içinde hücre süspansiyonu/ortamı bulunan yükseltilmiş retina) oluşturulmalıdır. NOT: Retina yırtılmasını ve iğne ucundaki hücrelerin tıkanmasını önlemek için enjeksiyon sırasında sadece hafif basınç kullanılmalıdır.</li>
		<li>Blebi onayladıktan sonra, hücrelerin yerleşmesi için 10 saniye bekleyin. İğneyi gözden yavaşça geri çekin.</li>
	</ol></li>
	<li>İntraoperatif optik koherens tomografi (OCT) bleb taraması (isteğe bağlı)<ol><li>Kafayı yavaşça hareket ettirerek kabarmayı mikroskop altında görselleştirmek için fare gözünü konumlandırın. Kafayı nazikçe tutarak pozisyonu sabitleyin. Ek bir göz bebeği genişlemesine gerek yoktur. Kapak fişini ve gözdeki jeli çıkarmayın. Blebi görselleştirmek için net bir optik ortam sağlar.</li>
		<li>Ameliyat mikroskobunun yerleşik iOCT işlevini kullanarak intraoperatif OCT'yi gerçekleştirin.</li>
		<li>OCT ekranında Küp seçeneğine basın ve Ok düğmelerine basarak tarama alanını bleb üzerine konumlandırın. En iyi OCT kalitesi için Merkezleme ve Odaklanma'yı kaydırarak OCT'yi ayarlayın. Bleb bölgesinin OCT taramasını almak için Yakala/Tara'ya basın. Taramaların kalitesini kontrol etmek için görüntüleri inceleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Kurtarma<ol><li>Kapak fişini çıkarın ve jeli gazlı bezle gözden temizleyin. Enfeksiyonu önlemek için enjeksiyondan sonra bir kez antibiyotik merhem sürün.</li>
		<li>Sternal yaslanmanın sürdürülmesi ve ev kafesine geri dönmesi için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar hayvanın ılık bir ışık altında anesteziden kurtulmasına izin verin. Hayvanı enjeksiyondan sonra en az 3 gün boyunca iltihaplanma, enfeksiyon ve sıkıntı belirtileri açısından izleyin. NOT: 150 W sıcak ışık, hayvan kafesinden en az 30 cm uzakta olmalı ve yanık yaralanmasını önlemek için dikkatli olunmalıdır.</li>
		<li>Deri altı buprenorfin enjeksiyonu (0.05 mg / kg) 1 gün boyunca 8 saatte bir veya veteriner hekimin tavsiyesine göre uygulayın. Gözde iltihaplanma veya enfeksiyon görülürse, uygun tedavi için bir veteriner hekime danışın.</li>
	</ol></li>
	<li>Aletlerin temizlenmesi ve sterilizasyonu<ol><li>10 μL cam mikrolitre şırıngayı ve 33G kör iğneyi %100 etanol 10x ile yıkayın. Şırıngayı damıtılmış suyla yakarak etanolü yıkayın.</li>
		<li>Cam şırıngayı ve iğneyi sökün. Şırıngayı saklamak için kurutun.</li>
	</ol></li>
</ol>

Canlandırıcı Görme: Retina Dejenerasyonu için Kök Hücre Tedavisi

Hwee Goon Tay, Alder Therapeutics AB'nin kurucu ortağıdır. Diğer yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.

Subretinal enjeksiyon, RPE ve retina hastalıklarını tedavi etmek için hücre süspansiyon transplantasyonu için kullanılmıştır 23,25,26,27,28,31,40. Bu yaklaşım, kemirgen çalışmalarında sadece hücre nakli ve gen tedavisi yaklaşımları için değil, aynı zamanda retina hast...

Kalıtsal retina hastalıkları ve yaşa bağlı makula dejenerasyonu, fotoreseptör hücre kaybına ve sonunda körlüğe yol açar. Retina fotoreseptörü, fototransdüksiyondan (yani ışığın nöronal sinyallere dönüştürülmesinden) sorumlu özel hücrelerden oluşan retinanın dış segment tabakasıdır. Çubuk ve koni fotoreseptör hücreleri, retina pigmentli tabakaya (RPE) bitişiktir1. Hücre kaybını telafi etmek için fotoreseptör hücre replasman tedavisi ortaya çıkan ve gelişen bir terapötik yaklaşım olmuştur. Hasarlı fotoreseptör hücrelerini restore etmek için embriyonik kök hücreler (ESC'ler)2,3,4, indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) kaynaklı RPE hücreleri ve retinal progenitör hücreler (RPC'ler)4,5,6,7,8 kullanıldı. Retina ve RPE arasında sınırlı bir boşluk olan sub-retinal boşluk, çevresi nedeniyle hasarlı fotoreseptör hücreleri, RPE ve Mueller hücrelerini değiştirmek için bu hücreleri biriktirmek için çekici bir yerdir 9,10,11.
Gen ve hücre tedavileri, klinik öncesi çalışmalarda çeşitli retina hastalıkları için rejeneratif tıp için retina altı boşluğu kullanmaktadır. Bu, genin veya gen düzenleme araçlarının fonksiyonel kopyalarının anti-sens oligonükleotid tedavisi12,13 veya CRISPR/Cas9 veya adeno-ilişkili virüs (AAV) tabanlı strateji 14,15,16 yoluyla baz düzenleme, materyallerin implantasyonu (örneğin, RPE tabakası, retina protezleri 17,18,19) ve farklılaşmış kök hücre kaynaklı retinal organoidler 20,21,22 retina ve RPE ile ilişkili hastalıkları tedavi etmek için. RPE65 ile ilişkili Leber konjenital amauroz (LCA) 23,24, CNGA3 ile ilişkili akromatopsi25, MERTK ile ilişkili retinitis pigmentosa26, koroideremi 27,28,29,30 tedavi etmek için retina altı boşlukta hESC-RPE 31 kullanan klinik çalışmalar etkili bir yaklaşım olduğu kanıtlanmıştır. Hücrelerin hasarlı alanın çevresine doğrudan enjeksiyonu, uygun bölgede hücre yerleşimi, sinaptik entegrasyon ve nihai görsel iyileşme şansını büyük ölçüde artırır.
İnsan ve iri gözlü modellerde (yani domuz 32,33,34,35, tavşan36,37,38,39,40 ve insan olmayan primat 41,42,43) retina altı enjeksiyon yapılmış olsa da, murin modelinde bu tür bir enjeksiyon, göz küresi boyutunun kısıtlanması ve muazzam olması nedeniyle hala zordur. fare gözünü işgal eden lens 44,45,46. Bununla birlikte, genetiği değiştirilmiş modeller büyük hayvanlarda (yani tavşanlarda ve insan olmayan primatlarda) değil, yalnızca küçük hayvanlarda kolayca bulunur, bu nedenle farelerde retina altı enjeksiyon, retinal genetik bozukluklarda yeni terapötik yaklaşımları araştırmak için dikkat çekmektedir. Hücreleri veya AAV'leri retina altı boşluğa iletmek için trans-kornea yolu, trans-skleral yol ve pars plana yolu olmak üzere üç ana yaklaşım kullanılmaktadır (Bkz. Şekil 2). Transkorneal ve transskleral yollar katarakt oluşumu, sineşi, koroid kanaması ve enjeksiyon bölgesinden reflü ile ilişkilidir 11,44,45,47,48,49. Enjeksiyon işleminin doğrudan görselleştirilmesi olarak pars plana yaklaşımını benimsedik ve enjeksiyon bölgesi mikroskop altında gerçek zamanlı olarak elde edilebiliyor.
Yakın zamanda, rekombinant insan retinasına özgü laminin izoformu LN523 kullanılarak ksenofree, kimyasal olarak tanımlanmış koşullar altında insan embriyonik kök hücrelerini (hESC'ler) fotoreseptör progenitörlerine farklılaştırabilen bir yöntem tanımladık. LN523'ün retinada mevcut olduğu tespit edildiğinden, insan retinasının hücre dışı matriks nişinin in vitro olarak özetlenebileceğini ve böylece hESC'lerden36 fotoreseptör farklılaşmasını destekleyebileceğini varsaydık. Tek hücreli transkriptomik analiz, koni-çubuk homeobox ve recoverin'i birlikte eksprese eden fotoreseptör progenitörlerinin 32 gün sonra üretildiğini gösterdi. Otozomal insan retinitis pigmentosa'yı taklit eden bir retina dejenerasyonu 10 (rd10) mutant fare modeli, 32 hESC'den türetilen fotoreseptör progenitörlerinin etkinliğini in vivo olarak değerlendirmek için kullanıldı. hESC'den türetilen fotoreseptör progenitör hücreler, fotoseptör disfonksiyonu ve dejenerasyonunun devam ettiği P20'de rd10 farelerin retina altı boşluğuna enjekte edildi36. Burada, kriyoprezervasyon sonrası hESC türevi fotoreseptör progenitörlerinin hazırlanması ve rd10 farelerin retina altı boşluğuna verilmesi için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Bu yöntem aynı zamanda farelerde AAV'leri, hücre süspansiyonlarını, peptitleri veya kimyasalları retina altı boşluğa uygulamak için de kullanılabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.3% Tobramycin</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>NDC &#160;0078-0813-01</td>
			<td>Tobrex (3.5 g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3% Tobramycin and 0.1% Dexamethasone</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>NDC 0078-0876-01</td>
			<td>Tobradex (3.5 g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Proparacaine hydrochloride</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>NDC 0998-0016-15</td>
			<td>0.5% Alcaine (15 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Tuberculin syringe</td>
			<td>Turemo</td>
			<td>SS01T2713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Tropicamide</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>NDC 0998-0355-15</td>
			<td>1% Mydriacyl (15 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Phenylephrine hydrochloride</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>NDC 0998-0342-05</td>
			<td>2.5% Mydfrin (5 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G Disposable needle</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>305128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33 G, 20 mm length blunt needles</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Cell Counter</td>
			<td>NanoEnTek</td>
			<td>Model: Eve</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 without Vitamin A</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12587001</td>
			<td>2%36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Ceva</td>
			<td></td>
			<td>Vetergesic vet (0.3 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CKI-7</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0742</td>
			<td>5 &#181;M36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclosporine</td>
			<td>Novartis</td>
			<td></td>
			<td>260 g/L in drinking water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells</td>
			<td>DUKE-NUS Medical School</td>
			<td></td>
			<td>Human embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>Winner Industries Co. Ltd.</td>
			<td>1SNW475-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow Minimum Essential Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11710&#8211;035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hESC cell line H1</td>
			<td>WiCell Research Institute</td>
			<td>WA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02-50</td>
			<td>10 ng/mL36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ciliary neurotrophic factor (CNTF)</td>
			<td>Prospec-Tany Technogene</td>
			<td>CYT-272</td>
			<td>10 ng/mL36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride (100 mg/mL)</td>
			<td>Ceva Sant&#233; Animale</td>
			<td>KETALAB03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LN-521</td>
			<td>Biolamina</td>
			<td>LN521-02</td>
			<td>1 &#181;g36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mFreSR</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlitre glass syringe (10 mL)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7653-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S2215</td>
			<td>10 &#181;M36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A13707-01</td>
			<td>1%36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids (NEAA)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140&#8211;050</td>
			<td>1x36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NutriStem XF Media</td>
			<td>Satorius</td>
			<td>05-100-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>OPMI LUMERA 700</td>
			<td>With Built-in iOCT function</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml)</td>
			<td>DUKE-NUS Medical School</td>
			<td></td>
			<td>See media composition36. Basal Medium, 10 &#181;M DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 &#181;M Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360&#8211;070</td>
			<td>1 mM36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rd10 mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>B6.CXB1-Pde6brd10/J mice</td>
			<td>Gender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>0695/50</td>
			<td>0.5 &#181;M36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Cover Slip (12 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4317</td>
			<td>0.5 &#181;M36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vidisic Gel (10 g)</td>
			<td>Dr. Gerhard Mann</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine hydrochloride (20 mg/mL)</td>
			<td>Troy Laboratories</td>
			<td>LI0605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21985&#8211;023</td>
			<td>0.1 mM36</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sub-retinal delivery of human embryonic stem cell derived photoreceptor progenitors in rd10 mice

İnsan pluripotent kök hücreleri kullanılarak fotoreseptör hücrelerin rejenerasyonu, hem kalıtsal hem de yaşlanan retina hastalıklarının ileri evrelerde tedavisi için umut verici bir tedavidir. İnsan rekombinant retinaya özgü laminin izoform matrisinin, insan embriyonik kök hücrelerinin (hESC'ler) fotoreseptör progenitörlerine farklılaşmasını destekleyebildiğini gösterdik. Ek olarak, bu hücrelerin subretinal enjeksiyonu, rd10 kemirgen ve tavşan modellerinde kısmi restorasyon göstermiştir. Subretinal enjeksiyonun, hedef boşluğa yakınlığı nedeniyle gözün fotoreseptör hücrelerine ve retina pigmentli epitel (RPE) tabakasına farmasötik bileşikler vermek için kullanılan yerleşik bir yöntem olduğu bilinmektedir. Ayrıca, retina hastalıklarını tedavi etmek için adeno ile ilişkili viral vektörleri retina altı boşluğa iletmek için de kullanılmıştır. Fare modelindeki farmasötik bileşiklerin ve hücrelerin retina altı iletimi, murin göz küresinin boyutundaki kısıtlama nedeniyle zordur. Bu protokol, genetik retinitis pigmentosa mutant, rd10 farelerinde hESC'den türetilen fotoreseptör progenitör hücrelerin enjeksiyon için hazırlanması ve bu hücrelerin retina altı dağıtım tekniği için ayrıntılı prosedürü açıklar. Bu yaklaşım, hedeflenen bölgeye, özellikle de fotoreseptör dejenerasyonuna yol açan hastalıkların meydana geldiği retinanın dış nükleer tabakasına hücre tedavisine izin verir.

Inherited retinal diseases and age-related macular degeneration lead to photoreceptor cell loss and eventual blindness. The retinal photoreceptor is the outer segment layer of the retina comprised of specialized cells responsible for phototransduction (i.e., conversion of light to neuronal signals). The rod and cone photoreceptor cells are adjacent to the retinal pigmented layer (RPE)1. Photoreceptor cell replacement therapy to compensate the cell loss has been an emerging and developing therapeutic approach. Embryonic stem cells (ESCs)2,3,4, induced pluripotent stem cells (iPSCs)-derived RPE cells, and retinal progenitor cells (RPCs)4,5,6,7,8 were used to restore the damaged photoreceptor cells. Sub-retinal space, a confined space between the retina and the RPE, is an attractive location to deposit these cells to replace damaged photoreceptor cells, RPE, and Mueller cells due to its vicinity9,10,11.
Gene and cell therapies have been utilizing the sub-retinal space for regenerative medicine for various retinal diseases in pre-clinical studies. This includes the delivery of functional copies of the gene or gene editing tools in the form of either anti-sense oligonucleotide therapy12,13 or CRISPR/Cas9 or base editing via adeno-associated virus (AAV) based strategy14,15,16, implantation of materials (e.g., RPE sheet, retinal prosthetics17,18,19) and differentiated stem cell-derived retinal organoids20,21,22 to treat retinal and RPE-related diseases. Clinical trials using hESC-RPE31 in the sub-retinal space to treat RPE65-associated Leber congenital amaurosis (LCA)23,24, CNGA3-linked achromatopsia25, MERTK-associated retinitis pigmentosa26, choroideremia27,28,29,30 have been proven to be an effective approach. Direct injection of cells to the vicinity of the damaged area greatly improves the chance of cell settlement at the appropriate region, synaptic integration, and eventual visual improvement.
Even though sub-retinal injection in human and large-eyed models (i.e., pig32,33,34,35, rabbit36,37,38,39,40, and non-human primate41,42,43) has been&#160;established, such injection in the murine model is still challenging due to the constrain of the eyeball size and enormous lens occupying the mouse eye44,45,46. However, genetically modified models are only readily available in small animals and not in large animals (i.e., rabbits and non-human primates), therefore sub-retinal injection in mice draws attention to investigate novel therapeutic approaches in retinal genetic disorders. Three major approaches are being used to deliver cells or AAVs into the sub-retinal space, namely the trans-corneal route, trans-scleral route, and the pars plana route (See Figure 2). Trans-corneal and trans-scleral routes are associated with cataract formation, synechiae, choroidal bleeding, and reflux from the injection site11,44,45,47,48,49. We adopted the pars plana approach as a direct visualization of the injection process, and the injection site can be achieved in real-time under the microscope.
We recently described a method that can differentiate human embryonic stem cells (hESCs) into photoreceptor progenitors under xenofree, chemically defined conditions using recombinant human retina-specific laminin isoform LN523. Since LN523 was found to be present in the retina, we hypothesized that the extracellular matrix niche of the human retina could be recapitulated in vitro and thereby support photoreceptor differentiation from the hESCs36. Single-cell transcriptomic analysis showed that photoreceptor progenitors co-expressing cone-rod homeobox and recoverin were generated after 32 days. A retinal degeneration 10 (rd10) mutant mouse model that mimics autosomal human retinitis pigmentosa was used to evaluate the efficacy of the day 32 hESC-derived photoreceptor progenitors in-vivo. The hESC-derived photoreceptor progenitor cells were injected into the sub-retinal space of rd10 mice at P20, where photoceptor dysfunction and degeneration are ongoing36. Here, we describe a detailed protocol for the preparation of the post-cryopreserved hESC-derived photoreceptor progenitors and delivery into the sub-retinal space of rd10 mice. This method can also be used to administer AAVs, cell suspensions, peptides, or chemicals into the sub-retinal space in mice.

Yazar Spotlight: Görme Restorasyonunu İlerletmek - Retina Hastalıkları için Kök Hücre Bazlı Tedavi 

Rd10 Farelerde İnsan Embriyonik Kök Hücre Kaynaklı Fotoreseptör Progenitörlerinin Sub-Retinal Verilmesi

My research focuses on the development of stem cell based therapy for advanced stages of retinal diseases that cause photoreceptor degeneration. The goal of our research is to replace the loss of photoreceptors in patients with clinically safe and functional photoreceptor progenitors with the aim of improving their visual acuity or even restoring their vision. The main preclinical model is mice, but their small sized eyeball make it challenging to inject materials, especially under the retina.Developing the skill to perform successful subretinal injections requires patience and perseverance. We have successfully developed a laminin base for the receptor differentiation method that is able to generate photoreceptor progenitors in 32 days. The subretinal transplantations of this photoreceptor progenitors cell suspensions in the rodents resulted in synaptic connectivity between the holes and graft in the eyes.This has led to partial visual restoration. Our approach is simple, the right visualization helps the surgeon handle the needle to the area of interest.

10 μL'lik cam şırınga, üreticinin talimatlarına göre monte edilmiştir (Şekil 1) ve hücre süspansiyonunu/ortamını iletmek için kullanılan kör iğne Şekil 1B'de gösterilmektedir. Subretinal enjeksiyon için farklı yaklaşımlar Şekil 2'de gösterilmektedir. Bu protokolde pars plana yaklaşımını açıklıyoruz (Şekil 2C). Bir cam şırıngaya monte edilen künt iğne, bir sklerotomi...

Watch this Scientific Journal Video about Advancing Vision Restoration — Stem Cell-Based Therapy for Retinal Diseases at JoVE.com

Kriyoprezervasyon sonrası hESC kaynaklı fotoreseptör progenitör hücrelerin hazırlanması ve bu hücrelerin rd10 farelerde retina altı verilmesi için ayrıntılı bir protokol tanımladık.

Regeneration of photoreceptor cells using human pluripotent stem cells is a promising therapy for the treatment of both hereditary and aging retinal ...

Araştırmam, fotoreseptör dejenerasyonuna neden olan retina hastalıklarının ileri evreleri için kök hücre bazlı tedavinin geliştirilmesine odaklanmaktadır. Araştırmamızın amacı, klinik olarak güvenli ve fonksiyonel fotoreseptör progenitörleri olan hastalarda fotoreseptör kaybını, görme keskinliklerini artırmak ve hatta görüşlerini geri kazanmak amacıyla yerine koymaktır. Ana preklinik model farelerdir, ancak küçük boyutlu göz küreleri, özellikle retina altına malzeme enjekte etmeyi zorlaştırır.Başarılı subretinal enjeksiyonlar gerçekleştirme becerisini geliştirmek sabır ve azim gerektirir. Reseptör farklılaşma yöntemi için 32 günde fotoreseptör progenitörleri üretebilen bir laminin bazını başarıyla geliştirdik. Bu fotoreseptör progenitörlerinin kemirgenlerdeki hücre süspansiyonlarının subretinal transplantasyonları, gözlerdeki delikler ve greft arasında sinaptik bağlantı ile sonuçlandı.Bu, kısmi görsel restorasyona yol açmıştır. Yaklaşımımız basittir, doğru görselleştirme cerrahın iğneyi ilgilenilen alana tutmasına yardımcı olur.

sub-retinal-delivery-human-embryonic-stem-cell-derived-photoreceptor

Research

JoVE Journal

Medicine

Sub-Retinal Delivery of Human Embryonic Stem Cell Derived Photoreceptor Progenitors in rd10 Mice

669 Görüntüleme.  Singapore Eye Research Institute. Araştırmam, fotoreseptör dejenerasyonuna neden olan retina hastalıklarının ileri evreleri için kök hücre bazlı tedavinin geliştirilmesine odaklanmaktadır. Araştırmamızın amacı, klinik olarak güvenli ve fonksiyonel fotoreseptör progenitörleri olan hastalarda fotoreseptör kaybını, görme keskinliklerini artırmak ve hatta görüşlerini geri kazanmak amacıyla yerine koymaktır. Ana preklinik model farelerdir, ancak küçük boyutlu göz küreleri, özellikle retina altı...

Video: Yazar Spotlight: Görme Restorasyonunu İlerletmek - Retina Hastalıkları için Kök Hücre Bazlı Tedavi 

Regeneration of photoreceptor cells using human pluripotent stem cells is a promising therapy for the treatment of both hereditary and aging retinal diseases at advanced stages. We have shown human recombinant retina-specific laminin isoform matrix is able to support the differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) to photoreceptor progenitors. In addition, sub-retinal injection of these cells has also shown partial restoration in the rd10 rodent and rabbit models. Sub-retinal injection is known to be an established method that has been used to deliver pharmaceutical compounds to the photoreceptor cells and retinal pigmented epithelial (RPE) layer of the eye due to its proximity to the target space. It has also been used to deliver adeno-associated viral vectors into the sub-retinal space to treat retinal diseases. The sub-retinal delivery of pharmaceutical compounds and cells in the murine model is challenging due to the constraint in the size of the murine eyeball. This protocol describes the detailed procedure for the preparation of hESC-derived photoreceptor progenitor cells for injection and the sub-retinal delivery technique of these cells in genetic retinitis pigmentosa mutant, rd10 mice. This approach allows cell therapy to the targeted area, in particular the outer nuclear layer of the retina, where diseases leading to photoreceptor degeneration occur.

We describe a detailed protocol for the preparation of post-cryopreserved hESC-derived photoreceptor progenitor cells and the sub-retinal delivery of these cells in rd10 mice.

Tıp

Reviving the Cryopreserved Day 32 hESC-Derived Photoreceptor Progenitors

Begin by placing PRDM in a water bath set at 37 degrees Celsius. Remove a cryovial containing day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells from liquid nitrogen, and keep it on dry ice. Then thaw the cryovial in a water bath at 37 degrees Celsius for three to five minutes.Re-suspend the cells in one milliliter of PRDM. Centrifuge them at 130G for four minutes After removing the supernatant, re-suspend the pellet in one milliliter of PRDM. To count the cells, take 10 microliters of the cell suspension and mix with 0.2%trypan blue, following the manufacturer's instructions.Pipette the cell mixture into the cell counting chamber slide, and determine the cell number and viability using an automated cell counter. If cell viability is above 70%centrifuge the remaining cell suspension at 130G for four minutes. Remove the supernatant and re-suspend the cell pellet in PRDM for transplantation.Using a 10 microliter pipette tip, re-suspend cell clumps in the microfuge tube until no clumps are visible. Load the suspension into a 33-gauge injection syringe and confirm the extrusion of cell solution through the needle.

Dondurularak Saklanmış Gün 32 hESC'den Elde Edilen Fotoreseptör Progenitörlerinin Canlandırılması

Sub-Retinal Delivery of the hESC-Derived Photoreceptor Progenitor Cells in rd10 Mice

Sub-Retinal Delivery of the hESC-Derived Photoreceptor Progenitor Cells in  rd10  Mice  

To begin, take an anesthetized mouse and apply one drop of 1%tropicamide and 2.5%phenylephrine into the eye to dilate the pupil. Then apply an ophthalmic gel to the cornea to prevent dryness and anesthesia induced cataracts. Next, set up an upright operating microscope with a direct light path in a sterile environment to perform the subretinal injection.To prepare the 10 microliter glass syringe, detach the needle hub and attach the 33 gauge blunt needle. Take the metal hub cover and securely fasten the needle onto the syringe. Flush the needle with distilled water to test leakage and needle patency.Then empty the syringe and set it aside carefully. Next, position the anesthetized mouse on a cushion and orient the treatment eye toward the microscope's objective. Apply 0.5%proparacaine hydrochloride and wait for 30 seconds.Then apply 150 microliters of ophthalmic gel to the eye and affix a round cover slip. Perform a preliminary eye examination observing the cornea, iris, pupil, lens, and conjunctiva. Adjust the focal plane to visualize the fundus of the mouse eye through the pupil.Then align the head so that the optic head aligns with the center of the pupil. Afterwards, tap the base of the tube containing HESC derived photoreceptor progenitors to get a uniform cell suspension. Using a 10 microliter glass microliter syringe with a 33 gauge blunt needle, draw two microliters of cell mixture.Use a 30 gauge disposable needle to create a sclerectomy wound positioned two millimeters behind the limbus. Maintain the needle's angle at approximately 45 degrees to prevent contact with the lens. Once the needle tip becomes visible within the eye, carefully retract the needle.Discard the used needle into a sharp bin to prevent needle prick injuries. Now take the glass syringe and insert the blunt needle into the sclerectomy wound. Advance the blunt needle without touching the lens until it reaches the opposite retina of the entry wound.Gently penetrate the retina until a pressure branch on the sclera is seen. Then inject two microliters of the cell suspension or PRDM media into the subretinal space while maintaining gentle pressure on the syringe. The formation of a visible bleb indicates successful injection.Wait 10 seconds to allow the cells to settle down. Gently retract the needle from the eye. To visualize the bleb, move the mouse head to position the eye under the microscope and secure the position by gently holding the head.For intraoperative OCT, use the IOCT function on the operating microscope and select cube on the OCT screen. Position the scanning area on the bleb by pressing the arrow buttons. To adjust the OCT, slide centering and focus for the best OCT quality, press capture or scan to acquire the OCT scan of the bleb area and review the images to check the quality of the scans.Finally, remove the cover slip and gently clean the gel from the eye using gauze. Administer antibiotic ointment once after the injection to prevent infection. The OCT scan revealed distinct HESC entities suspended in the cell treated eye.In contrast, the media treated eye displayed unclouded fluid, void of cells within the subretinal space.