אנו מודים לכל חברי מעבדות צ'וי ויונג על הדיון המתודולוגי. אנו מודים ל- C. Jang ו- D. Guertin על העצה והמשוב. אנו מודים למ.ס. צ'וי על הקריאה הביקורתית של כתב היד. עבודה זו מומנה על ידי NRF-2022R1C1C1012034 ל- S.M.J.; NRF-2022R1C1C1007023 ל-D.W.C; NRF-2022R1A4A3024551 ל- S.M.J. ו- D.W.C. עבודה זו נתמכה על-ידי האוניברסיטה הלאומית צ'ונגנם עבור W.T.K. איור 1 ואיור 2 נוצרו באמצעות BioRender (http://biorender.com/).

כל הניסויים נערכו באישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת סונגקיונקוואן (IACUC). עכברים שוכנו במתקן בעלי חיים שאושר על ידי IACUC הממוקם בחדר נקי שנקבע על 22 מעלות צלזיוס ו-45% לחות, לאחר מחזור יומי של 12 שעות אור/חושך. הם הוחזקו במדפים מאווררים והייתה להם גישה לדיאטת צ'או סטנדרטית (המורכבת מ-60% פחמימות, 16% חלבון ו-3% שומן). מצעים וחומרי קינון הוחלפו על בסיס שבועי. במחקר זה נעשה שימוש בעכברי C57BL/6J זכרים בני 12 שבועות ובמשקל שבין 25 גרם ל-30 גרם. בעלי חיים אלה הגיעו מספק מסחרי (ראו טבלת חומרים).
1. אפנון הפעילות המטבולית של רקמת השומן החום באמצעות אקלום טמפרטורה וגירוי תרופתי
הערה: אקלום טמפרטורה במשך מספר ימים עד שבועות או גירוי תרופתי באמצעות אגוניסטים לקולטן β-אדרנרגי הן שיטות נפוצות לוויסות פעילות BAT1. לכן, סקירה תמציתית של השיטה מובאת להלן כדי לאפשר לקוראים לבחור את הגישה המתאימה כנדרש. כדי לקבל BAT לא פעיל מטבולית (פחות תרמוגני), נבחרה טמפרטורת חום בסיסית, המכונה ניטרליות תרמית (28-30 מעלות צלזיוס), עבור עכברי C57BL/6J. טווח זה מבטיח שהעכברים לא יצטרכו להוציא אנרגיה נוספת כדי לשמור על טמפרטורת גוף קבועה. כדי להשיג BAT מטבולית צנועה או פעילה מאוד (תרמוגנית), ניתן לבחור בטמפרטורות קור קל (20-22 מעלות צלזיוס) או קור חמור (6 מעלות צלזיוס), בהתאמה. לצורך ניסוי זה, עכברים גודלו בתנאי דיור סטנדרטיים של 22 מעלות צלזיוס, אשר, למרות קור קל עבור עכברים, לא היו כרוכים בגירויים פרמקולוגיים כלשהם.
<ol><li>התאקלמות טמפרטורה<ol><li>הפרידו את העכברים כדי לאכלס עכבר אחד או שניים בכל כלוב לפחות שבוע לפני תחילת אקלום הטמפרטורה. הכינו אינקובטורים למכרסמים המצוידים בבקרת אוורור, טמפרטורה ולחות בתנאים הרצויים.</li>
		<li>העבירו את הכלובים לאינקובטורים המתאימים למכרסמים בימים המתאימים לסוג ההסתגלות הנבחר לטמפרטורה.</li>
		<li>ודא שהתפלגות מספרי העכברים אחידה בכל הקבוצות, עם עכבר אחד או שניים בכל כלוב. דיור יחיד מועדף מכיוון שהוא רגיש יותר לשינויים פיזיולוגיים הנגרמים על ידי טמפרטורה בהשוואה לדיור קבוצתי43. להלן תנאי הדיור הספציפיים לכל קבוצה:<ol><li>קבוצת ניטרליות תרמית (30°C): שמרו על העכברים בקבוצה זו ברציפות בטמפרטורה של 30°C למשך עד ארבעה שבועות.</li>
			<li>קבוצת קור קשה: בתחילה, לשכן את העכברים בקבוצה זו ב 18 מעלות צלזיוס ללא כל חומרי קינון. הם יחוו ירידה הדרגתית בטמפרטורה השבועית, ויגיעו ל -6 °C (66 °F) בשבוע הרביעי. התקדמות הטמפרטורה היא כדלקמן: 18 °C → 14 °C (75 °F) → 10 °C (75 °F) → 6 °C (66 °F).</li>
			<li>קבוצת קור קלה (20-22 מעלות צלזיוס): מאכלסים את העכברים בקבוצה זו באינקובטורים של מכרסמים באותם תנאים כמו תנאי דיור סטנדרטיים שהוזכרו קודם לכן.</li>
			<li>אתגרי קור אקוטיים: לאתגרי קור אקוטיים, הניחו 1-2 עכברים בכל כלוב ללא חומרי קינון וחשפו אותם לאינקובטור מכרסמים בטמפרטורה של 6 מעלות צלזיוס למשך עד 8 שעות. הערה: תנאי דיור אלה ושינויי טמפרטורה חיוניים לחקר ההשפעות של סביבות טמפרטורה שונות על פעילות BAT וחילוף חומרים.</li>
		</ol></li>
		<li>החליפו כלובים וחדשו מזון ומים מדי שבוע. יש להקדים את הכלובים לפחות 24 שעות לפני נטילת התוסף, בטמפרטורה המתאימה להם (אינקובטור מכרסמים). הערה: כדי למנוע הפרעה של גירוי הטמפרטורה המתאים, חשוב לא לספק העשרה עכברית שעלולה להוביל לבניית קן. בתגובה לקור עז, עכברים מוציאים יותר אנרגיה כדי לשמור על טמפרטורת הגוף, וכתוצאה מכך צריכת מזון מוגברת ושיעורי הפרשה גבוהים יותר. לכן, חשוב לבדוק את הכלובים לפחות פעמיים-שלוש בשבוע (בהתאם להנחיות המוסדיות המקומיות) כדי לוודא שלעכברים יש אספקה נאותה של מזון ומים ושהכלובים אינם רטובים יתר על המידה. ניטור זה חיוני לשמירה על רווחתם ובריאותם של העכברים במהלך המחקר.</li>
	</ol></li>
	<li>גירוי פרמקולוגי1 באמצעות אגוניסט לקולטן β3-אדרנרגי CL316,243<ol><li>כדי למקסם את אפקט הגירוי, מקמו את העכברים בטמפרטורה של ניטרליות תרמית (30°C) למשך 2-4 שבועות לפני הזרקות.</li>
		<li>לאחר תקופת ההתאקלמות, יש להזריק תוך צפקית 1 מ"ג/ק"ג CL316,243. הערה: עבור גירוי כרוני עם אגוניסט קולטן β3-adrenergic (למשל מ 3 ימים עד שבועות 1,44,45), זריקות יומיות נדרשות עקב יציבות התרופה. CL316,243 מדולל צריך להיות מוכן ביום ההזרקה עקב יציבות.</li>
	</ol></li>
</ol>2. דגימת דם עורקית
הערה: עכברים מעל 12-14 שבועות מומלצים ביותר לדגימת דם עורקית. ייתכן שלעכברים צעירים יותר אין וורידים בגודל מספיק של זולצר, כלי דם נפרד המנקז באופן ספציפי דם ורידי מה-BAT46 הבין-סקפולרי.
<ol><li>מרדימים בעדינות באמצעות וופורייזר מכויל עם 3% איזופלורן לאינדוקציה (בתא בגודל 205 x 265 x 200 מ"מ) ו-2% איזופלורן לתחזוקה (עם מסכת הרדמה גז). הערה: יש לבצע את כל הליך דגימת הדם העורקי מיד לאחר ההרדמה. ניתן להשתמש בכרית חימום מחוממת במים במהלך ההרדמה כדי לשמור על טמפרטורת הגוף הליבה. אזהרה: איזופלורן נדיף מאוד ורעיל בשאיפה. לכן, הרדמה ראשונית חייבת להתבצע תחת מכסה אדים.</li>
	<li>אמת את הרפלקסים של בעל החיים כגון נסיגת כפות כדי לוודא שההרדמה הגיעה לעומק מתאים.</li>
	<li>איסוף דם ורידי מווריד הזלצר<ol><li>מקם את העכבר כדי לחשוף את העור הגבי, לאשר את עומק ההרדמה באמצעות צביטת בוהן ממש לפני ביצוע החתך. יש להרטיב את העור הגבי עם אתנול בשפע של 70% כדי למנוע ניתוק שיער, ולבצע חתך לאורך הגב מהחלק התחתון של בית החזה עד הצוואר. הערה: העטלף הבין-סקפולרי ממוקם ממש מתחת לעור, ומורכב משתי רפידות שומן המכוסות ברקמות שומן לבנות דקות. חשוב לוודא כי העכבר נשאר תחת הרדמה באמצעות מסכת הרדמה גז.</li>
		<li>הרימו בעדינות את ה-BAT הבין-סקפולרי בעזרת מלקחיים מכופפים וחתכו בזהירות את הרקמות המצורפות, שרובן שרירים. הרימו את כרית השומן לכיוון הראש, המשיכו לחתוך את הרקמות המחוברות ופתחו בזהירות את האזור עד לחשיפת וריד הזולצר (כלי דם אדום כהה גדול בצורת 'Y' המחובר לשתי כריות השומן של עטלף בין-סקפולרי). הערה: היזהר לא לחתוך את כלי הדם הנימים של רקמות שריר הקשורים לאזור הקדמי והצידי של BAT interscapular, שכן פעולה זו תפחית באופן משמעותי את כמות ואיכות הדם המתנקז מווריד זולצר.</li>
		<li>בזהירות לחתוך את הווריד של Sulzer, ולאסוף כ 40 μL של דם באמצעות חתך תחתון 200 μL פיפטה קצוות פיפטה פיפטה P100. אחסנו את הדם בצינור איסוף דם ושמרו את הצינורית על קרח עד לתהליך איסוף הסרום. הערה: חשוב לאסוף דם ממש מתחת לנקודת החלוקה בצורת Y של וריד זולצר, כדי למנוע זיהום דם מהווריד הוורידי העליון קאווה47. איסוף יותר מדי דם יפחית את המאפיינים של הווריד של זולצר. לכן, הקפד לאסוף את כמות הדם המינימלית הדרושה מן הווריד של Sulzer לניתוח. היו מתחשבים בבחירת צינורות איסוף הדם, שכן סרום ופלזמה מניבים פרופילי מטבוליטים שונים 48,49,50. עבור אוסף פלזמה, יש צורך להשתמש צינורות מצופים הפרין. בניסוי זה נבחרו צינורות מצופים אקטיבטור קרישה לקבלת סרום. בשום פנים ואופן אין להשתמש בצינורות מצופים EDTA, מכיוון ש- EDTA משפיע באופן משמעותי על אותות ספקטרומטריית מסה51,52.</li>
	</ol></li>
	<li>איסוף דם עורקי מהחדר השמאלי<ol><li>הפוך את העכבר מבלי לאבד מגע עם חרוט האף, כדי לחשוף את העור הגחוני. יש לוודא את עומק ההרדמה באמצעות צביטת בוהן לפני ביצוע החתך. להרטיב את העור הגחוני עם כמות מספקת של 70% אתנול כדי למנוע ניתוק שיער, בזהירות לפתוח את חלל החזה עם מספריים כדי לחשוף את הלב מבלי לפגוע בכל מבנה פנימי.</li>
		<li>נקב במדויק את אזור הקודקוד של החדר השמאלי באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט 29 גרם (1/2 אינץ'). הכניסו שני שלישים של מחט בגודל 1/2 אינץ' ל-3-5 מ"מ לרוחב הימני של קודקוד הלב (איור 1B), ומשכו את המזרק לאחור כדי לאסוף דם מהחדר השמאלי (50-100 מיקרוליטר). דם מהחדר השמאלי הוא דם עורקי מחומצן שהוא אדום בוהק. אחסנו את הדם בצינור איסוף דם, ושמרו את הצינורית על קרח עד לתהליך איסוף הסרום. הערה: יש לבצע חתך מינימלי בחלל החזה לצורך גישה ללב. חתך יתר עלול להוביל לדימום מקומי, אשר עלול לגרום לאחר מכן ללחץ דם נמוך. זה יכול להשפיע על איכות הדם העורקי שנאסף מהחדר השמאלי. הימנע סיבוב או היפוך הלב, כפי שהוא יקשה על קביעת המיקום המדויק של החדר השמאלי.</li>
		<li>לבצע המתת חסד ולהבטיח אותה בשיטה מתאימה בהתאם להנחיות המוסדות המקומיים. לדוגמה, המתת חסד יכולה להתבצע באמצעות פריקת צוואר הרחם ואושר על ידי הפסקת פעימות הלב.</li>
	</ol></li>
	<li>דגימות דם צנטריפוגטיות ב 10,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. בזהירות לאסוף את supernatant באמצעות פיפטה. הסופרנאטנט צריך להכיל סרום או פלזמה בהתאם לסוג צינור איסוף הדם בו משתמשים. אפשר לעצור כאן ולאחסן את הדגימות ב -20 מעלות צלזיוס עד עיבוד הסרום לניתוח GC-MS. הערה: ייתכן שהמוליזה התרחשה אם נצפית סופרנאטנט בצבע אדום. כדי למנוע המוליזה, מערבלים את הדגימה לפני השלמת הקרישה. חלק מהמטבוליטים המועשרים בכדוריות דם אדומות, כולל גלוטמין ולקטט, עלולים להוביל לפרשנות שגויה של נתונים, אם כי רוב המטבוליטים עשויים שלא להיות מושפעים באופן משמעותי מהמוליזה. מומלץ לנתח את הסרום/פלזמה תוך שבוע.</li>
</ol>3. מיצוי מטבוליטים מסרום ופירוק כימי
<ol><li>הכנה למיצוי הערה: כל השיטות, כולל מיצוי מטבוליטים, דה-ריווטציה וניתוח נתונים, הן גרסאות מעט שונות של שיטותשתוארו קודם לכן 53,54.<ol><li>הכן את מאגר המיצוי על ידי הוספת תמיסת 100 מיקרומטר של DL-norvaline, תקן פנימי (ראה טבלת חומרים), למתנול ברמת MS.</li>
		<li>ודא שכל הליכי הניסוי מתבצעים על קרח.</li>
	</ol></li>
	<li>מעבירים 10 μL של נסיוב עכברים המופק מווריד הזולצר או מהחדר השמאלי לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל המכיל 40 μL של חיץ מיצוי.</li>
	<li>כדי להסיר פסולת תאים וחלבון, מערבל לזמן קצר את דגימות הסרום, ולאחר מכן את הצנטריפוגה במהירות מרבית (18,000 x גרם) במשך 30 דקות ב 4 ° C.</li>
	<li>לאחר הצנטריפוגה, מעבירים בזהירות 40 μL של supernatant לתוך בקבוקון זכוכית ואחריו 3 שעות של ייבוש בצנטריפוגת ואקום ב 4 ° C. הערה: מומלץ להוסיף זכוכית (ראה טבלת חומרים) במקום צינורות פלסטיק עקב כימיקלים תגובתיים מפלסטיק המשמשים לאורך שלב הפירוק הבא.</li>
	<li>יש להעביר את הדגימות המיובשות לשני שלבי דה-ריווטציה רצופים לצורך ניתוח GC-MS של המטבוליטים בסרום. הערה: יש לבצע את השלבים הבאים תחת מכסה אדים עקב סיכוני גירוי של הממסים.<ol><li>יש להשהות מחדש את תמציות הסרום המיובשות ב-30 מיקרוליטר של 10 מ"ג/מ"ל מתוקסיאמין הידרוכלוריד (ראו טבלת חומרים) מומס בפירידין ולדגור עליו בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות.</li>
		<li>נטרל דגימות עבור סילילציה של מטבוליטים עם 70 μL של N-methyl-N-tert-butyldimethylsilylrifluoroacetamide (MTBSTFA, ראה טבלה של חומרים) ב 70 ° C במשך 1 שעות. הערה: מומלץ להשתמש במזרק זכוכית במקום בקצה פלסטיק בשלבים הבאים עקב ממיסי הפירוק המגיבים עם פלסטיק.</li>
	</ol></li>
</ol>4. ניתוח מטבולומיקה באמצעות GC-MS
הערה: GC-MS מרובע יחיד (ראה טבלת חומרים) שימש למדידת המטבוליטים השונים בסרום, כולל פחמימות, חומצות אמינו ומתווכי מחזור TCA בדגימות שעברו דיבוע מווריד זולצר ומהחדר השמאלי. לחלופין, ניתן להשתמש בעמודות אחרות, אם כי הגדרות הניסוי כולל תוכנית הטמפרטורה עשויות להשתנות בהתאם לסוגי העמודות בהן נעשה שימוש.
<ol><li>הזריקו 1 μL של הדגימה המפורקת ל-GC במצב מפוצל ב-280°C (טמפרטורת כניסה), תוך שימוש בהליום כגז נשא עם קצב זרימה של 1,500 מ"ל/דקה (נקודה מוגדרת).</li>
	<li>הגדר את המרובע ב- 200 ° C עם ממשק GC-MS ב- 300 ° C. הערה: תוכנית התנור עבור כל ניתוחי המטבוליטים מתחילה ב 60 ° C, מוחזקת במשך דקה אחת, ולאחר מכן מוגברת בקצב של 10 ° C / min עד הטמפרטורה מגיעה 320 ° C.</li>
	<li>אסוף נתונים על ידי יינון אלקטרונים (EI) המוגדר על 70 eV וקבל את נתוני הדגימה במצב סריקה (50-550 m/z)53. כל המטבוליטים ששימשו במחקר זה אומתו בעבר עם תקנים לאישור ספקטרום מסה וזמני שמירה.</li>
	<li>בצע אינטגרציה של אזור שיא באמצעות תוכנת ניתוח זמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>התאימו את התרכובות למכפלה של כל נגזרת TBMDS. לאחר מכן, השג את כרומטוגרמה יון החילוץ (EIC) על ידי שילוב ערך m/z של יון המקטע באזור השיא המתאים, ולאחר מכן יצא אותו. יוני שבר מוצגים בטבלה 1. הערה: ה-EIC של כל תרכובת נורמל על ידי זה של DL-norvaline בכל דגימה. הנתונים מיוצגים על ידי וריד Log2 Sulzer לחדר השמאלי (Log2(SV/LV)) באמצעות כל ערך EIC מנורמל.</li>
</ol>

חקר חילוף מטבוליטים ברקמת שומן חום

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים לדווח עליהם.

צעד קריטי בהבנת הפוטנציאל המטבולי של BAT במאזן האנרגיה של כל הגוף הוא להגדיר אילו חומרים מזינים הוא צורך, כיצד הם מעובדים מטבולית, ואילו מטבוליטים משתחררים למחזור הדם. פרוטוקול זה מציג טכניקת דגימה עורקית מיוחדת המאפשרת גישה לכלי הדם הוורידיים של BAT בין-סקפולרי וכלי דם עורקיים מערכתיים בעכ?...

רקמת שומן חומה (BAT) היא בעלת תכונת הוצאת אנרגיה ייחודית הידועה בשם תרמוגנזה לא רועדת (NST), הכוללת הן את המנגנונים התלויים בחלבון 1 (UCP1) והן במנגנונים שאינם תלויים ב-UCP1 (UCP1) ו-UCP1 שאינםתלויים ב-UCP1 1,2,3,4,5. מאפיינים ייחודיים אלה משלבים BAT בוויסות חילוף החומרים המערכתי ובפתוגנזה של מחלות מטבוליות, כולל השמנת יתר, סוכרת מסוג 2, מחלות לב וכלי דם וסרטן קכסיה 6,7,8. מחקרים רטרוספקטיביים אחרונים הראו קשר הפוך בין מסת BAT ו / או הפעילות המטבולית שלה עם השמנת יתר, היפרגליקמיה, ובריאות cardiometabolic בבני אדם 9,10,11.
לאחרונה, BAT הוצע ככיור מטבולי האחראי על שמירה על NST, מכיוון שהוא דורש כמויות משמעותיות של חומרים מזינים במחזור כמו דלק תרמוגני 6,7. יתר על כן, BAT יכול ליצור ולשחרר גורמים ביו-אקטיביים, המכונים אדיפוקינים חומים או BATokines, הפועלים כאותות אנדוקריניים ו / או פרקריניים, המצביעים על מעורבותו הפעילה בהומאוסטזיס מטבולי ברמת המערכת 12,13,14,15. לכן, הבנת חילוף החומרים התזונתי של באט אמורה לשפר את הבנתנו את משמעותו הפתופיזיולוגית בבני אדם, מעבר לתפקידו הקונבנציונלי כאיבר תרמו-רגולטורי.
מחקרים מטאבולומיים המשתמשים בעוקבי איזוטופים יציבים, בשילוב עם מחקרי ספיגת חומרים מזינים קלאסיים המשתמשים ברדיוטרייסרים שאינם ניתנים לחילוף חומרים, שיפרו באופן משמעותי את הבנתנו אילו חומרים מזינים נלקחים באופן מועדף על ידי BAT וכיצד הם מנוצלים 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 ,26,27. לדוגמה, מחקרי נותב רדיואקטיבי הראו כי BAT המופעל בקור לוקח גלוקוז, חומצות שומן הקשורות לליפופרוטאין, וחומצות אמינו מסועפות שרשרת 16,17,18,19,20,21,22,23,27. מעקב איזוטופים עדכני בשילוב עם מחקרים מטבוליים אפשרו לנו למדוד את הגורל המטבולי והשטף של חומרים מזינים אלה בתוך רקמות ותאים בתרבית 24,25,26,28,29,30. עם זאת, ניתוחים אלה מתמקדים בעיקר בניצול אינדיבידואלי של חומרים מזינים, ומשאירים אותנו עם ידע מוגבל על התפקידים ברמת המערכות של BAT בחילוף מטבוליטים של איברים. שאלות לגבי הסדרה הספציפית של חומרים מזינים במחזור הדם הנצרכים על ידי BAT ותרומותיהם הכמותיות במונחים של פחמן וחנקן נותרו חמקמקות. בנוסף, המחקר האם BAT יכול לייצר ולשחרר BATokines שמקורם במטבוליטים (למשל, ליפוקינים) באמצעות חומרים מזינים רק מתחיל 12,13,14,15,31,32.
ניתוח דם עורקי הוא גישה פיזיולוגית קלאסית המשמשת להערכת ספיגה או שחרור ספציפיים של מולקולות במחזור הדם באיברים/רקמות. טכניקה זו יושמה בעבר על BAT interscapular של חולדות כדי למדוד חמצן וכמה מטבוליטים, ובכך ביסס BAT כאתר העיקרי של תרמוגנזה אדפטיבית עם הפוטנציאל הקטבולי שלה 33,34,35,36,37. לאחרונה, מחקר עורקי באמצעות BAT interscapular של חולדות שולב בשילוב עם גישה טרנס-אומיקס, מה שהוביל לזיהוי של BATokines שלא התגלו ששוחררו על ידי BAT38 מגורה תרמוגנית.
ההתקדמות האחרונה בספקטרומטריית מסה מבוססת כרומטוגרפיית גז וכרומטוגרפיה נוזלית ברגישות גבוהה (GC-MS ו- LC-MS) הציתה מחדש את העניין במחקרים עורקיים לניתוח כמותי של חילופי מטבוליטים ספציפיים לאיברים 39,40,41. טכניקות אלה, עם כוח הרזולוציה הגבוה שלהן ודיוק המסה שלהן, מאפשרות ניתוח מקיף של מגוון רחב של מטבוליטים באמצעות כמויות מדגם קטנות.
בהתאם להתקדמות זו, מחקר שנערך לאחרונה התאים בהצלחה מטבולומיקה עורקית לחקר BAT ברמת העכבר, ואיפשר ניתוח כמותי של פעילויות חילופי מטבוליטים ב- BAT בתנאים שונים42. מאמר זה מציג פרוטוקול מטבולומיקה עורקית ממוקד BAT באמצעות GC-MS במודל עכבר C57BL/6J.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5-20 &#181;L Filter Tips</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>AX.TF-20-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe with attached needle - 26 G 5/8&#34;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 5977B GC/MSD (mass selective detector)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G7077B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 7693A Autosampler</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G4513A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 8890 GC System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G3542A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent J&#38;W GC column (Capilary column) HP-5MS UI</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>19091S-433UI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent MassHunter Workstation software_MS Quantitative analysis(Quant-My-way)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G3335-90240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mouse</td>
			<td>DBL</td>
			<td>C57BL/6JBomTac</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CentriVap -50 &#176;C Cold Trap (with Stainless steel Lid)</td>
			<td>LABCONCO&#160;</td>
			<td>7811041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Norvaline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N7502-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf centrifuge 5430R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5428000210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass insert 250 &#956;L&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5181-1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS grade)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Q34966-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxyamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>226904-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvette&#160;200 Serum, 200 &#181;L, cap red, flat base</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>20.1290.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTBSTFA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>394882-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridine(anhydrous, 99.8%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270970-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated CentriVap Complete Vaccum Concentrators</td>
			<td>LABCONCO&#160;</td>
			<td>7310041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent diet</td>
			<td>SAFE</td>
			<td>SAFE R+40-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent incubator</td>
			<td>Power scientific</td>
			<td>RIT33SD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Fine Pen Needles - 29 G 1/2&#34;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>328203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial Cap 9 mm</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-9067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial, ambr scrw wrtn 2 mL</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-9063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial, ambr scrw wrtn 2 mL+A2:C40</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02-C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

arteriovenous metabolomics to measure in vivo metabolite exchange in brown adipose tissue

רקמת שומן חום (BAT) ממלאת תפקיד מכריע בוויסות הומאוסטזיס מטבולי באמצעות תהליך ייחודי של הוצאת אנרגיה המכונה תרמוגנזה שאינה רועדת. כדי להשיג זאת, BAT משתמשת בתפריט מגוון של חומרים מזינים במחזור כדי לתמוך בביקוש המטבולי הגבוה שלה. בנוסף, BAT מפריש גורמים ביו-אקטיביים שמקורם במטבוליטים שיכולים לשמש כדלקים מטבוליים או מולקולות איתות, מה שמקל על תקשורת תוך-רקמתית ו/או בין-רקמתית בתיווך BAT. זה מצביע על כך ש- BAT משתתף באופן פעיל בחילופי מטבוליטים מערכתיים, תכונה מעניינת שמתחילה להיחקר. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור metabolomics arteriovenous BAT ממוטב ברמת עכבר in vivo . הפרוטוקול מתמקד בשיטות רלוונטיות לגירויים תרמוגניים ובטכניקת דגימת דם עורקית באמצעות וריד זולצר, המנקז באופן סלקטיבי דם ורידי בין-סקפולרי שמקורו ב-BAT ודם עורקי סיסטמי. לאחר מכן, מודגם פרוטוקול מטאבולומיקה מבוסס כרומטוגרפיית גז באמצעות דגימות דם אלה. השימוש בטכניקה זו אמור להרחיב את ההבנה של חילופי מטבוליטים מווסתים על ידי BAT ברמה הבין-איברית על ידי מדידת ספיגה נטו ושחרור של מטבוליטים על ידי BAT.

Brown adipose tissue (BAT) possesses a unique energy expenditure property known as non-shivering thermogenesis (NST), which involves both mitochondrial uncoupling protein 1 (UCP1)-dependent and UCP1-independent mechanisms1,2,3,4,5. These distinctive characteristics implicate BAT in the regulation of systemic metabolism and the pathogenesis of metabolic diseases, including obesity, type 2 diabetes, cardiovascular disease, and cancer cachexia6,7,8. Recent retrospective studies have shown an inverse association between BAT mass and/or its metabolic activity with obesity, hyperglycemia, and cardiometabolic health in humans9,10,11.
Recently, BAT has been proposed as a metabolic sink responsible for maintaining NST, as it requires substantial amounts of circulating nutrients as thermogenic fuel6,7. Furthermore, BAT can generate and release bioactive factors, referred to as brown adipokines or BATokines, which act as endocrine and/or paracrine signals, indicating its active involvement in systems-level metabolic homeostasis12,13,14,15. Therefore, understanding BAT&#39;s nutrient metabolism should enhance our understanding of its pathophysiological significance in humans, beyond its conventional role as a thermoregulatory organ.
Metabolomic studies employing stable isotope tracers, in combination with classic nutrient uptake studies using non-metabolizable radiotracers, have significantly improved our understanding of which nutrients are preferentially taken up by BAT and how they are utilized16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. For instance, radioactive tracer studies have demonstrated that cold-activated BAT takes up glucose, lipoprotein-bound fatty acids, and branched-chain amino acids16,17,18,19,20,21,22,23,27. Recent isotope tracing combined with metabolomic studies has allowed us to measure the metabolic fate and flux of these nutrients within tissues and cultured cells24,25,26,28,29,30. However, these analyses primarily focus on the individual utilization of nutrients, leaving us with limited knowledge of BAT&#39;s systems-level roles in organ metabolite exchange. Questions regarding the specific series of circulating nutrients consumed by BAT and their quantitative contributions in terms of carbon and nitrogen remain elusive. Additionally, the exploration of whether BAT can generate and release metabolite-derived BATokines (e.g., lipokines) using nutrients is just beginning12,13,14,15,31,32.
Arteriovenous blood analysis is a classic physiological approach used to assess the specific uptake or release of circulating molecules in organs/tissues. This technique has previously been applied to the interscapular BAT of rats to measure oxygen and several metabolites, thereby establishing BAT as the major site of adaptive thermogenesis with its catabolic potential33,34,35,36,37. Recently, an arteriovenous study using rat interscapular BAT was coupled with a trans-omics approach, leading to the identification of undiscovered BATokines released by thermogenically stimulated BAT38.
Recent advances in high-sensitivity gas chromatography- and liquid chromatography-mass spectrometry (GC-MS and LC-MS)-based metabolomics have reignited interest in arteriovenous studies for the quantitative analysis of organ-specific metabolite exchange39,40,41. These techniques, with their high resolving power and mass accuracy, enable the comprehensive analysis of a wide range of metabolites using small sample quantities.
In alignment with these advancements, a recent study successfully adapted arteriovenous metabolomics for studying BAT at the mouse level, enabling the quantitative analysis of metabolite exchange activities in BAT under different conditions42. This article presents a BAT-targeted arteriovenous metabolomics protocol using GC-MS in a C57BL/6J mouse model.

מחבר זרקור: מאירים דרכים חדשות למטבוליזם של רקמת שומן ומניעת מחלות 

מטבולומיקה עורקית למדידה בחילוף מטבוליטים של Vivo ברקמת שומן חומה

Our lab is interested in identifying mechanisms by which signaling pathways and metabolic pathways collaborate to regulate adipose tissue metabolism and physiology. And through that approach, we aim to find a way to prevent or target metabolic diseases caused by energy imbalances such as obesity and diabetes. The major advantage of our protocol is we have shifted from the conventional rat model to using a mouse model for arterial venous blood sampling and metabolomic analysis.We believe that this transition will allow us to validate our findings using the gold standard genetic models more rapidly for brown fat research.

איור 1 מדגים את סכמת הניסוי של מטבולומיקה AV ממוטבת BAT. כפי שהוזכר בסעיף הפרוטוקול, כדי להשיג רקמות שומן חום מגורה באופן דיפרנציאלי, עכברים עוברים אקלום טמפרטורה באמצעות אינקובטורים מכרסמים או מקבלים טיפול תרופתי כגון אגוניסטים לקולטן β-אדרנרגי. לאחר מכן, עכברים מורדמים, וד?...

Watch this Scientific Journal Video about Illuminating New Avenues for Adipose Tissue Metabolism and Disease Prevention at JoVE.com

בפרוטוקול זה מתוארות שיטות רלוונטיות למטבוליקה עורקית מותאמת ל-BAT באמצעות GC-MS במודל עכבר. שיטות אלה מאפשרות רכישת תובנות יקרות ערך לגבי חילופי מטבוליטים בתיווך BAT ברמת האורגניזם.

Brown adipose tissue (BAT) plays a crucial role in regulating metabolic homeostasis through a unique energy expenditure process known as non-shivering ...

המעבדה שלנו מעוניינת לזהות מנגנונים שבאמצעותם מסלולי איתות ומסלולים מטבוליים משתפים פעולה כדי לווסת את חילוף החומרים של רקמת השומן ואת הפיזיולוגיה. ובאמצעות גישה זו, אנו שואפים למצוא דרך למנוע או להתמקד במחלות מטבוליות הנגרמות על ידי חוסר איזון אנרגטי כגון השמנת יתר וסוכרת. היתרון העיקרי של הפרוטוקול שלנו הוא שעברנו ממודל החולדות הקונבנציונלי לשימוש במודל עכברי לדגימת דם ורידי עורקים וניתוח מטבולי.אנו מאמינים כי מעבר זה יאפשר לנו לאמת את ממצאינו באמצעות מודלים גנטיים של תקן הזהב במהירות רבה יותר למחקר שומן חום.

arteriovenous-metabolomics-to-measure-vivo-metabolite-exchange-brown

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Arteriovenous Metabolomics to Measure In Vivo Metabolite Exchange in Brown Adipose Tissue

1.0K Views.  Sungkyunkwan University (SKKU). המעבדה שלנו מעוניינת לזהות מנגנונים שבאמצעותם מסלולי איתות ומסלולים מטבוליים משתפים פעולה כדי לווסת את חילוף החומרים של רקמת השומן ואת הפיזיולוגיה. ובאמצעות גישה זו, אנו שואפים למצוא דרך למנוע או להתמקד במחלות מטבוליות הנגרמות על ידי חוסר איזון אנרגטי כגון השמנת יתר וסוכ...

Video: מחבר זרקור: מאירים דרכים חדשות למטבוליזם של רקמת שומן ומניעת מחלות 

Brown adipose tissue (BAT) plays a crucial role in regulating metabolic homeostasis through a unique energy expenditure process known as non-shivering thermogenesis. To achieve this, BAT utilizes a diverse menu of circulating nutrients to support its high metabolic demand. Additionally, BAT secretes metabolite-derived bioactive factors that can serve as either metabolic fuels or signaling molecules, facilitating BAT-mediated intratissue and/or intertissue communication. This suggests that BAT actively participates in systemic metabolite exchange, an interesting feature that is beginning to be explored. Here, we introduce a protocol for in vivo mouse-level optimized BAT arteriovenous metabolomics. The protocol focuses on relevant methods for thermogenic stimulations and an arteriovenous blood sampling technique using Sulzer's vein, which selectively drains interscapular BAT-derived venous blood and systemic arterial blood. Next, a gas chromatography-based metabolomics protocol using those blood samples is demonstrated. The use of this technique should expand the understanding of BAT-regulated metabolite exchange at the inter-organ level by measuring the net uptake and release of metabolites by BAT.

In this protocol, methods relevant for BAT-optimized arteriovenous metabolomics using GC-MS in a mouse model are outlined. These methods allow for the acquisition of valuable insights into BAT-mediated metabolite exchange at the organismal level.

Arteriovenous Blood Sampling Technique in Mice Using Sulzer's Vein and Left Ventricle for Metabolomic Analysis

Arteriovenous Blood Sampling Technique in Mice Using Sulzer&#039;s Vein and Left Ventricle for Metabolomic Analysis  

To begin, position the mouse on a dissection tray equipped with a nose cone for anesthesia delivery. Verify the animal's reflexes, such as paw retraction, to confirm that the anesthesia has reached an appropriate depth. Then, position the mouse to expose the dorsal skin.Dampen the skin with ample 70%ethanol to prevent hair detachment. Make an incision along the back, starting from the lower part of the thorax and extend it up to the neck. Using bent tip forceps, gently lift the interscapular brown adipose tissue and carefully cut the attached tissue.Lift the fat pad toward the head and continue cutting the attached tissues to carefully open the region until the Sulzer's vein is exposed. Now, carefully cut the Sulzer's vein. Using bottom cut 200 microliter pipette tip and a P100 pipette, collect approximately 40 microliters of blood and store the collected blood in a blood collection tube.Keep the tube on ice until the serum collection process. Dampen the ventral skin generously with 70%ethanol to prevent hair detachment. Using scissors, carefully open the thoracic cavity to expose the heart.Using a one milliliter syringe equipped with a 29-gauge half inch needle, precisely puncture the apex area of the left ventricle. Insert two-thirds of the needle approximately three to five millimeters to the right horizontal of the heart apex, and pull the syringe back to collect blood from the left ventricle. Then, centrifuge the blood samples at 10, 000G for 10 minutes at four degrees Celsius.Using a pipette, collect the supernatant and proceed with metabolite extraction and analysis.