نشكر جميع أعضاء مختبرات تشوي وجونغ على المناقشة المنهجية. نشكر C. Jang و D. Guertin على المشورة والتعليقات. نشكر M.S. Choi على القراءة النقدية للمخطوطة. تم تمويل هذا العمل من قبل NRF-2022R1C1C1012034 إلى S.M.J. ؛ NRF-2022R1C1C1007023 إلى DWC ؛ NRF-2022R1A4A3024551 إلى S.M.J. و D.W.C. تم دعم هذا العمل من قبل جامعة Chungnam الوطنية ل WTK تم إنشاء الشكل 1 والشكل 2 باستخدام BioRender (http://biorender.com/).

استكشاف تبادل الأيض في الأنسجة الدهنية البنية

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم تضارب في المصالح للإبلاغ عنه.

تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة في فهم الإمكانات الأيضية لأفضل التقنيات المتاحة في توازن طاقة الجسم بالكامل في تحديد العناصر الغذائية التي يستهلكها ، وكيفية معالجتها الأيضية ، وما هي المستقلبات التي يتم إطلاقها في الدورة الدموية. يقدم هذا البروتوكول تقنية متخصصة لأخذ العينات الشريانية الور?...

تمتلك الأنسجة الدهنية البنية (BAT) خاصية فريدة لإنفاق الطاقة تعرف باسم توليد الحرارة غير المرتعش (NST) ، والتي تتضمن كلا من البروتينات المعتمدة على فصل الميتوكوندريا 1 (UCP1) والآليات المستقلة عن UCP11،2،3،4،5. هذه الخصائص المميزة تورط BAT في تنظيم التمثيل الغذائي الجهازي والتسبب في أمراض التمثيل الغذائي ، بما في ذلك السمنة ومرض السكري من النوع 2 وأمراض القلب والأوعية الدموية ودنف السرطان6،7،8. أظهرت الدراسات الحديثة بأثر رجعي وجود ارتباط عكسي بين كتلة BAT و / أو نشاطها الأيضي مع السمنة وارتفاع السكر في الدم وصحة القلب والأوعية الدموية لدى البشر9،10،11.
في الآونة الأخيرة ، تم اقتراح BAT كحوض استقلابي مسؤول عن الحفاظ على NST ، لأنه يتطلب كميات كبيرة من العناصر الغذائية المتداولة كوقود حراري 6,7. علاوة على ذلك ، يمكن ل BAT توليد وإطلاق عوامل نشطة بيولوجيا ، يشار إليها باسم adipokines البنية أو BATokines ، والتي تعمل كإشارات للغدد الصماء و / أو paracrine ، مما يشير إلى مشاركتها النشطة في التوازن الأيضي على مستوى الأنظمة12،13،14،15. لذلك ، فإن فهم استقلاب المغذيات في BAT يجب أن يعزز فهمنا لأهميتها الفيزيولوجية المرضية في البشر ، بما يتجاوز دورها التقليدي كجهاز منظم للحرارة.
وقد أدت الدراسات الأيضية التي تستخدم مقتفيات النظائر المستقرة، بالاقتران مع الدراسات التقليدية لامتصاص المغذيات باستخدام المقتفيات الإشعاعية غير القابلة للاستقلاب إلى تحسين فهمنا للمغذيات التي تمتصها أفضل التقنيات المتاحة بشكل تفضيلي وكيفية استخدامها16،17،18،19،20،21،22،23،24،25، 26,27. على سبيل المثال ، أظهرت دراسات التتبع الإشعاعي أن BAT المنشط على البارد يمتص الجلوكوز والأحماض الدهنية المرتبطة بالبروتين الدهني والأحماض الأمينية متفرعة السلسلة16،17،18،19،20،21،22،23،27. سمح لنا تتبع النظائر الحديثة جنبا إلى جنب مع الدراسات الأيضية بقياس المصير الأيضي وتدفق هذه العناصر الغذائية داخل الأنسجة والخلايا المستزرعة24،25،26،28،29،30. ومع ذلك ، تركز هذه التحليلات في المقام الأول على الاستخدام الفردي للمغذيات ، مما يترك لنا معرفة محدودة بأدوار BAT على مستوى الأنظمة في تبادل مستقلب الأعضاء. ولا تزال الأسئلة المتعلقة بالسلسلة المحددة من المغذيات المتداولة التي تستهلكها أفضل التقنيات المتاحة ومساهماتها الكمية من حيث الكربون والنيتروجين بعيدة المنال. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استكشاف ما إذا كان BAT يمكن أن يولد ويطلق BATokines المشتقة من الأيض (على سبيل المثال ، الليبوكينات) باستخدام العناصر الغذائية قد بدأ للتو12،13،14،15،31،32.
تحليل الدم الشرياني الوريدي هو نهج فسيولوجي كلاسيكي يستخدم لتقييم امتصاص أو إطلاق الجزيئات المتداولة في الأعضاء / الأنسجة. تم تطبيق هذه التقنية سابقا على BAT بين الكتفين للفئران لقياس الأكسجين والعديد من المستقلبات ، وبالتالي إنشاء BAT كموقع رئيسي للتوليد الحراري التكيفي مع إمكاناته التقويضية33،34،35،36،37. في الآونة الأخيرة ، اقترنت دراسة شريانية وريدية باستخدام BAT بين كتفي الفئران بنهج عبر omics ، مما أدى إلى تحديد BATokines غير المكتشفة التي أطلقتها BAT38 المحفزة حراريا.
أدت التطورات الحديثة في علم الأيض القائم على كروماتوغرافيا الغاز عالية الحساسية والكروماتوغرافيا السائلة (GC-MS و LC-MS) إلى إعادة الاهتمام بالدراسات الشريانية الوريدية للتحليل الكمي لتبادل المستقلب الخاص بالأعضاء39،40،41. تتيح هذه التقنيات ، بقدرتها العالية على التحليل ودقة الكتلة ، التحليل الشامل لمجموعة واسعة من المستقلبات باستخدام كميات عينات صغيرة.
تماشيا مع هذه التطورات ، نجحت دراسة حديثة في تكييف الأيض الشرياني الوريدي لدراسة أفضل التقنيات المتاحة على مستوى الماوس ، مما مكن من التحليل الكمي لأنشطة تبادل الأيض في أفضل التقنيات المتاحة في ظل ظروف مختلفة42. تقدم هذه المقالة بروتوكول الأيض الشرياني الوريدي المستهدف باستخدام GC-MS في نموذج الماوس C57BL / 6J.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5-20 &#181;L Filter Tips</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>AX.TF-20-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe with attached needle - 26 G 5/8&#34;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 5977B GC/MSD (mass selective detector)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G7077B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 7693A Autosampler</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G4513A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 8890 GC System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G3542A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent J&#38;W GC column (Capilary column) HP-5MS UI</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>19091S-433UI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent MassHunter Workstation software_MS Quantitative analysis(Quant-My-way)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G3335-90240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mouse</td>
			<td>DBL</td>
			<td>C57BL/6JBomTac</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CentriVap -50 &#176;C Cold Trap (with Stainless steel Lid)</td>
			<td>LABCONCO&#160;</td>
			<td>7811041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Norvaline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N7502-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf centrifuge 5430R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5428000210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass insert 250 &#956;L&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5181-1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS grade)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Q34966-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxyamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>226904-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvette&#160;200 Serum, 200 &#181;L, cap red, flat base</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>20.1290.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTBSTFA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>394882-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridine(anhydrous, 99.8%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270970-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated CentriVap Complete Vaccum Concentrators</td>
			<td>LABCONCO&#160;</td>
			<td>7310041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent diet</td>
			<td>SAFE</td>
			<td>SAFE R+40-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent incubator</td>
			<td>Power scientific</td>
			<td>RIT33SD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Fine Pen Needles - 29 G 1/2&#34;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>328203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial Cap 9 mm</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-9067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial, ambr scrw wrtn 2 mL</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-9063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial, ambr scrw wrtn 2 mL+A2:C40</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02-C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

arteriovenous metabolomics to measure in vivo metabolite exchange in brown adipose tissue

تلعب الأنسجة الدهنية البنية (BAT) دورا مهما في تنظيم التوازن الأيضي من خلال عملية فريدة لإنفاق الطاقة تعرف باسم توليد الحرارة غير المرتجف. لتحقيق ذلك، تستخدم BAT قائمة متنوعة من العناصر الغذائية المتداولة لدعم الطلب الأيضي المرتفع. بالإضافة إلى ذلك ، تفرز BAT العوامل النشطة بيولوجيا المشتقة من الأيض والتي يمكن أن تكون بمثابة وقود أيضي أو جزيئات إشارة ، مما يسهل الاتصال داخل الأنسجة بوساطة BAT و / أو الاتصال بين الأنسجة. هذا يشير إلى أن BAT تشارك بنشاط في تبادل الأيض النظامي ، وهي ميزة مثيرة للاهتمام بدأ استكشافها. هنا ، نقدم بروتوكولا ل BAT تحسين الأيض الشرياني الوريدي على مستوى الماوس الحي . يركز البروتوكول على الطرق ذات الصلة للتحفيز الحراري وتقنية أخذ عينات الدم الشرياني الوريدي باستخدام وريد سولزر ، الذي يستنزف بشكل انتقائي الدم الوريدي المشتق من BAT والدم الشرياني الجهازي. بعد ذلك ، يتم عرض بروتوكول الأيض القائم على كروماتوغرافيا الغاز باستخدام عينات الدم هذه. وينبغي أن يؤدي استخدام هذه التقنية إلى توسيع نطاق فهم تبادل الأيضات التي تنظمها أفضل التقنيات المتاحة على المستوى المشترك بين الأعضاء عن طريق قياس صافي امتصاص وإطلاق المستقلبات بواسطة أفضل التقنيات المتاحة.

Brown adipose tissue (BAT) possesses a unique energy expenditure property known as non-shivering thermogenesis (NST), which involves both mitochondrial uncoupling protein 1 (UCP1)-dependent and UCP1-independent mechanisms1,2,3,4,5. These distinctive characteristics implicate BAT in the regulation of systemic metabolism and the pathogenesis of metabolic diseases, including obesity, type 2 diabetes, cardiovascular disease, and cancer cachexia6,7,8. Recent retrospective studies have shown an inverse association between BAT mass and/or its metabolic activity with obesity, hyperglycemia, and cardiometabolic health in humans9,10,11.
Recently, BAT has been proposed as a metabolic sink responsible for maintaining NST, as it requires substantial amounts of circulating nutrients as thermogenic fuel6,7. Furthermore, BAT can generate and release bioactive factors, referred to as brown adipokines or BATokines, which act as endocrine and/or paracrine signals, indicating its active involvement in systems-level metabolic homeostasis12,13,14,15. Therefore, understanding BAT&#39;s nutrient metabolism should enhance our understanding of its pathophysiological significance in humans, beyond its conventional role as a thermoregulatory organ.
Metabolomic studies employing stable isotope tracers, in combination with classic nutrient uptake studies using non-metabolizable radiotracers, have significantly improved our understanding of which nutrients are preferentially taken up by BAT and how they are utilized16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. For instance, radioactive tracer studies have demonstrated that cold-activated BAT takes up glucose, lipoprotein-bound fatty acids, and branched-chain amino acids16,17,18,19,20,21,22,23,27. Recent isotope tracing combined with metabolomic studies has allowed us to measure the metabolic fate and flux of these nutrients within tissues and cultured cells24,25,26,28,29,30. However, these analyses primarily focus on the individual utilization of nutrients, leaving us with limited knowledge of BAT&#39;s systems-level roles in organ metabolite exchange. Questions regarding the specific series of circulating nutrients consumed by BAT and their quantitative contributions in terms of carbon and nitrogen remain elusive. Additionally, the exploration of whether BAT can generate and release metabolite-derived BATokines (e.g., lipokines) using nutrients is just beginning12,13,14,15,31,32.
Arteriovenous blood analysis is a classic physiological approach used to assess the specific uptake or release of circulating molecules in organs/tissues. This technique has previously been applied to the interscapular BAT of rats to measure oxygen and several metabolites, thereby establishing BAT as the major site of adaptive thermogenesis with its catabolic potential33,34,35,36,37. Recently, an arteriovenous study using rat interscapular BAT was coupled with a trans-omics approach, leading to the identification of undiscovered BATokines released by thermogenically stimulated BAT38.
Recent advances in high-sensitivity gas chromatography- and liquid chromatography-mass spectrometry (GC-MS and LC-MS)-based metabolomics have reignited interest in arteriovenous studies for the quantitative analysis of organ-specific metabolite exchange39,40,41. These techniques, with their high resolving power and mass accuracy, enable the comprehensive analysis of a wide range of metabolites using small sample quantities.
In alignment with these advancements, a recent study successfully adapted arteriovenous metabolomics for studying BAT at the mouse level, enabling the quantitative analysis of metabolite exchange activities in BAT under different conditions42. This article presents a BAT-targeted arteriovenous metabolomics protocol using GC-MS in a C57BL/6J mouse model.

تسليط الضوء على المؤلف: إلقاء الضوء على طرق جديدة لاستقلاب الأنسجة الدهنية والوقاية من الأمراض 

الأيض الشرياني الوريدي لقياس تبادل الأيض في الجسم الحي في الأنسجة الدهنية البنية

Our lab is interested in identifying mechanisms by which signaling pathways and metabolic pathways collaborate to regulate adipose tissue metabolism and physiology. And through that approach, we aim to find a way to prevent or target metabolic diseases caused by energy imbalances such as obesity and diabetes. The major advantage of our protocol is we have shifted from the conventional rat model to using a mouse model for arterial venous blood sampling and metabolomic analysis.We believe that this transition will allow us to validate our findings using the gold standard genetic models more rapidly for brown fat research.

يوضح الشكل 1 المخطط التجريبي لاستقلاب AV المحسن ل BAT. كما هو مذكور في قسم البروتوكول ، للحصول على الأنسجة الدهنية البنية المحفزة بشكل تفاضلي ، تخضع الفئران للتأقلم في درجة الحرارة باستخدام حاضنات القوارض أو تتلقى الإدارة الدوائية مثل ناهضات مستقبلات β الأدرينالية. بعد ذلك ،...

Watch this Scientific Journal Video about Illuminating New Avenues for Adipose Tissue Metabolism and Disease Prevention at JoVE.com

في هذا البروتوكول ، يتم تحديد الطرق ذات الصلة بالأيض الشرياني الوريدي المحسن BAT باستخدام GC-MS في نموذج الماوس. تسمح هذه الطرق باكتساب رؤى قيمة في تبادل المستقلب بوساطة BAT على مستوى الكائن الحي.

Brown adipose tissue (BAT) plays a crucial role in regulating metabolic homeostasis through a unique energy expenditure process known as non-shivering ...

يهتم مختبرنا بتحديد الآليات التي تتعاون من خلالها مسارات الإشارات والمسارات الأيضية لتنظيم استقلاب الأنسجة الدهنية وعلم وظائف الأعضاء. ومن خلال هذا النهج ، نهدف إلى إيجاد طريقة لمنع أو استهداف الأمراض الأيضية الناجمة عن اختلالات الطاقة مثل السمنة ومرض السكري. الميزة الرئيسية لبروتوكولنا هي أننا تحولنا من نموذج الفئران التقليدي إلى استخدام نموذج الماوس لأخذ عينات الدم الوريدي الشرياني وتحليل التمثيل الغذائي.نعتقد أن هذا الانتقال سيسمح لنا بالتحقق من صحة النتائج التي توصلنا إليها باستخدام النماذج الجينية القياسية الذهبية بسرعة أكبر لأبحاث الدهون البنية.

arteriovenous-metabolomics-to-measure-vivo-metabolite-exchange-brown

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Arteriovenous Metabolomics to Measure In Vivo Metabolite Exchange in Brown Adipose Tissue

1.0K Views.  Sungkyunkwan University (SKKU). يهتم مختبرنا بتحديد الآليات التي تتعاون من خلالها مسارات الإشارات والمسارات الأيضية لتنظيم استقلاب الأنسجة الدهنية وعلم وظائف الأعضاء. ومن خلال هذا النهج ، نهدف إلى إيجاد طريقة لمنع أو استهداف الأمراض الأيضية الناجمة عن اختلالات الطاقة مثل السمنة ومرض السكري. الميزة الر?...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: إلقاء الضوء على طرق جديدة لاستقلاب الأنسجة الدهنية والوقاية من الأمراض 

Brown adipose tissue (BAT) plays a crucial role in regulating metabolic homeostasis through a unique energy expenditure process known as non-shivering thermogenesis. To achieve this, BAT utilizes a diverse menu of circulating nutrients to support its high metabolic demand. Additionally, BAT secretes metabolite-derived bioactive factors that can serve as either metabolic fuels or signaling molecules, facilitating BAT-mediated intratissue and/or intertissue communication. This suggests that BAT actively participates in systemic metabolite exchange, an interesting feature that is beginning to be explored. Here, we introduce a protocol for in vivo mouse-level optimized BAT arteriovenous metabolomics. The protocol focuses on relevant methods for thermogenic stimulations and an arteriovenous blood sampling technique using Sulzer's vein, which selectively drains interscapular BAT-derived venous blood and systemic arterial blood. Next, a gas chromatography-based metabolomics protocol using those blood samples is demonstrated. The use of this technique should expand the understanding of BAT-regulated metabolite exchange at the inter-organ level by measuring the net uptake and release of metabolites by BAT.

In this protocol, methods relevant for BAT-optimized arteriovenous metabolomics using GC-MS in a mouse model are outlined. These methods allow for the acquisition of valuable insights into BAT-mediated metabolite exchange at the organismal level.

Arteriovenous Blood Sampling Technique in Mice Using Sulzer's Vein and Left Ventricle for Metabolomic Analysis

Arteriovenous Blood Sampling Technique in Mice Using Sulzer&#039;s Vein and Left Ventricle for Metabolomic Analysis  

To begin, position the mouse on a dissection tray equipped with a nose cone for anesthesia delivery. Verify the animal's reflexes, such as paw retraction, to confirm that the anesthesia has reached an appropriate depth. Then, position the mouse to expose the dorsal skin.Dampen the skin with ample 70%ethanol to prevent hair detachment. Make an incision along the back, starting from the lower part of the thorax and extend it up to the neck. Using bent tip forceps, gently lift the interscapular brown adipose tissue and carefully cut the attached tissue.Lift the fat pad toward the head and continue cutting the attached tissues to carefully open the region until the Sulzer's vein is exposed. Now, carefully cut the Sulzer's vein. Using bottom cut 200 microliter pipette tip and a P100 pipette, collect approximately 40 microliters of blood and store the collected blood in a blood collection tube.Keep the tube on ice until the serum collection process. Dampen the ventral skin generously with 70%ethanol to prevent hair detachment. Using scissors, carefully open the thoracic cavity to expose the heart.Using a one milliliter syringe equipped with a 29-gauge half inch needle, precisely puncture the apex area of the left ventricle. Insert two-thirds of the needle approximately three to five millimeters to the right horizontal of the heart apex, and pull the syringe back to collect blood from the left ventricle. Then, centrifuge the blood samples at 10, 000G for 10 minutes at four degrees Celsius.Using a pipette, collect the supernatant and proceed with metabolite extraction and analysis.