Takayuki Nagasaki Deneysel yardım;; Körlük Engellenir Araştırma Bu araştırma Oftalmik ve Görsel Araştırma Hayvanları Kullanım ARVO Bildirimi ile uyumludur. KJW NIH yardımlar 5T32EY013933 ve 5T32DK007647-20 tarafından desteklenmektedir. VBM NIH hibe K08EY020530 tarafından desteklenmektedir.

1. Subretinal Enjeksiyon için cihazlar monte <ol><li> Satın alma veya bir cam kapiller tüp bir 100 mikron çaplı iğne yapmak. Bu bir Sutter P-97 pipet çektirmesi veya diğer benzeri ekipman kullanarak elle de yapılabilir. Istenilen çapı (100 um) ulaşana kadar kılcal boru ucu ısıtılır ve çekilecektir. Daha küçük çaplı bir iğne gen terapisi vektörleri için de kullanılabilir, ancak bu hücreler veya göze zarar vermeden hücre enjeksiyon için önerilen bir çapa sahiptir. Çelik iğneleri ile karşılaştırıldığında, cam kılcal iğne retinal kopma neden olmadan, enjeksiyon sıvı ve retina altı alanı için erişim görselleştirilmesi için izin vermek için, bir çok ince, fakat küt uç vardır. Steril bir kap içinde% 70 etanol ve mağaza kullanarak gerekirse bu çekti iğne temizleyin. Yerde iğneler tutmak için teyp ile 15 cm steril doku kültürü çanak enjeksiyon iğneleri kaplı ve steril bir ortamda tutmak için hangi bir yoludur. Bu noktada, complprosedürü gerçekleşecek cerrahi oda içinde set-up ete. Bu prosedür bir bariyer tesis içinde yapılır, özellikle de steril kalması için her zaman cerrahi odasında tüm ekipman tutmak için en kolay yoldur. </li><li> Enjeksiyon iğne içine silikon aspire ve iğne iç duvarları boyunca bir kaplama bırakmak için silikon çıkarır. Silikon kaplama aksi iç cam kapiller duvarları sadık kalacağına iğne deliğinden hücreleri ve virüsler, geçişi artırır. </li><li> (Borudan iğne kaldırarak) doğrudan iğne sonrası noktada luer-lock ile ayarlanmış bir 25 ¾ gauge kan toplama keserek steril plastik boru yaklaşık 8 cm uzunluğunda edinin. </li><li> Steril serum fizyolojik ile 1 ml Alt-Q 26 5/8-gauge kayma ucu şırınga doldurun ve şırınga iğne çıkarılır. </li><li> Plastik boru kesik ucuna enjeksiyon iğne takın ve diğer uçta luer kilit için şırınga takmaksonu. </li><li> Boru ve kılcal iğne ölü boşluk, doğru herhangi bir sızıntı olmadan bağlı olduğundan emin olmak için iğne ile çıkarılması bazı salin doldurmak için steril salin aspire. Daha sonra, enjeksiyon iğne ucunun içine, küçük bir hava, yaklaşık olarak 1 ul miktarı aspire. Bu enjeksiyon sıvısı salin ayırmak ve cerrahi prosedür esnasında enjeksiyon sıvı sonunu gösteren bir görsel işaret temin edecektir. Enjeksiyon aparat cerrahi işlem sırasında% 70 etanol ile sildi temiz bir yüzey üzerinde tutulmalıdır. Ayrıca, cerrahi işlem sırasında kullanılan tüm ekipman hemen kullanıma hazır steril ve tutulması gereken enjeksiyon iğneleri dışındaki için, önce ve% 70 etanol ile sonra her iki temizlenmesi gerekir. Bu iğneler cerrahi sonrası elden değil, yeniden kullanılabilir. Edilmelidir </li><li> Son olarak, istenen ambalajlı gen tedavisi viral vektör veya kök hücreleri içeren enjeksiyon solüsyonu aspire. Bu yapılabilirdaha sonra bir steril hücre kültürü çanağı yüzeyi üzerine pipetle çözelti, bir steril pipet ucu içine enjeksiyon çözelti kaplamaz. Çözüm artık kolayca şırıngayla enjeksiyon iğnesi aspire edilebilir. Ihtiyaç duyulan miktar fare yaşına bağlı olarak değişir. Bizim amaçlarımız için biz enjeksiyon sıvısının 0.5-0.8 ul enjekte edilebilir doğum sonrası 5. gün fareler, kullanın. Daha küçük miktarlar, ul 0.5 ya da daha az, daha küçük olan fareler ve bu gibi 1 ul gibi büyük miktarlarda için kullanılabilir, yetişkin fareler için de kullanılabilir. Hücrelerin viral titresi veya sayı enjekte edilmiş virüs / hücre ve arzu edilen hedef dokuya göre tespit edilmesi gerekmektedir, küçük bir hacim içinde olduğu gibi çok sayıda viral partiküller ya da hücreler retina hücreleri için toksik yol açabilir. Video, görselleştirme amaçlı, biz 1.5 ul, göz içine enjekte etmek için gerekli olandan boya büyük bir miktarda kullanmışlardır. </li></ol> 2. Subretinal Uzay Erişme <ol><li> Steril cerrahi odası içinde,fare yaşına göre değişir lokal olarak onaylanmış hayvan taşıma protokolüne uygun fare stabilize veya uyutmak. Yetişkin fareler İzofluran anestezi için ortak gaz veya 0,1 ml/10g vücut ağırlığının ketamin (100 mg / ml) ve steril tuzlu su içinde ksilazin (20 mg / ml) bir intra-peritoneal enjeksiyonu içerir. Perinatal fareler için ortak anestezi teknikleri isofluran gaz veya cryoanesthesia (hipotermi) kullanımını içerir. Tüm anestezi teknikleri kullanmadan önce yerel IACUC komitesi tarafından onaylanmış olmalıdır. Benzer teknikler P0 veya yetişkin fareler için genç olarak fareler için uygulanabilir ise de, tipik olarak (P), doğum sonrası 5. günde fareler kullanılır. Fare bacaklarda ve artık tutam tırnağa yanıt hareket sona kadar cerrahi işlem başlayamaz. Perinatal fareler için, onlar kan akımı tamamen anestezi altında olduğunu bilerek, başka bir tuşa yavaşlatacaktır beri renkli belirgin hafif olacak. </li><li> Perinatal farelerde için Vannas düz makas kullanın mkapağı kapalı fissür boyunca ake yaklaşık 1,5 mm kesi. Gözün doğal olarak gelecekte açılacak girinti de kesmek için dikkatli olun. Bu kapaklar iyileşmesi ve fare gelişimi sırasında düzgün açılacaktır sağlar. Biz, bu işlem sırasında göz delinmesiyle riskini azaltmak beri Vannas makas tercih rağmen bir cerrahi bıçak, bu amaç için kullanılabilir. Video, makas gözkapağı kenarı boyunca doğrudan ponksiyon ve kesim için kullanılmıştır. Bu tekniği öğrenirken, forseps kesim öncesi göz kapağı kaldırın ve gözün zarar verme riskini azaltmak için kullanılmalıdır. </li><li> Göz proptose ve hafifçe enjeksiyon için proptosed tutmak için göz altına kapaklarının çimdik kavisli soyunma forseps ile göz kapaklarını açarak çekin. Adım iki yapılan kapağı kesisi çok büyükse, göz kapaklarının altında geri kayma ve enjeksiyon işlemi sırasında yeterli pozlama önleyecektir. Dr ile göz çevresinde hafif bir basınç uygulayarak yetişkin fareler içinforseps essing enjeksiyon için proptosed göz tutabilir. </li><li> Küçük bir skleral az kesi veya 15 derecelik mikrocerrahi bıçak yüzeyi çizilmeye tarafından dünyanın en ekvatora posterior olun. Bu kesi enjeksiyon iğne ucu geçmek için yeterli sadece büyük, ama hayır bu daha büyük olmalıdır. Eğer tercih edilirse, bu gibi bir akupunktur iğne olarak küçük, keskin bir iğne yerine mikrocerrahi bıçağın subretinal boşluk içine bu kesik yapmak için kullanılabilir. Koyu pigmentli hayvanlarda, koyu kahverengi pigmentli doku (koroid-retina pigment epiteli) kesi noktada görünür hale gelecektir. Çakmak pigmentli ya da albino fareler, bir cerrahi işaretleme kalem kesi gösteren bir mürekkep yerinde bırakmak mikrocerrahi bıçak ucu ile uygulanabilir. Kesi yeri net (vitreus) sıvı reflüsü varsa, bıçak çok derin yerleştirilmiş ve vitreus boşluğu ve terapötik virüs veya hücre enjeksiyonu sırasında intravitreal boşluk girebilirsiniz girmiştir. Visualizati içinamaçlar için, biz video bu noktaya kesi yaptık. Bu durumda, bir retina altı enjeksiyon işlemini tamamlamak için yine de mümkündür, ancak enjeksiyon sıvı bulunmasından kaynaklanan retina dekolmanı tam olarak bu fare iyileşmeyen olabilir. Bu nedenle, bakım enjeksiyondan önce sadece dış göz yüzeyi ile değil, retina kesmek için özen gösterilmelidir. </li><li> Dikkatle kesi site içine enjeksiyon iğnesi takın ve subretinal boşluk girmek için dış gözün duvarına paralel ilerlemek. Göz içindeki dış duvara çok yakın veya çok derin ilerlemek konumu yanlış içine enjeksiyon yönetecek. İğne doğru konumda olup olmadığını anlamak için en iyi yöntem tekniği uygulamak için. Hafifçe pigmentli veya albino fareler üzerinde Pratiği subretinal alana kesin ve doğru enjeksiyon yapmak için yardımcı olabilir. Iğne ve enjeksiyon sıvısı bu gözlerin içinde görünür olmasıdır. </li><li> Şırınga pistonu hafif basınç uygulayın ve olmayacakİstenen sıvı cin enjeksiyonu. İğne doğru subretinal boşluk içinde yer almakta ise, ılımlı geri basınç hissedilecektir. Iğne vitröz içinde ise, enjeksiyon sırasında önemli ölçüde daha az geri basınçta ve potansiyel olarak bir sıvı geri akışta olacaktır. Anlamlı geri basınç varsa, yavaş yavaş iğne çıkarmak için en az bir ek 15 saniye için yerinde iğne tutun. Bu yüksek göz içi basıncı kesi dışarı geri enjekte virüs veya hücrelerin reflüyü yerine eşitlemek için izin verecektir. Hava ve tuzlu bazı enjeksiyon işlemi sırasında gerekli olan artan basınç nedeniyle subretinal boşluk içine enjekte edilebilir. Bakım bunun gözünden enjekte virüs veya hücrelerin dışarı yıkayın yana, hava veya salin aşırı enjekte etmek değil alınmalıdır. Bu, subretinal boşluk içine enjekte çok fazla sıvı varlığında ikinci kalıcı retina dekolmanı neden olması da mümkündür. Görüntüleme amaçları için, fazla boya ve hava enjekte edildi intvideo subretinal boşluk o. Açıkça hava kabarcığı subretinal boşluk içinde kalır ve vitreus içine geçmezse ne de çok fazla enjekte ise boya bazı subretinal boşluk geri atılır nasıl görülür, ama olabilir. Bu bu enjeksiyonları gözün doğru konuma içindeki bütün olduğunu vurgulamak için kullanılır, bu yüzden tek bir iğne kesi girmelidir nasıl tahayyül edebilirsiniz. Subretinal boşluk içine Tüm enjeksiyonlar enjeksiyon sıvı varlığı nedeniyle, geçici bir retina dekolmanı neden olur. Enjeksiyon prosedür doğru tamamlandığı takdirde, bu geçici retina dekolmanı diğer tüm deneyler için kullanılan 24 saat ve fareler içinde iyileşir. Göz cerrahi prosedür nedeniyle yaklaşık bir hafta boyunca yumuşak kalabilir, ikinci bir enjeksiyon zaman bu dönemde kaçınılmalıdır böylece. </li><li> Yenidoğan farelerin için hafifçe geriye kapaklarının arkasında ve yörüngeye göz itmek kavisli soyunma forseps kullanın. Bu yararlı olabilirvirüs subretinal boşluk içinde yerleşmek ve yavaşça onun yörüngesine geri göz iterek zaman kesi dışarı kızarmış neden değil izin vermek için bir dakika bekleyin. Ameliyattan sonra,% 0.5 bupivakain bir damla (Marcaine) enjeksiyon yerinde yerleştirilebilir bir 25-gauge iğne steril salin içinde% 0.25 &#39;ye seyreltilir. Fare subretinal cerrahi sonrası sıkıntı belirgin belirti görünmüyor ve uzun etkili bir topikal analjezik olarak bupivakain kullanımı önceki üç yıl için yeterli olmuştur. Enfeksiyon gibi, şişme veya fare normal günlük aktiviteler bir azalma; Fareler her zaman herhangi bir sıkıntı belirtileri aramak için cerrahi işlem sonrası takip edilmelidir. Bu meydana gelirse, veteriner haberdar edilmelidir ve bu buprenorfin (0.05 mg / kg) olarak daha fazla ağrı kesici ilaçlar intraperitoneal enjeksiyon şeklinde verilebilir. </li><li> Lokal olarak onaylanmış hayvan taşıma protokolüne göre anestezi fare uyandır. Fare bir ısıtma p üzerinde tutulmalıdırBu anestezik modundan gibi reklam, normal vücut ısısını korumak için. Cerrahi, anestezi fare zamanı saymazsak, tamamlamak için en az beş dakika sürer. Bu nedenle, bir ısıtma pedi asıl işlem sırasında gerekli değildir, fakat bu işlem daha uzun bir süre sürebilir gibi bir yöntem öğrenme sırasında ihtiyaç olabilir. Kendi başına hareket etmeye başlamıştır kadar fare temiz bir kafes içine geri konulmamalıdır. Yenidoğanlar için, yumuşak ayak tutam tamamen anestezi kurtarmak için onlara yardımcı olacak ve onlar annesi ile geri konuyor önce pembe renk ve hareket kazanmak gerekir. Olarak listelenen önceden Fare sıkıntı herhangi bir işaret için zaman içinde izlenmelidir. </li></ol>

<ol>
	<li>Abe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+retina+using+pigment+epithelial+cell+transplantation.">Regeneration of the retina using pigment epithelial cell transplantation.</a> Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 106, 778-803 (2002).</li><li>Jacobson, S. G., Cideciyan, A. V., Ratnakaram, R., Heon, E., Schwartz, S. B., Roman, A. J., Peden, M. C., Aleman, T. S., Boye, S. L., Sumaroka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+Leber+congenital+amaurosis+caused+by+RPE65+mutations:+safety+and+efficacy+in+15+children+and+adults+followed+up+to+3+years.">Gene therapy for Leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years.</a> Arch. Ophthalmol. 130, 9-24 (2011).</li><li>Schwartz, S. D., Hubschman, J. P., Heilwell, G., Franco-Cardenas, V., Pan, C. K., Ostrick, R. M., Mickunas, E., Gay, R., Klimanskaya, I., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration:+a+preliminary+report.">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> Lancet. 379, 713-720 (2012).</li><li>Wang, N. K., Tosi, J., Kasanuki, J. M., Chou, C. L., Kong, J., Parmalee, N., Wert, K. J., Allikmets, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+reprogrammed+embryonic+stem+cells+improves+visual+function+in+a+mouse+model+for+retinitis+pigmentosa.">Transplantation of reprogrammed embryonic stem cells improves visual function in a mouse model for retinitis pigmentosa.</a> Transplantation. 89, 911-919 (2010).</li><li>Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+models+of+retinal+degeneration+and+targets+for+gene+therapy.">Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy.</a> Gene Ther. Mol. Biol. 11, 229-262 (2007).</li><li>Tosi, J., Sancho-Pelluz, J., Davis, R. J., Hsu, C. W., Wolpert, K. V., Sengillo, J. D., Lin, C. S., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus-mediated+expression+of+cDNA+and+shRNA+slows+degeneration+in+retinitis+pigmentosa.">Lentivirus-mediated expression of cDNA and shRNA slows degeneration in retinitis pigmentosa.</a> Exp. Biol. Med. 236, 1211-1217 (2011).</li><li>Tucker, B. A., Park, I. H., Qi, S. D., Klassen, H. J., Jiang, C., Yao, J., Redenti, S., Daley, G. Q., Young, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+adult+mouse+iPS+cell-derived+photoreceptor+precursors+restores+retinal+structure+and+function+in+degenerative+mice.">Transplantation of adult mouse iPS cell-derived photoreceptor precursors restores retinal structure and function in degenerative mice.</a> PLoS One. 6, e189992 (2011).</li><li>Mahajan, V. B., Mondino, B. J., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A high-throughput Mouse Eye Phenomics System. , (2010).</li><li>Chang, B., Hawes, N. L., Hurd, R. E., Davisson, M. T., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+degeneration+mutants+in+the+mouse.">Retinal degeneration mutants in the mouse.</a> Vision Res. 42, 517-525 (2002).</li><li>Hawes, N. L., Smith, R. S., Chang, B., Davisson, M., Heckenlively, J. R., John, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+fundus+photography+and+angiography:+a+catalogue+of+normal+and+mutant+phenotypes.">Mouse fundus photography and angiography: a catalogue of normal and mutant phenotypes.</a> Mol. Vis. 5, 22 (1999).</li><li>Won, J., Shi, L. Y., Hicks, W., Wang, J., Hurd, R., Naggert, J. K., Chang, B., Nishina, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+resources+for+vision+research.">Mouse model resources for vision research.</a> J. Ophthalmol. 2011, 391384 (2011).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu video tekniği başarıyla subretinal enjeksiyon cerrahi prosedürünü tamamladıktan ve gen terapi vektörü veya kök hücreleri verimli oftalmik hastalığı tedavi etmek için gerekli konuma yerleştirilir sağlanması ile ilgili yönergeler sağlar. Bu hücrelerin çevresinde gen terapisi vektörleri ya da kök hücresi kaynaklı dokuların yerleştirilir çünkü bu yöntem, böyle bir RPE ve fotoreseptör gibi retinal hücre hedefleme için olanak sağlar. Önceki yöntemler sıvı vitreus boşluğu içinde y...

<table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Şirket </td><td> Katalog </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> 0,8-1,10 x 100 mm Kapiler Tüp (cam) </td><td> Kimble Cam, Inc </td><td> 34502 99 </td><td></td></tr><tr><td> / Brown Mikropipet Çektirme Flaming </td><td> Sutter Instrument </td><td> P-97 </td><td> Narishige microforge yerine kullanılabilir. Katalog # MF-900 </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> Sigma Aldrich </td><td> SL2-25ml </td><td> Silikon </td></tr><tr><td> Dubecco en Fosfat Kalsiyum Klorür ve Magnezyum Klorür ile Tamponlu Salin </td><td> Gibco-Invitrogen </td><td> 14040-133 </td><td></td></tr><tr><td> Emniyet-Lok 25 3/4G x 12 &quot;; Kan Toplama Seti </td><td> BD Vacutainer </td><td> 367298 </td><td></td></tr><tr><td> 1 ml alt-Q-265/8G Slip-İpucu Şırınga </td><td> Becton-Dickinson </td><td> 309597 </td><td></td></tr><tr><td> 0.5-10 ul Finnpipette II Ayarlanabilir Hacim Pipetter </td><td> Fisherbrand </td><td> 21-377-815 </td><td></td></tr><tr><td> 1-200 ul Doğal Eğimli İpuçları </td><td> USA Scientific, Inc </td><td> 1111-1700 </td><td></td></tr><tr><td> Discovery.V8 Stereo Mikroskop </td><td> Zeiss </td><td> MC1500 </td><td></td></tr><tr><td> 60 mm x 15 mm Stil Tedavi Polistiren Hücre Kültürü Bulaşık </td><td> Corning Incorporated </td><td> 430166 </td><td></td></tr><tr><td> Vannas Düz Makas </td><td> Storz Ophtalmics&#39;in </td><td> E3383 S </td><td></td></tr><tr><td> Narin tırtıklar Kavisli Giyinme Forseps </td><td> Storz Ophtalmics&#39;in </td><td> E1408 </td><td></td></tr><tr><td> 15 Derece Mikrocerrahi Bıçak </td><td> WilsOftalmik Corp üzerine </td><td> 091204 </td><td></td></tr><tr><td> Ketamin </td><td> Ketaset III </td><td> NADA # 45-290 </td><td></td></tr><tr><td> Ksilazin </td><td> Lloyd Laboratuvarlar </td><td> NADA # 139-236 </td><td></td></tr><tr><td> Bupivakain (marcain) </td><td> AstraZeneca </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Buprenorfin </td><td> Sigma Aldrich </td><td> B9275 </td><td></td></tr></tbody></table>

subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye

Görme kaybı Amerika Birleşik Devletleri&#39;nde yaklaşık 3.4 milyon insanı etkileyen ve önümüzdeki yıllarda daha da artacağı beklenmektedir. Son 1, gen tedavisi ve kök hücre nakilleri retinal dejeneratif hastalıklardan kaynaklanan körlük tedavisinde önemli terapötik araç haline gelmiştir. Böyle iris pigment epitel hücre transplantasyonu gibi yaşa bağlı makula dejenerasyonu için otolog transplantasyon çeşitli formları (AMD), ümit verici sonuçlar yarattı ve insan klinik gen ve kök hücre tedavileri diğer formları için başladık. 2 Bunlar RPE65 gen değiştirme dahil Leber konjenital amarozu ve Stargardt hastalığında insan embriyonik kök (ES) hücreler kullanılarak RPE hücre nakli olan hastalarda tedavi. 3-4 Şimdi gen tedavisi vektörleri ve retina hastalıkları olan hastaların tedavisinde kök hücre mevcuttur olduğunu, bunu doğrulamak için önemlidir hayvan modellerinde bu potansiyel tedavilerin önce başvurmalarıinsan çalışmalarında bunları ing. Fare göz gen tedavisi vektörleri ve kök hücre nakli tedavi etkinliğinin saptanması için önemli bir bilimsel model haline gelmiştir. Bu video makalede 5-8, biz subretinal alana gen tedavisi vektörleri veya kök hücreleri enjekte için bir yöntem sunmak fare gözü çevreleyen doku hasarı en aza indirerek.

Fare gözün bir çizim intravitreal ve subretinal hem enjeksiyon cerrahi işlemler (ok başları, Şekil 1) için yerleri gösteren oklar ile, referans için etiketli önemli yapıları ile gösterilir. Bu tür lacZ lentiviral vektörü (Şekil 2) gibi Gen tedavisi vektörleri, bu konumlar kullanılarak enjekte edilebilir. Ayrıca, bu tür fare embriyonik kök hücre (Şekil 3), kök hücreleri gibi, aynı zamanda, fare gözünde bu alanlardaki transplante edi...

Watch this Scientific Journal Video about Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye at JoVE.com

Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

Bu cerrahi teknik fare gözün subretinal boşluk içine gen terapisi vektörleri ve kök hücrelerinin enjeksiyonu göstermektedir.

Fare Göz içine Gen Terapisi Vektörler ve Kök Hücre Subretinal Enjeksiyon

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

subretinal-injection-gene-therapy-vectors-stem-cells-perinatal-mouse

Research

JoVE Journal

Medicine

32.9K Görüntüleme.  Columbia University. Bu cerrahi teknik fare gözün subretinal boşluk içine gen terapisi vektörleri ve kök hücrelerinin enjeksiyonu göstermektedir.

Video: Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a number of gene therapy clinical trials. More recently, a number of additional AAV serotypes have also been isolated, which have been shown to exhibit selective tissue-tropism in various small and large animal models1. Of the 10 most commonly used AAV serotypes, AAV3 is by far the least efficient in transducing cells and tissues in vitro as well as in vivo.
However, in our recently published studies, we have documented that AAV3 vectors transduce human liver cancer - hepatoblastoma (HB) and hepatocellular carcinoma (HCC) - cell lines extremely efficiently because AAV3 utilizes human hepatocyte growth factor receptor as a cellular co-receptor for binding and entry in these cells2,3.
In this article, we describe the steps required to achieve high-efficiency transduction of human liver cancer cells by recombinant AAV3 vectors carrying a reporter gene. The use of recombinant AAV3 vectors carrying a therapeutic gene may eventually lead to the potential gene therapy of liver cancers in humans.

In this article, we describe the identification of the adeno-associated virus serotype 3 (AAV3) as the most efficient vector for targeting human liver cancer cells.

Rekombinant Adeno Associated Virus serotip 3 Vektörler Karaciğer Kanseri Hücreleri Yüksek Verimlilik İletimi

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a ...

Tıp

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

Bağışıklık Eksik Fare Kuruluş ve İnsan Retinoblastom Tümörler yayılımı

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive molecules contain an oxygen and include H2O2 (hydrogen peroxide), NO (nitric oxide), O2- (oxide anion), peroxynitrite (ONOO-), hydrochlorous acid (HOCl), and hydroxyl radical (OH-).
Oxidative species are produced not only under pathological situations (cancers, ischemic/reperfusion, neurologic and cardiovascular pathologies, infectious diseases, inflammatory diseases 1, autoimmune diseases 2, etc&hellip;) but also during physiological (non-pathological) situations such as cellular metabolism 3, 4. Indeed, ROS play important roles in many cellular signaling pathways (proliferation, cell activation 5, 6, migration 7 etc..). ROS can be detrimental (it is then referred to as "oxidative and nitrosative stress") when produced in high amounts in the intracellular compartments and cells generally respond to ROS by upregulating antioxidants such as superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) and glutathione (GSH) that protects them by converting dangerous free radicals to harmless molecules (i.e. water). Vitamins C and E have also been described as ROS scavengers (antioxidants).
Free radicals are beneficial in low amounts 3. Macrophage and neutrophils-mediated immune responses involve the production and release of NO, which inhibits viruses, pathogens and tumor proliferation 8. NO also reacts with other ROS and thus, also has a role as a detoxifier (ROS scavenger). Finally NO acts on vessels to regulate blood flow which is important for the adaptation of muscle to prolonged exercise 9, 10. Several publications have also demonstrated that ROS are involved in insulin sensitivity 11, 12.
Numerous methods to evaluate ROS production are available. In this article we propose several simple, fast, and affordable assays; these assays have been validated by many publications and are routinely used to detect ROS or its effects in mammalian cells. While some of these assays detect multiple ROS, others detect only a single ROS.

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

Here we propose simple methods to test and evaluate the presence of reactive oxygen species in cells.

Kanserler Üretim ve reaktif oksijen türlerinin (ROS Algılama)

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and acquired diseases. Apart from congenital or inherited abnormalities with the requirement for long-term expression of the delivered gene, several non-inherited perinatal conditions, where short-term gene expression or pharmacological intervention is sufficient to achieve therapeutic effects, are considered as potential future indications for this kind of approach. Candidate diseases for the application of short-term prenatal therapy could be the transient neonatal deficiency of surfactant protein B causing neonatal respiratory distress syndrome1,2 or hyperoxic injuries of the neonatal lung3. Candidate diseases for permanent therapeutic correction are Cystic Fibrosis (CF)4, genetic variants of surfactant deficiencies5 and &alpha;1-antitrypsin deficiency6.
Generally, an important advantage of prenatal gene therapy is the ability to start therapeutic intervention early in development, at or even prior to clinical manifestations in the patient, thus preventing irreparable damage to the individual. In addition, fetal organs have an increased cell proliferation rate as compared to adult organs, which could allow a more efficient gene or stem cell transfer into the fetus. Furthermore, in utero gene delivery is performed when the individual's immune system is not completely mature. Therefore, transplantation of heterologous cells or supplementation of a non-functional or absent protein with a correct version should not cause immune sensitization to the cell, vector or transgene product, which has recently been proven to be the case with both cellular and genetic therapies7.
In the present study, we investigated the potential to directly target the fetal trachea in a mouse model. This procedure is in use in larger animal models such as rabbits and sheep8, and even in a clinical setting9, but has to date not been performed before in a mouse model. When studying the potential of fetal gene therapy for genetic diseases such as CF, the mouse model is very useful as a first proof-of-concept because of the wide availability of different transgenic mouse strains, the well documented embryogenesis and fetal development, less stringent ethical regulations, short gestation and the large litter size.
Different access routes have been described to target the fetal rodent lung, including intra-amniotic injection10-12, (ultrasound-guided) intrapulmonary injection13,14 and intravenous administration into the yolk sac vessels15,16 or umbilical vein17. Our novel surgical procedure enables researchers to inject the agent of choice directly into the fetal mouse trachea which allows for a more efficient delivery to the airways than existing techniques18.

We developed a novel surgical approach for intratracheal administration of bioactive agents into the mouse fetus. The delivery route is more efficient in targeting the fetal mouse lungs than the commonly used intra-amniotic injection. This procedure has to date not been described in a mouse model.

Bir Fetal Fare Modelinde Biyoaktif Ajan intratrakeal Yönetimi İçin Yeni Bir Cerrahi Yaklaşım

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the occurrence of subretinal hemorrhage can affect photoreceptor cell death in the detached retina. Hence, it is advantageous to create reproducible RDs without subretinal hemorrhage for evaluating photoreceptor cell death. We modified a previously reported method to create bullous and persistent RDs in a reproducible location with rare occurrence of subretinal hemorrhage. The critical step of this modified method is the creation of a self-sealing scleral incision, which can prevent leakage of sodium hyaluronate after injection into the subretinal space. To make the self-sealing scleral incision, a scleral tunnel is created, followed by scleral penetration into the choroid with a 30 G needle. Although choroidal hemorrhage may occur during this step, astriction with a surgical spear reduces the rate of choroidal hemorrhage. This method allows a more reproducible and reliable model of photoreceptor death in diseases that involve RD such as rhegmatogenous RD, retinopathy of prematurity, diabetic retinopathy, central serous chorioretinopathy, and age-related macular degeneration (AMD).

Creating experimental retinal detachments with a reproducible and sustained height of detachment, and without subretinal hemorrhage, is important for studying the pathophysiology of photoreceptor cell loss in retinal disease and evaluating potential therapeutic interventions. Here, we report such a method in detail.

Sodyum Hyaluronat subretinal Enjeksiyon Kemirgenler Retina Dekolmanı Modeli

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina

Vision impairment and blindness due to the loss of the light-sensing cells of the retina, i.e. photoreceptors, represents the main reason for disability in industrialized countries. Replacement of degenerated photoreceptors by cell transplantation represents a possible treatment option in future clinical applications. Indeed, recent preclinical studies demonstrated that immature photoreceptors, isolated from the neonatal mouse retina at postnatal day 4, have the potential to integrate into the adult mouse retina following subretinal transplantation. Donor cells generated a mature photoreceptor morphology including inner and outer segments, a round cell body located at the outer nuclear layer, and synaptic terminals in close proximity to endogenous bipolar cells. Indeed, recent reports demonstrated that donor photoreceptors functionally integrate into the neural circuitry of host mice. For a future clinical application of such cell replacement approach, purified suspensions of the cells of choice have to be generated and placed at the correct position for proper integration into the eye. For the enrichment of photoreceptor precursors, sorting should be based on specific cell surface antigens to avoid genetic reporter modification of donor cells. Here we show magnetic-associated cell sorting (MACS) - enrichment of transplantable rod photoreceptor precursors isolated from the neonatal retina of photoreceptor-specific reporter mice based on the cell surface marker CD73. Incubation with anti-CD73 antibodies followed by micro-bead conjugated secondary antibodies allowed the enrichment of rod photoreceptor precursors by MACS to approximately 90%. In comparison to flow cytometry, MACS has the advantage that it can be easier applied to GMP standards and that high amounts of cells can be sorted in relative short time periods. Injection of enriched cell suspensions into the subretinal space of adult wild-type mice resulted in a 3-fold higher integration rate compared to unsorted cell suspensions.

Cell transplantation represents a strategy for the treatment of retinal degeneration characterized by photoreceptor loss. Here we describe a method for enrichment of transplantable photoreceptors and their subretinal grafting into adult mice.

MACS Saflaştırılmış Fotoreceptör Öncü Hücrelerinin Yetişkin Fare Retinasına Subretinal Transplantasyonu

Vision impairment and blindness due to the loss of the light-sensing cells of the retina, i.e. photoreceptors, represents the main reason for disability ...

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment epithelium (RPE) cells. RPE provide critical support for photoreceptors and death or dysfunction of RPE cells is characteristic of age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of permanent vision loss in people age 55 and older. While no cure for AMD has been identified, implantation of healthy RPE in diseased eyes may prove to be an effective treatment, and large numbers of RPE cells can be readily generated from pluripotent stem cells. Several interesting questions regarding the safety and efficacy of RPE cell delivery can still be examined in animal models, and well-accepted protocols used to inject RPE have been developed. The technique described here has been used by multiple groups in various studies and involves first creating a hole in the eye with a sharp needle. Then a syringe with a blunt needle loaded with cells is inserted through the hole and passed through the vitreous until it gently touches the RPE. Using this injection method, which is relatively simple and requires minimal equipment, we achieve consistent and efficient integration of stem cell-derived RPE cells in between the host RPE that prevents significant amount of photoreceptor degeneration in animal models. While not part of the actual protocol, we also describe how to determine the extent of the trauma induced by the injection, and how to verify that the cells were injected into the subretinal space using in vivo imaging modalities. Finally, the use of this protocol is not limited to RPE cells; it may be used to inject any compound or cell into the subretinal space.

Here we present a community accepted protocol in multimedia format for subretinally injecting a bolus of RPE cells in rats and mice. This approach can be used for determining rescue potentials, safety profiles, and survival capacities of grafted RPE cells upon implantation in animal models of retinal degeneration.

Süspansiyon Retina pigment epiteli Hücreleri sunun Kemirgenler Subretinal Enjeksiyonları Sahne

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Pankreas Kanseri Yeni Tedavi Stratejileri Geliştirme Hücre Özellikleri Kök incelenmesi

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson's Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on animal models. The identification of PD-associated genes has led to the development of genetic PD models. Most transgenic &#945;-SYN mouse models develop gradual &#945;-SYN pathology but fail to display clear dopaminergic cell loss and dopamine-dependent behavioral deficits. This hurdle was overcome by direct targeting of the substantia nigra with viral vectors overexpressing PD-associated genes. Local gene delivery using viral vectors provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. Specific brain regions can be targeted (e.g. the substantia nigra), expression can be induced in the adult setting and high expression levels can be achieved. Further, different vector systems based on various viruses can be used. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based alpha-synuclein animal model for Parkinson&#39;s disease.

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson&#039;s Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

This manuscript describes how viral vector-mediated local gene delivery provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based animal model for Parkinson's disease.

Bir rekombinant adeno-ilişkili viral vektörün stereotaktik enjeksiyon yoluyla Parkinson Hastalığı için bir alfa-sinüklein Bazlı Fare Modeli Geliştirme

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in adults in industrially developed countries. RPE transplantation appears to be a promising therapy, as it may replace dysfunctional RPE, restore its function, and thereby vision.
Here we describe a method for transplanting a cultured RPE monolayer on a scaffold into the subretinal space (SRS) of rabbits. After vitrectomy xenotransplants were delivered into the SRS using a custom made shooter consisting of a 20-gauge metallic nozzle with a polytetrafluoroethylene (PTFE) coated plunger. The current technique evolved in over 150 rabbit surgeries over 6 years. Post-operative follow-up can be obtained using non-invasive and repetitive in vivo imaging such as spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) followed by perfusion-fixed histology.
The method has well-defined steps for easy learning and high success rate. Rabbits are considered a large eye animal model useful in preclinical studies for clinical translation. In this context rabbits are a cost-efficient and perhaps convenient alternative to other large eye animal models.

Retinal pigment epithelium (RPE) replacement strategies and gene-based therapy are considered for several retinal degenerative conditions. For clinical translation, large eye animal models are required to study surgical techniques applicable in patients. Here we present a rabbit model for subretinal surgery geared towards RPE transplantation, which is versatile and cost-efficient.

Tavşanlarda Subretinal Cerrahi Adım Protokolle Bir Adım

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...