Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (42307173 ve 42107328) ve Ulusal Temel Araştırma ve Geliştirme Programı (2022YFD1500202 ve 2022YFF1001800) tarafından mali olarak desteklenmiştir. P.W, Z.X çalışmayı tasarladı. P.W, B.X, Z.C, J.X ve N.Z verileri analiz etti ve rakamları oluşturdu. P.W el yazmasının ilk taslağını yazdı. Z.X., R.Z. ve Q.S. el yazmasını gözden geçirdiler.

Bu protokol genellikle çeşitli bitkilerden elde edilen rizosfer toprak mikrobiyotasına uygulanabilir. Burada örnek olarak salatalık kullanılmıştır. Çalışma için kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. Bakteri izolasyonu
<ol><li>Rizosfer toprak izolasyonu<ol><li>Salatalık kültürü<ol><li>Salatalık tohumlarını% 75 etanol ve% 2 sodyum hipoklorit (NaClO) çözeltisi ile dezenfekte edin, ardından steril sudadurulayın 11.</li>
			<li>Tohumları steril koşullar altında çimlendirin ve iki yapraklı aşama12'ye ulaşanları seçin. Daha sonra, sürekli olarak filizlenen salatalık fidelerini 2 kg kara toprak içeren saksılara nakledin. NOT: Sistematik hataları azaltmak için Kuzeydoğu Çin'in farklı yerlerinden iki tür kara toprak kullanılmaktadır.</li>
		</ol></li>
		<li>Toprak süspansiyonu hazırlığı<ol><li>Aşağıdaki formülasyonu kullanarak PBS-S tamponunu hazırlayın: 6.33 g NaH2PO4 · H2O, 16.5 g Na2HPO4·7H2O, 200 μL Silwet L-77 ve 1 L damıtılmış su.</li>
			<li>Fideler dört yapraklı aşama12'ye ulaştığında, saksıyı ters çevirin ve sterilize edilmiş eldivenler kullanarak kökleri 2 mm kalınlığındaki rizosfer toprağı ile birlikte izole edin.</li>
			<li>Kökleri 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde 30 mL PBS-S tamponuna yerleştirin. 20 dakika çalkaladıktan sonra, kökleri ve büyük tortuları çıkarmak için süspansiyonu 100 μm'lik bir naylon hücre filtreden süzün.</li>
			<li>Süzüntüyü başka bir 50 mL'lik santrifüj tüpüne aktarın, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 3200 x g'da santrifüjleyin ve geçici olarak 4 °C'de saklayın.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Rizosfer toprak bakteri hücrelerinin ekstraksiyonu. NOT: Bu metodoloji, diferansiyel santrifüjleme yöntemini13 benimser, ancak Nycodenz yoğunluk gradyan santrifüjleme yöntemi14 bu adım için de geçerlidir.<ol><li>Toprak süspansiyonunu %0.2 Na4P2O7 çözeltisiile 500 mL'ye seyreltin ve başlangıçta organizmaları topraktan ayırmak için 1.000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin.</li>
		<li>Çökeltiyi yeniden homojenize edin, aynı düşük hızda 60 saniye santrifüjleyin ve işlemi üç kez tekrarlayın. Süpernatanları birleştirin, 20 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüjleyin ve ardından süpernatanı atın.</li>
		<li>Çökeltiyi, rizosfer toprak bakteri hücresi süspansiyonunu oluşturan 50 mL PBS-S tamponunda yeniden süspanse edin.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Rizosfer biyofilm mikrobiyotasının dizilimi ve tanımlanması
<ol><li>Medya hazırlığı NOT: Triptik soya suyu (TSB) ve Minimal tuzlar gliserol glutamat (MSgg) ortamları ticari olarak temin edilebilir. Aşağıdaki formülasyonlar sadece referans amaçlıdır.<ol><li>Aşağıdaki formülasyonu kullanarak TSB ortamını hazırlayın: 15 μg/mL tripton, 5 μg/mL soya peptonu, 5 μg/mL NaCl, pH = 7.</li>
		<li>Aşağıdaki formülasyonu kullanarak MSgg ortamını hazırlayın: 5 mM KH2PO4, 100 mM 3- (N-morfolino) propan sülfonik asit (MOPS), 2 mM MgCl2, 700 μM CaCl2, 50 μM MnCl2, 50 μM FeCl3, 1 μM ZnCl2, 2 μM tiamin,% 0.5 gliserol,% 0.5 glutamat, 50 μg / mL triptofan, 50 μg / mL fenilalanin, pH = 7 olur.</li>
		<li>TSB-MSgg ortamını hazırlamak için, TSB ortamını MSgg ortamıyla 1:1 oranında (v/v)15 karıştırın.</li>
	</ol></li>
	<li>Pelikül biyofilm kokültürü<ol><li>Bakterileri aktive etmek için hücre süspansiyonunu TSB ortamında gece boyunca (genellikle 12 saat) 30 ° C'de inkübe edin.</li>
		<li>100 μm naylon hücre filtrelerini 24 oyuklu plakalara yerleştirin. Bakterileri TSB ortamında inkübe edin ve üç tekrar ayarlayın. Pelikül biyofilmini 30 °C'de 36 saat boyunca kurutun. NOT: Son adımdaki pelikül biyofilmi iyi işlenmemişse, TSB-MSgg besiyeri, TSB besiyeri için etkili bir ikamedir.</li>
		<li>Pelikül biyofilmini içeren filtreyi çıkarın. Yeni bir 24 oyuklu hücre plakasına 2 mL PBS-S tamponu ekleyin, biyofilmi yıkamak için 24 oyuklu filtreyi içine yerleştirin ve serbest hücreleri çıkarın. Yıkama işlemini üç kez tekrarlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Pelikül biyofilm DNA'sının ekstraksiyonu<ol><li>Üreticinin talimatlarını izleyerek bir DNA kiti kullanarak biyofilm genomunu çıkarın.</li>
	</ol></li>
	<li>Yüksek verimli sıralama NOT: Biyoteknoloji şirketleri, çoğu laboratuvar için sıralama deneylerinin tamamlanmasına yardımcı olabilir. Kalan çözeltide mikrobiyal bileşime ihtiyaç duyulursa, bu adımda sıralayın. Sıralama adımı, aletlere bağlı olarak değişir. Lütfen üreticinin talimatlarına uyun. Adım 2.4.1 sadece referans içindir.<ol><li>Tam uzunlukta 16S rRNA gen dizileri ile veri tabanına dayalı olarak 16S rRNA geninin V3-V4 bölgelerini amplifiye edin. Örnek başına minimum dizi sayısına göre tür OTU'ları oluşturun16. Tür sınıflandırma ek açıklamalarını kümeleyin ve her örnekten toplulukların kompozisyonlarını elde edin.</li>
		<li>Sıralama verilerine dayanarak, nispi bollukları açısından ilk beş suşu seçin.</li>
	</ol></li>
	<li>Yüksek verimli bakteri izolasyonu ve kültürü NOT: Bu adım, en son mikrobiyolojik ve biyoinformatik metodolojiyegöre tasarlanmıştır 17. Seyreltme kaplı plaka yöntemi, yüksek verimli tekniklere kıyasla daha fazla zaman alıcı ve daha az hedefli olmasına rağmen, burada bakteri izolasyonu için mevcuttur.<ol><li>Ekili biyofilmi karıştırın. 24 oyuklu plakadaki oyukların %30'undan fazlasının bakteri üremesi göstermemesini sağlamak için sınırlayıcı seyreltme kullanın. NOT: En uygun seyreltmeyi belirlemek için, çok çeşitli seyreltme oranları kullanarak ön deneyler yapın. Optimal seyreltme, kuyucukların% 30'undan daha azında bakteri inkübasyonunu temsil eden mililitre başına ikiden fazla kültürlenebilir bakteri içermemelidir.</li>
		<li>Kuyucuklar ve plakalar için etiketler eklerken bakterilerin 16S rRNA genini amplifiye edin ve bunları yüksek verimli Illumina platformu17 kullanarak sıralayın.</li>
		<li>Her kültür için saflık ve tür taksonomik bilgileri elde etmek için ticari olarak mevcut yazılımları kullanarak biyoinformatik analizler yapın.</li>
		<li>Sürekli hat kültürü ile en bol miktarda bulunan beş saf bakteriyi yetiştirin ve bakterileri -80 ° C'de korumak için gliserol kullanın.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Sentetik mikrobiyal toplulukların inşası
<ol><li>Yeniden yapılandırılmış biyofilm kültürü NOT: Ayrıntılar için lütfen Ren ve ark.18'e bakın. 5 suş, 5 tek tür, 10 iki tür, 10 üç tür, 5 dört tür ve 1 beş tür konsorsiyum dahil olmak üzere 31 sentetik kombinasyona karşılık gelir.<ol><li>5 suşu, etkinleştirmek için OD600'leri 1'e ulaşana kadar TSB ortamında inkübe edin.</li>
		<li>TSB besiyeri ile birkaç 24 oyuklu plaka hazırlayın ve üzerlerine 100 μm naylon hücre filtreleri yerleştirin. NOT: Son adımdan gelen biyofilm iyi işlenmemişse, TSB-MSgg ortamı, TSB ortamı için etkili bir ikamedir.</li>
		<li>Ortamdaki sentetik toplulukların 31 kombinasyonunu inkübe edin. Bakteri aşılama sayısının her kuyucukta tutarlı olduğundan emin olun. Her kombinasyon için üç tekrar ayarlayın.</li>
		<li>Biyofilmi 30 °C'de 36 saat boyunca kurutun.</li>
	</ol></li>
	<li>Pelikül biyofilminin miktar tayini<ol><li>Adım 2.2.3'teki prosedürün aynısını izleyin.</li>
		<li>Biyofilmi 180 μL kristal viyole çözeltisi içeren 24 oyuklu yeni bir plakaya aktarın ve 20 dakika boyunca boyayın.</li>
		<li>Lekeli numuneyi 200 μL %96 etanol içeren 24 oyuklu başka bir plakaya aktarın, 30 dakika boyunca elüte edin ve OD590'ı ölçün.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Pelikül hücre sayısı ölçümü
NOT: Her bir türün oranını ve pelikül ve kalan çözeltideki hücre sayılarını belirlemek için kantitatif PCR gereklidir. Ayrıntılar için Sun ve ark.16'ya bakın.
<ol><li>Seçilen sentetik mikrobiyal topluluklar için suşa özgü primerler tasarlayın.</li>
	<li>Genom karşılaştırmaları yapmak ve her bir izolatın suşa özgü tek kopya genlerini bulmak için Roary'yi kullanın. Primerlerin bu genleri hedeflediğinden emin olun.</li>
	<li>Amplifiye edilmiş fragmanları PMD19T plazmitlerine ligazlayın. Karşılık gelen parçaları içeren plazmitleri şablon olarak kullanarak standart eğriler oluşturun.</li>
	<li>Adım 2.2'de belirtilen adımların aynısını izleyin.</li>
	<li>Reaksiyon bileşenlerini şu şekilde hazırlayın: 7.2 μL H2O, 10 μL 2x qPCR Master karışımı, her bir primerden 0.4 μL 10 μM ve 2 μL şablon DNA.</li>
	<li>PCR'yi aşağıdaki koşullar altında Gerçek Zamanlı PCR Cihazı ile gerçekleştirin: 10 dakika boyunca 95 °C, 30 saniye boyunca 95 °C'lik 40 döngü ve 45 saniye boyunca 60 °C, ardından standart bir erime eğrisi segmenti.</li>
	<li>Her tedavi için altı biyolojik kopya gerçekleştirin.</li>
</ol>

Rizosfer Toprağından Sinerjik Çok Türlü Biyofilmler Geliştirme

<ol>
	<li>Davey, M. E., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+biofilms:+from+ecology+to+molecular+genetics.">Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 64 (4), 847-867 (2000).</li><li>Campbell, R., Greaves, M. P., Lynch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+community+structure+of+the+rhizosphere.">Anatomy and community structure of the rhizosphere.</a> Rhizosphere. , 11-34 (1990).</li><li>Berendsen, R. L., Pieterse, C. M., Bakker, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rhizosphere+microbiome+and+plant+health.">The rhizosphere microbiome and plant health.</a> Trends Plant Sci. 17 (8), 478-486 (2012).</li><li>Lugtenberg, B., Kamilova, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-growth-promoting+rhizobacteria.">Plant-growth-promoting rhizobacteria.</a> Annu Rev Microbiol. 63, 541-556 (2009).</li><li>Compant, S., Cl&#233;ment, C., Sessitsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+growth-promoting+bacteria+in+the+rhizo-+and+endosphere+of+plants:+Their+role,+colonization,+mechanisms+involved+and+prospects+for+utilization.">Plant growth-promoting bacteria in the rhizo- and endosphere of plants: Their role, colonization, mechanisms involved and prospects for utilization.</a> Soil Biol Biochem. 42, 669-678 (2010).</li><li>Bais, H. P., Fall, R. R., Vivanco, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocontrol+of+Bacillus+subtilis+against+infection+of+Arabidopsis+roots+by+Pseudomonas+syringae+is+facilitated+by+biofilm+formation+and+surfactin+production.">Biocontrol of Bacillus subtilis against infection of Arabidopsis roots by Pseudomonas syringae is facilitated by biofilm formation and surfactin production.</a> Plant Physiol. 134 (1), 307-319 (2004).</li><li>Trivedi, P., Leach, J. E., Tringe, S. G., Sa, T., Singh, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-microbiome+interactions:+From+community+assembly+to+plant+health.">Plant-microbiome interactions: From community assembly to plant health.</a> Nat Rev Microbiol. 18, 607-621 (2020).</li><li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+velezensis+stimulates+resident+rhizosphere+Pseudomonas+stutzeri+for+plant+health+through+metabolic+interactions.">Bacillus velezensis stimulates resident rhizosphere Pseudomonas stutzeri for plant health through metabolic interactions.</a> ISME J. 16, 774-787 (2021).</li><li>Pandhal, J., Noirel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+microbial+ecosystems+for+biotechnology.">Synthetic microbial ecosystems for biotechnology.</a> Biotechnol Lett. 36, 1141-1151 (2014).</li><li>Grosskopf, T., Soyer, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+microbial+communities.">Synthetic microbial communities.</a> Curr Opin Microbiol. 18, 72-77 (2014).</li><li>Lundberg, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+core+Arabidopsis+thaliana.+root+microbiome.">Defining the core Arabidopsis thaliana. root microbiome.</a> Nature. 488, 86-90 (2012).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+overlap+of+the+Arabidopsis+leaf+and+root+microbiota.">Functional overlap of the Arabidopsis leaf and root microbiota.</a> Nature. 528, 364-369 (2015).</li><li>Bakken, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+purification+of+bacteria+from+soil.">Separation and purification of bacteria from soil.</a> Appl Environ Microbiol. 49 (6), 1482-1487 (1985).</li><li>Yang, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+cell+extraction+from+fresh+and+stored+soil+samples:+Impact+on+microbial+viability+and+community+compositions.">Direct cell extraction from fresh and stored soil samples: Impact on microbial viability and community compositions.</a> Soil Biol Biochem. 155, 108178 (2021).</li><li>Ren, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+of+multispecies+biofilm+formation+and+quantitative+PCR-based+assessment+of+individual+species+proportions,+useful+for+exploring+interspecific+bacterial+interactions.">High-throughput screening of multispecies biofilm formation and quantitative PCR-based assessment of individual species proportions, useful for exploring interspecific bacterial interactions.</a> Microb Ecol. 68, 146-154 (2013).</li><li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+interactions+affect+the+biomass+of+synthetic+bacterial+biofilm+communities.">Metabolic interactions affect the biomass of synthetic bacterial biofilm communities.</a> mSystems. 8, e01045-e01123 (2023).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+cultivation+and+identification+of+bacteria+from+the+plant+root+microbiota.">High-throughput cultivation and identification of bacteria from the plant root microbiota.</a> Nat Protoc. 16, 988-1012 (2021).</li><li>Ren, D., Madsen, J. S., S&#248;rensen, S. J., Burnolle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+prevalence+of+biofilm+synergy+among+bacterial+soil+isolates+in+cocultures+indicates+bacterial+interspecific+cooperation.">High prevalence of biofilm synergy among bacterial soil isolates in cocultures indicates bacterial interspecific cooperation.</a> ISME J. 9, 81-89 (2015).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root+colonization+by+beneficial+rhizobacteria.">Root colonization by beneficial rhizobacteria.</a> FEMS Microbiol Rev. 48 (1), 066 (2024).</li><li>Palkov&#225;, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+microorganisms:+Laboratory+versus+nature.">Multicellular microorganisms: Laboratory versus nature.</a> EMBO Rep. 5, 470-476 (2004).</li><li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+communication+in+plant-microbe+beneficial+interactions:+a+toolbox+for+precise+management+of+beneficial+microbes.">Chemical communication in plant-microbe beneficial interactions: a toolbox for precise management of beneficial microbes.</a> Curr Opin Microbiol. 72, 102269 (2023).</li></ol>

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Protokolü takiben, farklı bitkilerden elde edilen rizosfer toprağındaki mikrobiyotaya dayalı olarak bir dizi sağlam sentetik çok türlü biyofilm topluluğu oluşturulur. Kantitatif PCR teknikleri kullanılarak, her topluluğun bileşimi net bir şekilde deşifre edilir. Biyofilmin biyokütlesi, potansiyel metabolik etkileşimlerinin gücünü gösterir, ancak işbirliğinin arkasındaki çeşitli özellikler ve mekanizmalar burada ortaya çıkarılamamıştır19. Doğal mikrobiyal topluluk...

Biyofilmler, yüzeylere yapıştırılmış veya arayüzlerle bağlantılı karmaşık mikrobiyal toplulukları temsil eder. Doğal yaşam alanları, klinik ortamlar ve endüstriyel bağlamlar gibi çeşitli ortamlarda karşılaşılan bakterilerin çoğunun biyofilm toplulukları içinde devam ettiği geniş bir kabul görmektedir1. Toprakta, kök yüzeyini ve bitişik 2 mm kalınlığındaki bölgeyi kapsayan rizosfer, yüksek besin mevcudiyeti ile ekolojik bir niş oluşturur. Spesifik bakteriler, mikrobiyal çoğalmayı teşvik ederek ve rizosferdebiyofilm topluluklarının oluşumunu teşvik ederek bu nişten yararlanmak için stratejiler geliştirmiştir 2.
Rizosfer mikropları, bitkilerin 'ikinci genomu' olarak kabul edilir3. Bitki büyümesini teşvik eden mikroorganizmalar (PGPM), bitkilerle karşılıklı simbiyoz yaparak önemli büyüme teşviki ve biyokontrol işlevleri sağlar4. Bir yandan, PGPM bitki köklerine besin sağlayabilir, besin alımını artırabilir, patojenlere karşı savunma yapabilir ve rizosfer toprağındaki kirleticileri bozabilir5. Öte yandan, PGPM, bitki kökü eksüdalarını büyüme ve evrim için bir besin kaynağı olarak kullanır ve böylece rizosfer toprağını ve kök sistemini kendi metabolizmaları yoluyla etkiler. Tüm bu işlevler için ön koşulun, PGPM'nin bitki rizosferinde etkili bir şekilde kolonizasyonu ve kararlı biyofilmleroluşturması olduğunu belirtmek gerekir 6.
Rizosfer biyofilmi, rizosfer mikroplarının montaj sürecini etkiler ve rizosfer mikrop montajının zamansal ve mekansal özellikleri, çok türlü biyofilm7'nin etkileşimi ile yakından ilişkilidir. Bitki-mikrobiyom etkileşimlerinin merkezi olarak hizmet eder ve etkili bir şekilde etkileşime girmeleri için istikrarlı ve kontrol edilebilir bir niş sağlar. Bu nedenle, rizosfer biyofilmini incelemek, bitkiler ve mikroplar arasındaki etkileşim hakkında fikir edinmek için de önemli bir yöndür.
Bununla birlikte, şu anda rizosfer çok türlü biyofilmler hakkında çok az araştırma bulunmaktadır. Mikrobiyom bileşiminin yüksek karmaşıklığı, doğal mikrobiyal toplulukları çevreleyen temel ekolojik soruları yanıtlamayı zorlaştırmaktadır8. Deney sürecinde, toprak tipi, bitki türü ve çok sayıda mikrobiyal topluluk gibi birçok koşulun dikkate alınması gerekir. Rizosfer çok türlü biyofilmlerin araştırılmasını çeşitli faktörler sınırlamaktadır.
Türler arası sinerjik etkileşimler veya metabolit çapraz beslemesi8 gibi rizosfer toprağından çok türlü biyofilm topluluklarını daha fazla araştırmak için, laboratuvar koşulları altında basitleştirilmiş, temsili, kararlı ve izlenebilir bir sentetik mikrobiyal topluluğun yapay olarak oluşturulması arzu edilir 9,10. Burada, standartlaştırılmış bir protokol, en son mikrobiyolojik ve biyoinformatik tekniklerin birkaçını birleştirir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 % Na4P2O7 solution</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.</td>
			<td>20041418</td>
			<td>Used to dilute the soil suspension.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;m Nylon Cell Filter</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.</td>
			<td>F613463-0001</td>
			<td>Used to filter culture solution and separate pellicle biofilm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% NaClO solution</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.</td>
			<td>L03336903</td>
			<td>Used to sterilize the seeds.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Plate</td>
			<td>Merck &#38; Co., Inc.</td>
			<td>PSRP010</td>
			<td>Used for micobial cultivation and pellicle biofilm separation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS)</td>
			<td>Bioolook Scientific Research Special</td>
			<td>2360010</td>
			<td>Used to prepare MSgg media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Beijing Su-bio Biotech Co., Ltd.</td>
			<td>62.547.254</td>
			<td>Properly-sized centrifuge tubes for our protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75% C2H5OH solution</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.</td>
			<td>801769680</td>
			<td>Used to sterilize the seeds.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acinetobacter baumannii XL-1</td>
			<td>Nanjing Agricultural University</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Strains isolated from rhizosphere soil.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacillus velezensis SQR9</td>
			<td>Nanjing Agricultural University</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Strains isolated from rhizosphere soil.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria DNA Kit</td>
			<td>Nanjing Dinsi Biotechnology Co.,Ltd.</td>
			<td>D3350020000K04U021</td>
			<td>Used to extract bacterial DNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Soil I</td>
			<td>Nanjing Agricultural University</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Black soil from Jilin Province.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Soil II</td>
			<td>Nanjing Agricultural University</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Black soil from Heilongjiang Province.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burkholderia cenocepacia XL-2</td>
			<td>Nanjing Agricultural University</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Strains isolated from rhizosphere soil.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Xilong Scientific Co.,Ltd.</td>
			<td>10035048</td>
			<td>Used to prepare MSgg media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.</td>
			<td>G508009-0001</td>
			<td>High-speed centrifuge.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChamQ SYBR qPCR Master Mix</td>
			<td>Vazyme Biotech Co.,Ltd.</td>
			<td>Q311-02</td>
			<td>Used for DNA amplification in qPCR.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean Bench</td>
			<td>Suzhou Antai Airtech Co., Ltd.</td>
			<td>NB026143</td>
			<td>Used for aseptic operation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant Temperature Incubator</td>
			<td>ShangHai CIMO Medical Instrument Co.,Ltd</td>
			<td>GNP-9080BS-<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66926/66926eq01.jpg" style="margin: auto;" /></td>
			<td>Used for microbial cultivation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cristal Violet Dye</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.</td>
			<td>A600331</td>
			<td>Used for pellicle biofilm staining and quantifivation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cucumber Seed</td>
			<td>Nanjing Agricultural University</td>
			<td>N/A</td>
			<td>&#34;Jinchun I&#34; cucumber seed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culturome v 1.0</td>
			<td>The Institute of Genetics and Developmental Biology of the Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used for high-throughput rhizosphere soil bacterial cultivation and identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>10011918</td>
			<td>Used to prepare MSgg media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fridge</td>
			<td>Hefei Midea Refrigerator Co.,Ltd.</td>
			<td>BCD-556WKPM(Q)</td>
			<td>Used for strain preservation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Bioolook Scientific Research Special</td>
			<td>2180020</td>
			<td>Used to prepare MSgg media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>10010618</td>
			<td>Used to prepare MSgg media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroponic Planting Basket</td>
			<td>Yulv Furniture Store</td>
			<td>6526262626</td>
			<td>Used for cucumber hydroponics.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Xilong Scientific Co.,Ltd.</td>
			<td>10017618</td>
			<td>Used to prepare MSgg media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Xilong Scientific Co.,Ltd.</td>
			<td>7791186</td>
			<td>Used to prepare MSgg media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2</td>
			<td>Xilong Scientific Co.,Ltd.</td>
			<td>10400101</td>
			<td>Used to prepare MSgg media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msgg Medium</td>
			<td>Shanghai Bioesn Biotechnology Co.,Ltd.</td>
			<td>BES20791KB</td>
			<td>Pellicle biofilm culture medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;7H2O</td>
			<td>Merck &#38; Co., Inc.</td>
			<td>S9390-100G</td>
			<td>Used to prepare TSB media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCI</td>
			<td>Chinasun Specialty Products co., Ltd.</td>
			<td>HS0416</td>
			<td>Used to prepare TSB media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;H2O</td>
			<td>Merck &#38; Co., Inc.</td>
			<td>S9638-25G</td>
			<td>Used to prepare TSB media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS-S Buffer</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.</td>
			<td>E607008-0001</td>
			<td>Basic buffer for living tissues.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylalanine</td>
			<td>RYON</td>
			<td>RT3486L005</td>
			<td>Used to prepare MSgg media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Beijing Labgic Technology Co.,Ltd.</td>
			<td>BS-1000-T</td>
			<td>Used for strain inoculation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMD19T Plasmid</td>
			<td>Takara Biomedical Technology (Beijing) Co.,Ltd.</td>
			<td>D102A</td>
			<td>Used to generate qPCR standard curves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pot</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.</td>
			<td>YHHWS2401</td>
			<td>Used for cucumber soil culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer for qPCR</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used for DNA amplification in qPCR.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-Time PCR Instrument</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (China) Co.,Ltd.</td>
			<td>4484073</td>
			<td>Used to perform qPCR on selected pellicle biofilm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roary</td>
			<td>The Wellcome Trust SangerInstitute</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to design primers of qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Shanghai Zhichu Instrument Co.,Ltd</td>
			<td>ZQTY-50S</td>
			<td>Used for solution mixing and microbial cultivation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silwet L-77</td>
			<td>Cytiva Bio-technology(Hangzhou) Co., Ltd.</td>
			<td>SL77080596</td>
			<td>Used to prepare TSB media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soy peptone</td>
			<td>Qingdao Hi-tech Industrial Park Hope Bio-technology Co., Ltd</td>
			<td>HB8275</td>
			<td>Used to prepare TSB media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Shanghai Yidian Analysis Instrument Co.,Ltd.</td>
			<td>76713100010</td>
			<td>Used for pellicle biofilm cristal violet quantifivation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Water</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.</td>
			<td>SW150302</td>
			<td>Used to wash the pellicle biofilm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized Nitrile Gloves</td>
			<td>Beijing Labgic Technology Co.,Ltd.</td>
			<td>223016852LLZA</td>
			<td>Used for basic experimental operations.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Template DNA</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used for DNA amplification in qPCR.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>Bioolook Scientific Research Special</td>
			<td>2180020</td>
			<td>Used to prepare MSgg media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>LP0042B</td>
			<td>Used to prepare TSB media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptophan</td>
			<td>Bioolook Scientific Research Special</td>
			<td>2190020</td>
			<td>Used to prepare MSgg media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSB Medium</td>
			<td>Guangdong Huankai Microbial Sci. &#38; Tech. Co.,Ltd.</td>
			<td>024048</td>
			<td>Broad-spectrum bacterial medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSB-Msgg Meidium</td>
			<td>Nanjing Agricultural University</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Mixed medium for pellicle biofilm culture with wider applicability.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>Nanjing Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>C0310520123</td>
			<td>Used to prepare MSgg media.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an approach to constructing multispecies biofilm communities from rhizosphere soil

Çok türlü biyofilm, rizosfer toprağı da dahil olmak üzere doğada doğal olarak oluşan ve baskın bir bakteri yaşam tarzıdır, ancak mevcut anlayışı sınırlıdır. Burada, sinerjik çok türlü biyofilm topluluklarını hızlı bir şekilde oluşturmak için bir yaklaşım sunuyoruz. İlk adım, diferansiyel santrifüjleme yöntemini kullanarak hücreleri rizosfer toprağından çıkarmaktır. Daha sonra, bu toprak hücreleri, pelikül biyofilmi oluşturmak için kültür ortamına aşılanır. 36 saatlik inkübasyondan sonra, biyofilmin bakteri bileşimi ve altındaki çözelti, 16S rRNA gen amplikon dizileme yöntemi kullanılarak belirlenir. Bu arada, pelikül biyofilminden yüksek verimli bakteri izolasyonu, sınırlayıcı seyreltme yöntemi kullanılarak gerçekleştirilir. Daha sonra, çok türlü biyofilm topluluklarının oluşturulmasında daha fazla kullanım için 16S rRNA gen amplikon dizileme verilerinde (pelikül biyofilm örnekleri) en yüksek bolluğa sahip ilk 5 bakteri taksonu seçilir. 5 bakteri taksonunun tüm kombinasyonları, kristal viyole boyama testi ile en güçlü biyofilm oluşturma yeteneği için seçilen ve qPCR ile ölçülen 24 oyuklu bir plaka kullanılarak hızlı bir şekilde oluşturuldu. Son olarak, en sağlam sentetik bakteri çok türlü biyofilm toplulukları yukarıdaki yöntemlerle elde edildi. Bu metodoloji, rizosfer çok tür biyofilmi hakkında araştırma yapmak ve bu türler arasındaki etkileşimleri yöneten ilkeleri incelemek için temsili toplulukları belirlemek için bilgilendirici rehberlik sağlar.

Biofilms represent intricate microbial communities either affixed to surfaces or linked with interfaces. There is broad acknowledgment that the majority of bacteria encountered in various environments, such as natural habitats, clinical settings, and industrial contexts, endure within biofilm communities1. In soil, the rhizosphere&#8212;encompassing the root surface and its adjacent 2 mm thick region&#8212;forms an ecological niche with heightened nutrient availability. Specific bacteria have evolved strategies to exploit this niche, fostering microbial proliferation and fostering the formation of biofilm communities in the rhizosphere2.
Rhizosphere microbes are considered the &#39;second genome&#39; of plants3. Plant growth-promoting microorganisms (PGPM) engage in mutualistic symbiosis with plants, providing significant growth promotion and biocontrol functions4. On the one hand, PGPM can supply nutrients to plant roots, enhance nutrient uptake, defend against pathogens, and degrade pollutants in the rhizosphere soil5. On the other hand, PGPM utilizes plant root exudates as a nutrient source for growth and evolution, thereby influencing the rhizosphere soil and root system through their own metabolism. It is worth noting that the prerequisite for all these functions is the effective colonization of PGPM in the plant rhizosphere, forming stable biofilms6.
Rhizosphere biofilm affects the assembly process of rhizosphere microbes, and the temporal and spatial characteristics of rhizosphere microbe assembly are closely related to the interaction of multispecies biofilm7. It serves as the hub of plant-microbiome interactions, providing a stable and controllable niche for them&#160;to interact effectively. Therefore, studying rhizosphere biofilm is also an important direction to gain insight into the interaction between plants and microbes.
However, there is currently little research on rhizosphere multispecies biofilms. The high complexity of microbiome composition makes it challenging to answer fundamental ecological questions surrounding natural microbial communities8. In the process of experiments, many conditions, such as soil type, plant type, and the large number of microbial communities, need to be considered. Various factors limit the research of rhizosphere multispecies biofilms.
To further investigate multispecies biofilm communities from rhizosphere soil, such as interspecies synergistic interactions or metabolite cross-feeding8, it is desirable to artificially construct a simplified, representative, stable, and tractable synthetic microbial community under laboratory conditions9,10. Here, a standardized protocol combines several of the latest microbiological and bioinformatic techniques.

Yazar Gündemi: İkinci Nesil Biyogübreler Üretmek için Sentetik Mikrobiyal Topluluklar Geliştirmek

Rizosfer Toprağından Çok Türlü Biyofilm Toplulukları Oluşturmaya Yönelik Bir Yaklaşım

In our research, we focus on rhizosphere bacteria and biofertilizers, and we aim to develop a synthetic bacterial communities that will be used as second-generation biofertilizers. The focus of our research on rhizosphere bacteria has shift from single-strain to community-level. However, there is no standard methods for building synthetic bacterial communities.Currently, there is still uncertainty regarding the compatibility and colonization ability of synthetic bacterial communities predicted by microbiome analysis. Thus, it is also a major bottleneck in the development of second-generation biofertilizers. Compared to large sequencing data of conventional methods, our culture first, identify later approach greatly reduces the amount of work involved in 60S rRNA gene sequencing.It is cost-effective to create synthetic bacterial communities that colonize roots quickly and efficiently. Our future research will focus on biological function of bacterial communities based on multispecies biofilms, and we will pay particular attention to promoting plant growth, improve plant stress resistance, and protecting plant health.

Söz konusu prosedürü takiben, salatalık rizosfer toprak mikrobiyotasından biyofilm oluşturma kapasitesinde önemli gradyanlar gözlenir (Şekil 1). Biyofilm amplikon dizilimi, peliküldeki türü doğruladı (Şekil 2). Sıralama verilerinin ısı haritalamasına dayanarak, peliküldeki bolluğu kalan çözeltidekinden daha büyük olan ilk beş bakteri türü seçildi (Şekil 3). Burada, tipik bir sentetik topluluk grubu örn...

Çeşitli rizosfer topraklarından sinerjik çok türlü biyofilm toplulukları oluşturmak için hızlı ve standartlaştırılmış bir prosedür burada sunulmaktadır. Karmaşık rizosfer toprak mikrobiyotasını araştırmak ve simüle etmek için tasarlanmış benzersiz bir protokoldür.

The multispecies biofilm is a naturally occurring and dominant lifestyle of bacteria in nature, including in rhizosphere soil, although the current ...

an-approach-to-constructing-multispecies-biofilm-communities-from

Research

JoVE Journal

Biology

An Approach to Constructing Multispecies Biofilm Communities from Rhizosphere Soil

474 Görüntüleme.  Nanjing Agricultural University. Araştırmamızda rizosfer bakterileri ve biyogübreler üzerine odaklanıyoruz ve ikinci nesil biyogübre olarak kullanılacak sentetik bir bakteri topluluğu geliştirmeyi amaçlıyoruz. Rizosfer bakterileri üzerindeki araştırmamızın odak noktası, tek suştan topluluk düzeyine kaymıştır. Bununla birlikte, sentetik bakteri toplulukları oluşturmak için standart bir yöntem yoktur.Şu anda, mikrobiyom analizi ile tahmin edilen sentetik bakt...