Metodolojik tartışma için Choi ve Jung laboratuvarlarının tüm üyelerine teşekkür ederiz. Tavsiye ve geri bildirimleri için C. Jang ve D. Guertin'e teşekkür ederiz. Makaleyi eleştirel bir şekilde okuduğu için M.S. Choi'ye teşekkür ederiz. Bu çalışma NRF-2022R1C1C1012034 tarafından S.M.J.'ye finanse edilmiştir; NRF-2022R1C1C1007023'ten DWC'ye; NRF-2022R1A4A3024551'den S.M.J. ve D.W.C.'ye Bu çalışma W.T.K. için Chungnam Ulusal Üniversitesi tarafından desteklenmiştir. Şekil 1 ve Şekil 2 BioRender (http://biorender.com/) kullanılarak oluşturulmuştur.

Tüm deneyler Sungkyunkwan Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin (IACUC) onayı ile gerçekleştirilmiştir. Fareler, günlük 12 saatlik bir aydınlık/karanlık döngüsünün ardından 22 °C ve %45 nemde ayarlanmış bir temiz odada bulunan IACUC onaylı bir hayvan tesisine yerleştirildi. Havalandırmalı raflarda tutuldular ve standart bir yemek diyetine (%60 karbonhidrat, %16 protein ve %3 yağ içeren) erişebildiler. Yatak ve yuvalama malzemeleri haftalık olarak değiştirildi. Bu çalışma için, 12 haftalık ve 25 g ile 30 g arasında ağırlığa sahip erkek C57BL / 6J fareleri kullanıldı. Bu hayvanlar ticari bir tedarikçiden temin edilmiştir (bkz.
1. Kahverengi yağ dokusunun metabolik aktivitesinin sıcaklık iklimlendirme ve farmakolojik stimülasyon yoluyla modülasyonu
NOT: Birkaç gün ila haftalar boyunca sıcaklık alıştırma veya β-adrenerjik reseptör agonistleri kullanılarak farmakolojik stimülasyon, BAT aktivitesinimodüle etmek için yaygın olarak kullanılan yöntemlerdir 1. Bu nedenle, okuyucuların gerektiği gibi uygun yaklaşımı seçmelerini sağlamak için yönteme kısa bir genel bakış aşağıda verilmiştir. Metabolik olarak inaktif (daha az termojenik) BAT elde etmek için, C57BL/6J fareler için termonötralite (28-30 °C) olarak adlandırılan bir temel sıcak sıcaklık seçilir. Bu aralık, farelerin sabit bir vücut ısısını korumak için fazladan enerji harcamasına gerek kalmamasını sağlar. Metabolik olarak orta veya yüksek derecede aktif (termojenik) BAT elde etmek için sırasıyla hafif soğuk (20-22 °C) veya şiddetli soğuk (6 °C) sıcaklıklar seçilebilir. Bu deneyin amaçları doğrultusunda, fareler, fareler için hafif soğuk olmasına rağmen, herhangi bir farmakolojik uyarım içermeyen 22 ° C'de standart barınma koşulları altında yetiştirildi.
<ol><li>Sıcaklık iklimlendirme<ol><li>Fareleri, sıcaklık alıştırmasına başlamadan en az 1 hafta önce kafes başına 1 veya 2 fareyi barındıracak şekilde ayırın. Havalandırma, sıcaklık ve nem kontrolü ile donatılmış kemirgen inkübatörlerini istenen koşullarda hazırlayın.</li>
		<li>Kafesleri, seçilen sıcaklık alıştırma türü için uygun günlerde ilgili kemirgen kuluçka makinelerine taşıyın.</li>
		<li>Fare sayılarının dağılımının, kafes başına 1 veya 2 fare olacak şekilde tüm gruplarda eşit olduğundan emin olun. Tek konut, grup konutuna göre sıcaklığa bağlı fizyolojik değişikliklere daha duyarlı olduğu için tercih edilir43. Her grup için özel barınma koşulları şunlardır:<ol><li>Termonötralite (30 °C) grubu: Bu gruptaki fareleri dört haftaya kadar sürekli olarak 30 °C sıcaklıkta tutun.</li>
			<li>Şiddetli soğuk grubu: Başlangıçta, bu gruptaki fareleri herhangi bir yuvalama malzemesi olmadan 18 °C'de barındırın. Dördüncü haftada 6 °C'ye ulaşan kademeli bir haftalık sıcaklık düşüşü yaşayacaklar. Sıcaklık ilerlemesi şu şekildedir: 18 °C → 14 °C → 10 °C → 6 °C.</li>
			<li>Hafif soğuk grubu (20-22 °C): Bu gruptaki fareleri kemirgen inkübatörlerinde daha önce bahsedilen standart barınma koşullarıyla aynı koşullarda barındırın.</li>
			<li>Akut soğuk algınlığı zorlukları: Akut soğuk algınlığı zorlukları için, herhangi bir yuvalama malzemesi olmadan kafes başına 1-2 fare yerleştirin ve bunları 8 saate kadar 6 °C'ye ayarlanmış bir kemirgen inkübatöre maruz bırakın. NOT: Bu barınma koşulları ve sıcaklık değişimleri, farklı sıcaklık ortamlarının BAT aktivitesi ve metabolizması üzerindeki etkilerini incelemek için gereklidir.</li>
		</ol></li>
		<li>Kafesleri değiştirin ve her hafta yiyecek ve su doldurun. Kafesleri takviyeden en az 24 saat önce, ilgili sıcaklıklarında (kemirgen kuluçka makinesi) önceden iklimlendirin. NOT: Uygun sıcaklık uyaranının bozulmasını önlemek için, yuva oluşumuna yol açabilecek fare zenginleştirmelerinin sağlanmaması önemlidir. Şiddetli soğuğa yanıt olarak, fareler vücut ısısını korumak için daha fazla enerji harcarlar, bu da gıda alımının artmasına ve daha yüksek atılım oranlarına neden olur. Bu nedenle, farelerin yeterli miktarda yiyecek ve suya sahip olduğundan ve kafeslerin aşırı ıslak olmadığından emin olmak için kafesleri haftada en az iki ila üç kez (yerel kurumsal yönergeleri izleyerek) kontrol etmek çok önemlidir. Bu izleme, çalışma sırasında farelerin refahını ve sağlığını korumak için gereklidir.</li>
	</ol></li>
	<li>Farmakolojik stimülasyon1 β3-adrenerjik reseptör agonisti CL316,243 kullanılarak<ol><li>Uyarıcı etkiyi en üst düzeye çıkarmak için, fareleri enjeksiyonlardan önce 2-4 hafta boyunca termonötralitede (30 ° C) önceden barındırın.</li>
		<li>Alışma döneminden sonra intraperitoneal olarak 1 mg / kg CL316,243 enjekte edilir. NOT: β3-adrenerjik reseptör agonisti ile kronik stimülasyon için (ör. 3 günden 1,44,45. haftaya kadar), ilaç stabilitesi nedeniyle günlük enjeksiyonlar gereklidir. Seyreltilmiş CL316,243, stabilite nedeniyle enjeksiyon gününde hazırlanmalıdır.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Arteriyovenöz kan örneklemesi
NOT: 12-14 haftadan büyük fareler, arteriyovenöz kan örneklemesi için en iyi şekilde önerilir. Daha genç fareler, interskapular BAT46'dan venöz kanı spesifik olarak boşaltan ayrı bir kan damarı olan Sulzer damarlarına yeterince büyüklükte olmayabilir.
<ol><li>İndüksiyon için %3 izofluran (205 x 265 x 200 mm boyutlu bir odada) ve bakım için %2 izofluran (gaz anestezi maskesi ile) içeren kalibre edilmiş buharlaştırıcıyı kullanarak nazikçe uyuşturun. NOT: Tüm arteriyovenöz kan örnekleme prosedürü anesteziden hemen sonra yapılmalıdır. Çekirdek vücut ısısını korumak için anestezi sırasında su ısıtmalı bir ısıtma pedi kullanılabilir. DİKKAT: İzofluran solunduğunda oldukça uçucu ve toksiktir. Bu nedenle, birincil anestezik bir çeker ocak altında yapılmalıdır.</li>
	<li>Anestezinin uygun bir derinliğe ulaştığını doğrulamak için hayvanın pençe geri çekilmesi gibi reflekslerini doğrulayın.</li>
	<li>Sulzer'in damarından venöz kan toplanması<ol><li>Fareyi sırt derisini ortaya çıkaracak şekilde konumlandırın, kesiyi yapmadan hemen önce bir ayak parmağı kıstırma yoluyla anestezi derinliğini onaylayın. Saçların ayrılmasını önlemek için sırt derisini bol miktarda %70 etanol ile nemlendirin ve göğüs kafesinin alt kısmından boyuna kadar sırt boyunca bir kesi yapın. NOT: İnterskapular BAT, ince beyaz yağ dokuları ile kaplı iki yağ yastıkçığından oluşan derinin hemen altında bulunur. Gaz anestezi maskesi aracılığıyla farenin anestezi altında kalmasını sağlamak önemlidir.</li>
		<li>İnterskapular BAT'ı bükülmüş uçlu forseps ile nazikçe kaldırın ve çoğu kas olan bağlı dokuları dikkatlice kesin. Yağ yastığını başa doğru kaldırın, bağlı dokuları kesmeye devam edin ve Sulzer'in damarı (interskapular BAT'ın her iki yağ yastığına bağlı büyük 'Y' şeklinde koyu kırmızı bir damar) açığa çıkana kadar bölgeyi dikkatlice açın. NOT: İnterskapular BAT'ın ön ve yan bölgesi ile bağlantılı kas dokularının kılcal damarlarını kesmemeye dikkat edin, çünkü bunu yapmak Sulzer damarından akan kanın miktarını ve kalitesini önemli ölçüde azaltacaktır.</li>
		<li>Sulzer'in damarını dikkatlice kesin ve alttan kesilmiş 200 μL pipet uçları ve bir P100 pipet kullanarak yaklaşık 40 μL kan toplayın. Kanı bir kan alma tüpünde saklayın ve serum toplama işlemine kadar tüpü buz üzerinde tutun. NOT: Superior vena kava47'den kan kontaminasyonunu önlemek için Sulzer damarının Y şeklindeki bölünme noktasının hemen altından kan almak önemlidir. Çok fazla kan toplamak Sulzer'in damarının özelliklerini azaltacaktır. Bu nedenle, analiz için Sulzer'in damarından gereken minimum miktarda kan topladığınızdan emin olun. Kan alma tüplerini seçerken dikkatli olun, çünkü serum ve plazma farklı metabolit profilleriverir 48,49,50. Plazma toplama için heparin kaplı tüplerin kullanılması gerekir. Bu deneyde, serum elde etmek için pıhtılaşma aktivatörü kaplı tüpler seçildi. EDTA kütle spektrometrisi sinyallerini51,52 önemli ölçüde etkilediğinden, hiçbir koşulda EDTA kaplı tüpler kullanılmamalıdır.</li>
	</ol></li>
	<li>Sol ventrikülden arteriyel kan toplanması<ol><li>Ventral cildi ortaya çıkarmak için burun konisine teması kaybetmeden fareyi çevirin. Kesi yapmadan önce anestezi derinliğini bir ayak parmağı kıstırma ile onaylayın. Saç ayrılmasını önlemek için ventral cildi bol miktarda %70 etanol ile nemlendirin ve herhangi bir iç yapıya zarar vermeden kalbi açığa çıkarmak için göğüs boşluğunu makasla dikkatlice açın.</li>
		<li>29 G (1/2") iğne ile 1 mL'lik bir şırınga kullanarak sol ventrikülün apeks bölgesini doğru bir şekilde delin. 1/2 inçlik bir iğnenin üçte ikisini kalbin tepesinin sağ yataline 3-5 mm'ye kadar sokun (Şekil 1B) ve sol ventrikülden (50-100 μL) kan almak için şırıngayı geri çekin. Sol ventrikülden gelen kan, parlak kırmızı olan oksijenli arteriyel kandır. Kanı bir kan alma tüpünde saklayın ve serum toplama işlemine kadar tüpü buz üzerinde tutun. NOT: Kalbe erişim için göğüs boşluğunda minimal bir kesi yapılmalıdır. Aşırı kesi lokal kanamaya neden olabilir ve bu da daha sonra düşük tansiyona neden olabilir. Bu, sol ventrikülden toplanan arteriyel kanın kalitesini etkileyebilir. Sol ventrikülün kesin konumunu belirlemeyi zorlaştıracağından kalbi döndürmekten veya çevirmekten kaçının.</li>
		<li>Ötenazi yapın ve yerel kurumların yönergelerini izleyerek uygun bir yöntemle sağlayın. Örneğin, ötenazi servikal çıkık yoluyla yapılabilir ve kalp atışının kesilmesiyle doğrulanabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Kan örneklerini 10.000 x g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı bir pipet kullanarak dikkatlice toplayın. Süpernatant, kullanılan kan alma tüpünün tipine bağlı olarak serum veya plazma içermelidir. Burada durulabilir ve GC-MS analizi için serum işlemine kadar numuneler -20 °C'de saklanabilir. NOT: Kırmızı renkli süpernatan gözlenirse hemoliz potansiyel olarak meydana gelmiş olabilir. Hemolizi önlemek için, pıhtılaşma tamamlanmadan önce numuneyi vorteksleyin. Glutamin ve laktat dahil olmak üzere bazı kırmızı kan hücresi ile zenginleştirilmiş metabolitler, verilerin yanlış yorumlanmasına yol açabilir, ancak çoğu metabolit hemolizden önemli ölçüde etkilenmeyebilir. Serum / plazmanın bir hafta içinde analiz edilmesi önerilir.</li>
</ol>3. Serumdan metabolit ekstraksiyonu ve kimyasal türevlendirme
<ol><li>Ekstraksiyon için hazırlık NOT: Metabolit ekstraksiyonu, türevlendirme ve veri analizi dahil olmak üzere tüm yöntemler, daha önce açıklanan yöntemlerinbiraz değiştirilmiş versiyonlarıdır 53,54.<ol><li>MS dereceli metanole 100 μM DL-norvalin çözeltisi, dahili standart (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyerek ekstraksiyon tamponunu hazırlayın.</li>
		<li>Tüm deneysel prosedürlerin buz üzerinde yapıldığından emin olun.</li>
	</ol></li>
	<li>Sulzer damarından veya sol ventrikülden ekstrakte edilen 10 μL fare serumunu, 40 μL ekstraksiyon tamponu içeren 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>Hücre kalıntılarını ve proteini çıkarmak için, serum örneklerini kısaca vorteksleyin, ardından 4 ° C'de 30 dakika boyunca maksimum hızda (18.000 x g) santrifüjleyin.</li>
	<li>Santrifüjlemeden sonra, 40 μL süpernatantı dikkatlice bir cam şişeye aktarın ve ardından 4 °C'de bir vakumlu santrifüjde 3 saat kurutun. NOT: Sonraki türevlendirme adımı boyunca kullanılan plastik-reaktif kimyasallar nedeniyle plastik tüpler yerine bir cam ek parça ( Malzeme Tablosuna bakınız) önerilir.</li>
	<li>Kurutulmuş numuneleri, serum metabolitlerinin GC-MS analizi için iki ardışık türevlendirme adımına tabi tutun. NOT: Solventlerin tahriş riski nedeniyle aşağıdaki adımlar çeker ocak altında gerçekleştirilmelidir.<ol><li>Kurutulmuş serum ekstraktlarını piridin içinde çözünmüş 30 μL 10 mg / mL metoksiyamin hidroklorür (Malzeme Tablosuna bakınız) içinde yeniden süspanse edin ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.</li>
		<li>Metabolitlerin sililasyonu için numuneleri, 70 ° C'de 70 ° C'de 1 saat boyunca 70 μL N-metil-N-tert-butildimetilsililrifloroasetamid (MTBSTFA, Malzeme Tablosuna bakınız) ile türevlendirin. NOT: Plastikle reaksiyona giren türevlendirme çözücüleri nedeniyle aşağıdaki adımlarda plastik uç yerine cam şırınga kullanılması tavsiye edilir.</li>
	</ol></li>
</ol>4. GC-MS kullanarak metabolomik analiz
NOT: Sulzer damarından ve sol ventrikülden türetilmiş örneklerde karbonhidratlar, amino asitler ve TCA döngüsü ara ürünleri dahil olmak üzere çeşitli serum metabolitlerini ölçmek için tek dörtlü GC-MS (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanıldı. Alternatif olarak başka sütunlar da kullanılabilir, ancak sıcaklık programı da dahil olmak üzere deneysel ayarlar kullanılan sütun türlerine bağlı olarak değişebilir.
<ol><li>1 μL türetilmiş numuneyi, 280 °C'de (giriş sıcaklığı) bölünmesiz modda, 1.500 mL/dak akış hızına (ayar noktası) sahip bir taşıyıcı gaz olarak helyum kullanarak GC'ye enjekte edin.</li>
	<li>Dört kutuplu 200 °C'de GC-MS arayüzü ile 300 °C'ye ayarlayın. NOT: Tüm metabolit analizleri için fırın programı 60 °C'de başlar, 1 dakika tutulur ve daha sonra sıcaklık 320 °C'ye ulaşana kadar 10 °C/dk hızında artırılır.</li>
	<li>70 eV'ye ayarlanmış elektron iyonizasyonu (EI) ile veri toplayın ve örnek verileri tarama modunda (50-550 m/z)53 alın. Bu çalışmada kullanılan tüm metabolitler, kütle spektrumlarını ve alıkonma sürelerini doğrulamak için daha önce standartlarla doğrulanmıştır.</li>
	<li>Piyasada bulunan bir analiz yazılımı kullanarak pik alan entegrasyonunu gerçekleştirin (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
	<li>Bileşikleri, her bir TBMDS türevinin ürün iyonu ile eşleştirin. Ardından, parça iyonunun m/z değerini karşılık gelen tepe alanına entegre ederek ekstraksiyon iyon kromatogramını (EIC) elde edin ve ardından dışa aktarın. Parça iyonları Tablo 1'de gösterilmiştir. NOT: Her bir bileşiğin EIC'si, her numunedeki DL-norvalininki ile normalleştirildi. Veriler, her normalleştirilmiş EIC değeri kullanılarak Log2 Sulzer veni ile sol ventriküle (Log2(SV/LV)) temsil edilir.</li>
</ol>

Kahverengi Yağ Dokusunda Metabolit Değişiminin Araştırılması

Yazarlar, bildirecekleri herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

BAT'ın tüm vücut enerji dengesindeki metabolik potansiyelini anlamanın kritik bir adımı, hangi besinleri tükettiğini, metabolik olarak nasıl işlendiğini ve dolaşıma hangi metabolitlerin salındığını tanımlamaktır. Bu protokol, yakın zamanda Park ve ark.42 tarafından geliştirilen ve onaylanan C57BL/6J farelerde interskapular BAT venöz vaskülatürüne ve sistemik arteriyel vaskülatüre erişim sağlayan özel bir arteriyovenöz örnekleme tekniğini tanıtmaktadır. Aşağı...

Kahverengi yağ dokusu (BAT), hem mitokondriyal ayrılmayan protein 1 (UCP1) bağımlı hem de UCP1'den bağımsız mekanizmaları 1,2,3,4,5 içeren, titremeyen termojenez (NST) olarak bilinen benzersiz bir enerji harcama özelliğine sahiptir. Bu ayırt edici özellikler, sistemik metabolizmanın düzenlenmesinde ve obezite, tip 2 diyabet, kardiyovasküler hastalık ve kanser kaşeksisi dahil olmak üzere metabolik hastalıkların patogenezinde BAT'ı içerir 6,7,8. Son retrospektif çalışmalar, insanlarda BAT kütlesi ve/veya metabolik aktivitesi ile obezite, hiperglisemi ve kardiyometabolik sağlık arasında ters bir ilişki olduğunu göstermiştir 9,10,11.
Son zamanlarda, BAT, termojenik yakıtolarak önemli miktarda dolaşımdaki besin maddesini gerektirdiğinden, NST'nin korunmasından sorumlu bir metabolik lavabo olarak önerilmiştir 6,7. Ayrıca BAT, endokrin ve/veya parakrin sinyaller olarak işlev gören kahverengi adipokinler veya BATokinler olarak adlandırılan biyoaktif faktörleri üretebilir ve serbest bırakabilir, bu da sistem düzeyinde metabolik homeostaza aktif katılımını gösterir 12,13,14,15. Bu nedenle, BAT'ın besin metabolizmasını anlamak, termoregülasyon organı olarak geleneksel rolünün ötesinde, insanlarda patofizyolojik önemi hakkındaki anlayışımızı geliştirmelidir.
Metabolize edilemeyen radyoizleyiciler kullanan klasik besin alım çalışmaları ile birlikte kararlı izotop izleyicileri kullanan metabolomik çalışmalar, hangi besin maddelerinin BAT tarafından tercihen alındığını ve nasıl kullanıldığını anlamamızı önemli ölçüde geliştirmiştir 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Örneğin, radyoaktif izleyici çalışmaları, soğukla aktive olan BAT'ın glikoz, lipoproteine bağlı yağ asitleri ve dallı zincirli amino asitleri aldığını göstermiştir 16,17,18,19,20,21,22,23,27. Metabolomik çalışmalarla birleştirilen son izotop izleme, bu besinlerin dokular ve kültürlenmiş hücreler içindeki metabolik kaderini ve akışını ölçmemize izin verdi 24,25,26,28,29,30. Bununla birlikte, bu analizler öncelikle besinlerin bireysel kullanımına odaklanmakta ve bizi BAT'ın organ metabolit değişimindeki sistem düzeyindeki rolleri hakkında sınırlı bilgi bırakmaktadır. BAT tarafından tüketilen dolaşımdaki besinlerin spesifik serileri ve bunların karbon ve nitrojen açısından nicel katkıları ile ilgili sorular belirsizliğini korumaktadır. Ek olarak, BAT'ın besinleri kullanarak metabolit kaynaklı BATokinler (örneğin lipokinler) üretip salgılayamayacağının araştırılması daha yeni başlıyor 12,13,14,15,31,32.
Arteriyovenöz kan analizi, organlarda/dokularda dolaşan moleküllerin spesifik alımını veya salınımını değerlendirmek için kullanılan klasik bir fizyolojik yaklaşımdır. Bu teknik daha önce oksijen ve çeşitli metabolitleri ölçmek için sıçanların interskapular BAT'ına uygulanmış, böylece katabolik potansiyeli 33,34,35,36,37 ile BAT'ı adaptif termojenezin ana bölgesi olarak oluşturmuştur. Son zamanlarda, sıçan interskapular BAT kullanılarak yapılan bir arteriyovenöz çalışma, termojenik olarak uyarılmış BAT38 tarafından salınan keşfedilmemiş BATokinlerin tanımlanmasına yol açan bir trans-omik yaklaşımla birleştirildi.
Yüksek hassasiyetli gaz kromatografisi ve sıvı kromatografisi kütle spektrometrisi (GC-MS ve LC-MS) tabanlı metabolomiklerdeki son gelişmeler, organa özgü metabolit değişiminin kantitatif analizi için arteriyovenöz çalışmalara olan ilgiyi yeniden alevlendirmiştir 39,40,41. Bu teknikler, yüksek çözme güçleri ve kütle doğrulukları ile, küçük numune miktarları kullanılarak çok çeşitli metabolitlerin kapsamlı analizini sağlar.
Bu gelişmelerle uyumlu olarak, yakın zamanda yapılan bir çalışma, arteriyovenöz metabolomikleri fare düzeyinde BAT'yi incelemek için başarıyla uyarladı ve farklı koşullar altında BAT'deki metabolit değişim aktivitelerinin kantitatif analizini sağladı42. Bu makale, bir C57BL/6J fare modelinde GC-MS kullanılarak BAT hedefli bir arteriyovenöz metabolomik protokol sunmaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5-20 &#181;L Filter Tips</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>AX.TF-20-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe with attached needle - 26 G 5/8&#34;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 5977B GC/MSD (mass selective detector)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G7077B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 7693A Autosampler</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G4513A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 8890 GC System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G3542A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent J&#38;W GC column (Capilary column) HP-5MS UI</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>19091S-433UI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent MassHunter Workstation software_MS Quantitative analysis(Quant-My-way)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G3335-90240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mouse</td>
			<td>DBL</td>
			<td>C57BL/6JBomTac</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CentriVap -50 &#176;C Cold Trap (with Stainless steel Lid)</td>
			<td>LABCONCO&#160;</td>
			<td>7811041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Norvaline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N7502-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf centrifuge 5430R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5428000210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass insert 250 &#956;L&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5181-1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS grade)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Q34966-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxyamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>226904-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvette&#160;200 Serum, 200 &#181;L, cap red, flat base</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>20.1290.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTBSTFA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>394882-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridine(anhydrous, 99.8%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270970-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated CentriVap Complete Vaccum Concentrators</td>
			<td>LABCONCO&#160;</td>
			<td>7310041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent diet</td>
			<td>SAFE</td>
			<td>SAFE R+40-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent incubator</td>
			<td>Power scientific</td>
			<td>RIT33SD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Fine Pen Needles - 29 G 1/2&#34;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>328203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial Cap 9 mm</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-9067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial, ambr scrw wrtn 2 mL</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-9063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial, ambr scrw wrtn 2 mL+A2:C40</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02-C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

arteriovenous metabolomics to measure in vivo metabolite exchange in brown adipose tissue

Kahverengi yağ dokusu (BAT), titremeyen termojenez olarak bilinen benzersiz bir enerji harcama süreci yoluyla metabolik homeostazın düzenlenmesinde çok önemli bir rol oynar. Bunu başarmak için BAT, yüksek metabolik talebini desteklemek için dolaşımdaki besinlerden oluşan çeşitli bir menü kullanır. Ek olarak, BAT, metabolik yakıtlar veya sinyal molekülleri olarak hizmet edebilen metabolit kaynaklı biyoaktif faktörleri salgılar ve BAT aracılı doku içi ve/veya dokular arası iletişimi kolaylaştırır. Bu, BAT'ın keşfedilmeye başlanan ilginç bir özellik olan sistemik metabolit değişimine aktif olarak katıldığını göstermektedir. Burada, in vivo fare düzeyinde optimize edilmiş BAT arteriyovenöz metabolomikler için bir protokol sunuyoruz. Protokol, termojenik stimülasyonlar için ilgili yöntemlere ve interskapular BAT kaynaklı venöz kanı ve sistemik arteriyel kanı seçici olarak boşaltan Sulzer damarını kullanan bir arteriyovenöz kan örnekleme tekniğine odaklanmaktadır. Daha sonra, bu kan örneklerini kullanan bir gaz kromatografisi tabanlı metabolomik protokol gösterilmiştir. Bu tekniğin kullanımı, BAT tarafından metabolitlerin net alımını ve salınımını ölçerek organlar arası düzeyde BAT tarafından düzenlenen metabolit değişiminin anlaşılmasını genişletmelidir.

Brown adipose tissue (BAT) possesses a unique energy expenditure property known as non-shivering thermogenesis (NST), which involves both mitochondrial uncoupling protein 1 (UCP1)-dependent and UCP1-independent mechanisms1,2,3,4,5. These distinctive characteristics implicate BAT in the regulation of systemic metabolism and the pathogenesis of metabolic diseases, including obesity, type 2 diabetes, cardiovascular disease, and cancer cachexia6,7,8. Recent retrospective studies have shown an inverse association between BAT mass and/or its metabolic activity with obesity, hyperglycemia, and cardiometabolic health in humans9,10,11.
Recently, BAT has been proposed as a metabolic sink responsible for maintaining NST, as it requires substantial amounts of circulating nutrients as thermogenic fuel6,7. Furthermore, BAT can generate and release bioactive factors, referred to as brown adipokines or BATokines, which act as endocrine and/or paracrine signals, indicating its active involvement in systems-level metabolic homeostasis12,13,14,15. Therefore, understanding BAT&#39;s nutrient metabolism should enhance our understanding of its pathophysiological significance in humans, beyond its conventional role as a thermoregulatory organ.
Metabolomic studies employing stable isotope tracers, in combination with classic nutrient uptake studies using non-metabolizable radiotracers, have significantly improved our understanding of which nutrients are preferentially taken up by BAT and how they are utilized16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. For instance, radioactive tracer studies have demonstrated that cold-activated BAT takes up glucose, lipoprotein-bound fatty acids, and branched-chain amino acids16,17,18,19,20,21,22,23,27. Recent isotope tracing combined with metabolomic studies has allowed us to measure the metabolic fate and flux of these nutrients within tissues and cultured cells24,25,26,28,29,30. However, these analyses primarily focus on the individual utilization of nutrients, leaving us with limited knowledge of BAT&#39;s systems-level roles in organ metabolite exchange. Questions regarding the specific series of circulating nutrients consumed by BAT and their quantitative contributions in terms of carbon and nitrogen remain elusive. Additionally, the exploration of whether BAT can generate and release metabolite-derived BATokines (e.g., lipokines) using nutrients is just beginning12,13,14,15,31,32.
Arteriovenous blood analysis is a classic physiological approach used to assess the specific uptake or release of circulating molecules in organs/tissues. This technique has previously been applied to the interscapular BAT of rats to measure oxygen and several metabolites, thereby establishing BAT as the major site of adaptive thermogenesis with its catabolic potential33,34,35,36,37. Recently, an arteriovenous study using rat interscapular BAT was coupled with a trans-omics approach, leading to the identification of undiscovered BATokines released by thermogenically stimulated BAT38.
Recent advances in high-sensitivity gas chromatography- and liquid chromatography-mass spectrometry (GC-MS and LC-MS)-based metabolomics have reignited interest in arteriovenous studies for the quantitative analysis of organ-specific metabolite exchange39,40,41. These techniques, with their high resolving power and mass accuracy, enable the comprehensive analysis of a wide range of metabolites using small sample quantities.
In alignment with these advancements, a recent study successfully adapted arteriovenous metabolomics for studying BAT at the mouse level, enabling the quantitative analysis of metabolite exchange activities in BAT under different conditions42. This article presents a BAT-targeted arteriovenous metabolomics protocol using GC-MS in a C57BL/6J mouse model.

Yazar Spotlight: Yağ Dokusu Metabolizması ve Hastalıkların Önlenmesi için Yeni Yolların Aydınlatılması 

Kahverengi Yağ Dokusunda İn Vivo Metabolit Değişimini Ölçmek için Arteriyovenöz Metabolomikler

Şekil 1 , BAT için optimize edilmiş AV metabolomiklerinin deneysel şemasını göstermektedir. Protokol bölümünde belirtildiği gibi, diferansiyel olarak uyarılmış kahverengi yağ dokuları elde etmek için fareler, kemirgen inkübatörleri kullanılarak sıcaklığa alıştırılır veya β-adrenerjik reseptör agonistleri gibi farmakolojik uygulama alırlar. Daha sonra fareler uyuşturulur ve metabolomik analiz için kan örnekleri alınır (Şekil 1A</strong...

Watch this Scientific Journal Video about Illuminating New Avenues for Adipose Tissue Metabolism and Disease Prevention at JoVE.com

Bu protokolde, bir fare modelinde GC-MS kullanılarak BAT ile optimize edilmiş arteriyovenöz metabolomikler ile ilgili yöntemler özetlenmiştir. Bu yöntemler, organizma düzeyinde BAT aracılı metabolit değişimi hakkında değerli bilgiler edinilmesine izin verir.

Brown adipose tissue (BAT) plays a crucial role in regulating metabolic homeostasis through a unique energy expenditure process known as non-shivering ...

Laboratuvarımız, yağ dokusu metabolizmasını ve fizyolojisini düzenlemek için sinyal yollarının ve metabolik yolların işbirliği yaptığı mekanizmaları tanımlamakla ilgilenmektedir. Ve bu yaklaşımla, obezite ve diyabet gibi enerji dengesizliklerinin neden olduğu metabolik hastalıkları önlemenin veya hedeflemenin bir yolunu bulmayı amaçlıyoruz. Protokolümüzün en büyük avantajı, arteriyel venöz kan örneklemesi ve metabolomik analiz için geleneksel sıçan modelinden fare modeline geçmemizdir.Bu geçişin, kahverengi yağ araştırmaları için altın standart genetik modelleri kullanarak bulgularımızı daha hızlı doğrulamamıza izin vereceğine inanıyoruz.

arteriovenous-metabolomics-to-measure-vivo-metabolite-exchange-brown

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Arteriovenous Metabolomics to Measure In Vivo Metabolite Exchange in Brown Adipose Tissue

1.0K Görüntüleme.  Sungkyunkwan University (SKKU). Laboratuvarımız, yağ dokusu metabolizmasını ve fizyolojisini düzenlemek için sinyal yollarının ve metabolik yolların işbirliği yaptığı mekanizmaları tanımlamakla ilgilenmektedir. Ve bu yaklaşımla, obezite ve diyabet gibi enerji dengesizliklerinin neden olduğu metabolik hastalıkları önlemenin veya hedeflemenin bir yolunu bulmayı amaçlıyoruz. Protokolümüzün en büyük avantajı, arteriyel venöz kan örneklemesi ve metabolomik analiz için geleneksel sıçan modelin...

Video: Yazar Spotlight: Yağ Dokusu Metabolizması ve Hastalıkların Önlenmesi için Yeni Yolların Aydınlatılması 

Brown adipose tissue (BAT) plays a crucial role in regulating metabolic homeostasis through a unique energy expenditure process known as non-shivering thermogenesis. To achieve this, BAT utilizes a diverse menu of circulating nutrients to support its high metabolic demand. Additionally, BAT secretes metabolite-derived bioactive factors that can serve as either metabolic fuels or signaling molecules, facilitating BAT-mediated intratissue and/or intertissue communication. This suggests that BAT actively participates in systemic metabolite exchange, an interesting feature that is beginning to be explored. Here, we introduce a protocol for in vivo mouse-level optimized BAT arteriovenous metabolomics. The protocol focuses on relevant methods for thermogenic stimulations and an arteriovenous blood sampling technique using Sulzer's vein, which selectively drains interscapular BAT-derived venous blood and systemic arterial blood. Next, a gas chromatography-based metabolomics protocol using those blood samples is demonstrated. The use of this technique should expand the understanding of BAT-regulated metabolite exchange at the inter-organ level by measuring the net uptake and release of metabolites by BAT.

In this protocol, methods relevant for BAT-optimized arteriovenous metabolomics using GC-MS in a mouse model are outlined. These methods allow for the acquisition of valuable insights into BAT-mediated metabolite exchange at the organismal level.