Biz bu çalışma ile teknik yardım için Ürdün Davis, Yanyan Lin, Eric SCHADLER ve Jimiao Zheng teşekkür ederim. Bu çalışma ALA MCB-1054962 hibe NSF KARİYER tarafından desteklenen

1.. Büyük Elma Suyu-agar Plakaları hazırlanması <ol><li> 4 plakaları yapmak için, 1000 ml&#39;lik bir şişeye 375 ml 2 H, O, 11.25 g uçucu agar ve bir karıştırma çubuğu ilave edin. Bu gevşek sıvı mallar için tek bir 30 dakika sterilizasyon döngüsünde şapkalı şişe kapağı Mix A. otoklav Mix A. </li><li> 500 ml&#39;lik bir behere 125 ml elma suyu, 12.5 g sofra şekeri ve bir karıştırma çubuğu ilave edin. Karışım A ve otoklavlama işlemi bitene kadar yaklaşık 70 ° C&#39;de karıştırıldıktan ve sıcaklığı muhafaza ederken bu ısıtılmış bir platformda Mix B. ısı Mix B. </li><li> Mix tamamlanmasından sonra bir otoklav, A. yavaşça kombine karışımı karıştırma devam Mix Mix B transferi ve bunun 15 dakika boyunca soğumaya bırakın. Aşırı soğutma ve bir koruyucu eklenmeden önce neden agar katılaşma kaçının. </li><li> , Etanol içinde% 10 (ağırlık / hacim) metil 4-hidroksibenzoat, bir çözüm olun. Bu, koruyucu olarak hareket edecektir. Yukarıda elma suyu-agar karışımına solüsyonun 3.75 ml ilave edilir. Anothe karıştırıldıktan Ol5 dakika r. </li><li> Her 300 cm 2 plastik veya köpük tabak içine koruyucu ile 125 ml elma suyu agar karışımı dökün. Bu sırada oda sıcaklığma soğumaya ve katılaşmaya olsun. Dökme sırasında, hava kabarcıkları oluşturan kaçının. Not: elma suyu agar plakaları hemen kullanıma hazırdır. Net sarar ile kullanılmayan tabak örtün ve bir hafta kadar 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol> 2.. Drosophila Embriyo Toplama ve Ön çapraz bağlama tedavisi <ol><li> Embriyolar elde edilecek olan yaklaşık 40.000 ila 50.000 sinekler ile nüfus kafes yerleştirin. </li><li> Her iki levha 12 orta standart mısır unu-melas 125 ml içeren yapın ve her plaka üzerinde kurutuldu, fırıncı mayası içinde yaklaşık 4 gr serpin. Sinekleri şişmanlatıyor 48 saat boyunca 25 ° C inkübatör nüfus kafesin içine bu tabak yerleştirin. </li><li> 25 ° C sıcaklığa kadar ıstınız 2 elma suyu-agar plakaları Her biri üzerinde kurutuldu, fırıncı mayası içinde yaklaşık 1 gr serpinplakası. 0-1 hr-eski embriyoların toplamaya başlamak için nüfus kafes içinde 2 tabak yerleştirin. </li><li> 1 saat koleksiyonu sonunda plakalarını çıkartın. Koleksiyonun bir tur gerekirse 2 yeni plakalar ile değiştirin. </li><li> Plakaları kapak ve ince bir fırça ile hafifçe embriyolar tekrar süspansiyon yeterince su ekleyin. Paslanmaz çelik tel örgü yapılmış iki tabakalı bir elekten tekrar süspansiyon haline embriyolar dökün. Not: Üst tabaka embriyo ile icar ederken büyük bir böcek parçalarını toplayan orta gözenek boyutu (850 mikron) örgü yapılır. Alt tabaka maya ve su geçişine için verirken, embriyolar toplar ince örgü (75 mikron) yapılmıştır. </li><li> 50 ml&#39;lik bir tüp ve ince naylon örgü ile yapılan bir toplama sepeti içine toplanan embriyolar transfer ince boya fırça kullanın. Su ile kısaca embriyoların durulayın sonra kuruması için kağıt havlu üzerine örgü kurulayın. </li><li> 3 dakika boyunca hafif bir döndürme ile% 50 çamaşır suyu embriyolar bırakın. Tam durulayınly su ile kalan çamaşır suyu çıkarmak için. Kurulamak için kağıt havlu üzerinde örgü kurulayın. </li><li> (Bu, daha uzun bir süre 30 saniye sürmemelidir) 15 saniye boyunca hafifçe çalkalanarak izopropanol veya çok embriyo kümeleri arıza kadar dechorionated embriyolar bırakın. Iyice kurulamak için kağıt havlu üzerinde örgü kurulayın. </li><li> Yeniden asılmış onları tutmak için embriyolar üzerinde heptan akışı için bir pipet kullanırken 5 dakika boyunca heptanda embriyolar daldırın. Kurulamak için kağıt havlu üzerinde örgü kurulayın. </li><li> 3 dakika boyunca% 0.1 Triton X-100 (PBST) içeren fosfat tamponlu salin, pH 7.4 (PBS) akışı ile embriyolar durulayın. </li><li> Toplama sepeti sökün ve 10 ml PBST ihtiva eden bir 15 ml tüp örgü ile birlikte embriyolar aktarılır. Örgü kapalı embriyoların yıkamak için tüp hafifçe çevirin. </li><li> Tüpten kafes çıkarın. Dikey konumda tüp koyun ve embriyolar yerçekimiyle tüpün dibine çöker sağlar. Not: Yaklaşık 100-300embriyoların ul bir kafesten bir 1 saat toplama beklenmektedir. </li><li> PBST çıkarın ve hemen çapraz bağlama gerçekleştirmeye devam. </li></ol> Toplanan Embriyolar 3.. In vivo Çapraz <ol><li> Kullanımdan hemen önce, PBST içinde% 0.2 &#39;lik formaldehit hazırlayın. Embriyoların için formaldehit sabitleyici 10 ml eklenir ve 10 dakika için bir döner sallayıcı üzerinde hafif bir çalkalama ile 25 ° C&#39;de inkübe edin. Günün sonunda kullanılmayan fiksatif atın. </li><li> Çapraz bağlama reaksiyonu söndürün <ol><li> Çapraz bağlama sonunda, embriyolar tüpün dibine çöker sağlar. </li><li> Formaldehit çözeltisi çıkarın. Hemen çapraz bağlama, reaksiyonun sönmesi için PBST içinde 0.25 M glisin 10 ml ekleyin. 5 dakika için bir döner sallayıcı üzerinde hafif bir çalkalama ile 25 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Embriyoların tüpün dibine çöker olsun. Söndürme çözeltisi çıkarın. PBST&#39;de 10 ml üç kez ile embriyolar yıkayın. </li><li> Tamamen P çıkarınBir pipet kullanarak TSİ yıkama solüsyonu. -80 ° C&#39;de kullanıma kadar saklayın embriyolar. </li></ol></li></ol> 4.. Protein Numune Hazırlama ve immüno-çökeltme <ol><li> 2 ml lisiz tampon maddesi içinde bir Dounce homojenleştirici kullanılarak 500 ul çapraz bağlanmış homojen embriyolar (0.5 M üre,% 0.01 SDS,% 2 Triton X-100, PBS içinde 2 mM fenilmetansülfonil florit [PMSF] ve proteaz inhibitörü kokteyli). Not: Aksi belirtilmediği sürece oda sıcaklığında bu ve aşağıdaki adımları uygulayın. </li><li> 1.5 ml santrifüj tüplerine lizat aktarın ve yavaşça ayrıntılı lizizi sağlamak için 15 dakika için bir döner platform üzerinde sallayın. Hücre yıkıntıları pelet haline getirildi, 5 dakika boyunca 16,000 x g&#39;de lizat santrifüj. Temiz bir 15 ml tüp içinde süpernatant kaydedin. </li><li> Anti-HA agaroz boncuklar süpernatana çamur 40 ul ilave edin ve 2.5 saat süreyle dönüşlü bir platform üzerinde inkübe edilir. </li><li> 5 dakika boyunca 2500 x g&#39;de santrifüjleme ile boncuk Pelet. Süpernatantı ama beğenme bırakıntüp içinde ximately 250 ul. Geri kalan süpernatan içinde yeniden süspanse edin ve boncuklar 10 mikron gözenek filtresi ile bir 1.5 ml döndürme kolonuna transfer. </li><li> 10 saniye boyunca 12,000 x g&#39;de santrifüj spin kolon ve akış atmak. </li><li> 200 ul yıkama tamponu (0.1 M glisin, 1 M NaCl, 1% IGEPAL CA-630,% 0.1 Tween-20, PBS) eklenerek ve boncukları yıkayın. 10 saniye boyunca 12,000 x g&#39;de santrifüj ve sütun yıkama atın. Yıkandıkları iki kez daha tekrarlayın. </li><li> Boncuklara 40 ul yıkama tamponu (2 mg / ml PBS içinde HA-peptid) eklenir ve yavaşça çalkalanarak her 5 dakika ile 15 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. 10 saniye boyunca 12,000 x g&#39;de santrifüj ve sütun elüat toplamak. </li><li> Anti-HA antikoru kullanılarak western 13-blot analizi ile kompleks bir elüsyon kontrol edin. </li></ol>

<ol>
	<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia.">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome research. 22, 1813-1831 (2012).</li><li>Murigneux, V., Sauliere, J., Roest Crollius, H., Le Hir, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+identification+of+RNA+binding+sites+by+CLIP-seq.">Transcriptome-wide identification of RNA binding sites by CLIP-seq.</a> Methods. , (2013).</li><li>Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+formaldehyde+cross-linking+and+mass+spectrometry+in+the+study+of+protein-protein+interactions.">Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions.</a> Journal of mass spectrometry : JMS. 43, 699-715 (2008).</li><li>Creed, T. M., Loganathan, S. N., Varonin, D., Jackson, C. A., Arkov, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+role+of+specific+Tudor+domains+in+Tudor-Aubergine+protein+complex+assembly+and+distribution+during+Drosophila+oogenesis.">Novel role of specific Tudor domains in Tudor-Aubergine protein complex assembly and distribution during Drosophila oogenesis.</a> Biochemical and biophysical research communications. 402, 384-389 (2010).</li><li>Arkov, A. L., Wang, J. Y., Ramos, A., Lehmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Tudor+domains+in+germline+development+and+polar+granule+architecture.">The role of Tudor domains in germline development and polar granule architecture.</a> Development. 133, 4053-4062 (2006).</li><li>Boswell, R. E., Ptudor Mahowald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+gene+required+for+assembly+of+the+germ+plasm+in+Drosophila+melanogaster.">a gene required for assembly of the germ plasm in Drosophila melanogaster.</a> Cell. 43, 97-104 (1985).</li><li>Thomson, T., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+tudor+is+essential+for+polar+granule+assembly+and+pole+cell+specification,+but+not+for+posterior+patterning.">Drosophila tudor is essential for polar granule assembly and pole cell specification, but not for posterior patterning.</a> Genesis. 40, 164-170 (2004).</li><li>Arkov, A. L., Ramos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+RNA-protein+granules:+insight+from+the+germline.">Building RNA-protein granules: insight from the germline.</a> Trends in cell biology. 20, 482-490 (2010).</li><li>Gao, M., Arkov, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+organelles:+Structure+and+role+of+germ+granules+in+the+germline.">Next generation organelles: Structure and role of germ granules in the germline.</a> Molecular reproduction and development. , (2012).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+methylarginine-dependent+recognition+of+Aubergine+by+Tudor.">Structural basis for methylarginine-dependent recognition of Aubergine by Tudor.</a> Genes &amp; development. 24, 1876-1881 (2010).</li><li>Liu, N., Han, H., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasa+promotes+Drosophila+germline+stem+cell+differentiation+by+activating+mei-P26+translation+by+directly+interacting+with+a+(U)-rich+motif+in+its+3.">Vasa promotes Drosophila germline stem cell differentiation by activating mei-P26 translation by directly interacting with a (U)-rich motif in its 3.</a> UTR. Genes &amp; development. 23, 2742-2752 (2009).</li><li>Matthews, K. A., Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster:+Practical+Uses+in+Cell+and+Molecular+Biology.">Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology.</a> Methods in Cell Biology. 44, 13-32 (1995).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: A laboratory manual. , (2001).</li><li>Thomson, T., Liu, N., Arkov, A., Lehmann, R., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+new+polar+granule+components+in+Drosophila+reveals+P+body+and+ER+associated+proteins.">Isolation of new polar granule components in Drosophila reveals P body and ER associated proteins.</a> Mechanisms of development. 125, 865-873 (2008).</li><li>Vasilescu, J., Guo, X., Kast, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+protein-protein+interactions+using+in+vivo+cross-linking+and+mass+spectrometry.">Identification of protein-protein interactions using in vivo cross-linking and mass spectrometry.</a> Proteomics. 4, 3845-3854 (2004).</li><li>Klockenbusch, C., Kast, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+formaldehyde+cross-linking+for+protein+interaction+analysis+of+non-tagged+integrin+beta1.">Optimization of formaldehyde cross-linking for protein interaction analysis of non-tagged integrin beta1.</a> J Biomed Biotechnol. 2010, 9275-9285 (2010).</li><li>Nowak, D. E., Tian, B., Brasier, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+cross-linking+method+for+identification+of+NF-kappaB+gene+network+by+chromatin+immunoprecipitation.">Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 39, 715-725 (2005).</li><li>Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dual+cross-linking+for+identification+of+indirect+DNA-associated+proteins+by+chromatin+immunoprecipitation.">In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 41, 694 (2006).</li><li>Liu, N., Dansereau, D. A., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fat+facets+interacts+with+vasa+in+the+Drosophila+pole+plasm+and+protects+it+from+degradation.">Fat facets interacts with vasa in the Drosophila pole plasm and protects it from degradation.</a> Current biology : CB. 13, 1905-1909 (2003).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Formaldehit genellikle protein-protein, protein-nükleik asit etkileşimleri belirlemek için bir çapraz bağlama maddesi olarak kullanılmaktadır. Birlikte aşağı kütle spektrometresi prosedürleri ile uyumluluğu ile iyi çözünürlük ve hücre zarı geçirgenliği, hücre içi çapraz uygulamalar 3,15-17 için formaldehit ideal bir aday ajan olun. Özel olarak, başarılı bir şekilde Vasa, Drosophila 11 önemli bir germ hücre RNA helikaz ile ilişkili mRNA tespit etmek için kullanıldı. Yakın varlarsa molekülleri hedef proteinin etkileşim ortaklarının özgünlüğünü güçlendirilmesi, uygun şartlar altında çapraz bağlı olacağını ima ticari olarak temin edilebilen çapraz bağlayıcı arasında - (2,7, 2,3), ek olarak, formaldehit kısa aralayıcı kollar birine sahiptir . Yukarıda belirtilen nedenlerden dolayı, formaldehit protokolde çapraz bağlama maddesi olarak seçilmiştir. Bununla birlikte, bu u dahil edilmemelidirDrosophila embriyolar için in vivo uygulama için diğer çapraz bağlama maddelerinin sefulness. Ancak, belirgin bir Tud ditiyobis (süksinimidil propionat) (DSP), sık sık çalışmamızda formaldehit yerine yongalı deneylerde 17,18 formaldehid ile kombinasyon halinde kullanılan bir N-hidroksisüksinimid (NHS) ester etti çapraz bağlayıcı kullanmak çalıştı, fakat var Karmaşık Diğer yandan, bu çapraz bağlayıcı ile elde edilmiştir, DSP harf ile ayrı ayrı tespit edilmesi gereken diğer protein kompleksleri için etkili olabilir. Embriyo ekstreler yapıldıktan sonra in vivo çapraz bağlama yaklaşımının yanısıra, bismaleimidoheksan (BMH) ailesinin ikinci çapraz bağlayıcı Drosophila in vitro embriyo 14,19 protein-protein etkileşimleri yakalama etkili olduğu gösterilmiştir, ancak, bu deneylerde çapraz bağlama meydana geldi. Çapraz bağlama zaman, sıcaklık ve formaldehit konsantrasyon üç büyük li olançapraz bağlama verimliliğini etkileyen ları. Bizim protokol her bir faktör pilot deneyleri, çapraz bağlanmış kompleksinin özgüllük ve riski arasında dengesini korurken, bu nedenle, bu Tud protein çapraz bağlanma ve in vivo Drosophila embriyolar kendi etkileşim ortakları için optimize edilmiştir kullanılarak test edilmiştir spesifik olmayan çapraz bağlama molekülleri. Spesifik olmayan bağlanma, çapraz bağlama komplekse yanlış pozitif varlığına yol açar ve dikkatli bir şekilde deneylerinde kullanılmıştır, örneğin GFP için, ilgisiz bir protein kumanda ile kontrol edilmelidir. Buna ek olarak, uygun çapraz bağlama koşullarının farklı hedef molekülleri ile değişebilir. Bu nedenle, bir başlangıç ​​noktası, uygun çapraz bağlama süresi, sıcaklık ve formaldehit konsantrasyonu olarak protokol kullanılarak ilgi konusu bir protein kompleksi için tespit edilmesi gerekecektir. Uygun çapraz bağlama koşulları altında gerçekleştirilmektedir kez fo için kritiktam embriyolar spesifik olmayan çapraz bağlanmayı en aza indirmek için çapraz bağlanmış her bir zaman onları llow. Diğer önemli bir adım, embriyonik ekstrelerinden boncuklara olmayan proteinlerin spesifik olmayan bağlanmayı azaltmak için yüksek bir NaCl konsantrasyonu (1 M) ve iki deterjanlar (IGEPAL CA-630 ve Tween-20) ile IP sonra boncuklarını edilir. Bizim protokol hedef proteinin ve IP sırasında protein kompleksi aşağı çekmek için kullanılan antikor arasında yüksek bir afinite bağlıdır. Bu nedenle, hedef proteinde antikorun epitop çapraz bağlama ile imha edilmesi gerekir ve IP sırasında antikor için erişilebilir olmalıdır. Buna ek olarak, antikor, hedef protein etkileşimi Spesifik olmayan alt yapı proteinlerinin azaltılmasına yönelik sıkı yıkama dayanıklı olmalıdır. Başarılı bir IP Bu şartlar belirli bir antikor-epitop kombinasyon halinde kullanan bir tane engelleyebilecek, ancak ilgi konusu bir proteini, uygun bir antikor-epitop çift bulmak mümkün olmalıdır. Özellikle, HA-epitop etiket ve karşılık gelen antikor başarıyla bu protokol kullanılmıştır. Açıklanan protokol, farklı gelişim safhalarında yerli protein komplekslerinin izolasyonu için ve farklı doku kullanılabilir. Drosophila için bu yöntemi gösteren, ancak, protokol diğer canlılar için uyarlanabilir.

Multisubunit protein montajlar ve DNA-ya da RNA-protein komplekslerinin izolasyonu protein kompleksleri, DNA-bağlanma düzenleyici proteinler veya RNA bağlama proteinlerinin RNA hedefleri tarafından kabul genomik lokusları tespit için gerçekleştirilir. Farklı yöntemler, belirli bir RNA-bağlama proteini (CLIP-seq) 2 ile ilişkili transkripsiyon faktörleri veya kromatin proteinleri (ChIP-seq) 1 ve RNA hedefleri tarafından tanınan DNA siteleri genom tanımlanmasını sağlar. RNA türetilmiş cDNA ya da DNA hedeflerinin diziler daha sonra derin dizilir. Bu yöntemler, kimyasal veya UV kaynaklı çalışılan kompleksinin bir protein bileşenine karşı bir antikor ile immüno-çökeltme (IP) takip kompleksleri stabilize etmek için çapraz bağlama kullanın. Bir organizmanın gelişimi sırasında, çok sayıda geçici protein kompleksleri oluşturur. Bu nedenle, kontrol dev moleküler mekanizmaların anlaşılması, in vivo olarak, bu komplekslerin bileşimi ve işlevini analiz için çok önemlidirelopment. Bu etkileşim bileşenleri ve in vitro olarak hücre biyokimyasal ortamı yerel konsantrasyonları üretmek için neredeyse imkansız olduğu için bu tür bir in vivo analiz in vitro yaklaşımına göre daha üstün olacaktır. Burada biz başarılı Drosophila embriyolar büyük protein kompleksleri izole etmek için kullanabileceğiniz bir in vivo yaklaşım göstermektedir. Bu yöntemde, canlı embriyolar protein kompleksleri düşük formaldehit konsantrasyonu ve daha sonra ilgi protein kompleksleri için kompleksleri ve kütle spektrometre analizi jel geçirilmiş, ardından arıtma komplekslerinin bilinen bir bileşenine karşı bir antikor ile IP ile izole edilir ile çapraz bağlanmış olan bilinmeyen karmaşık bileşenleri tanımlar. Formaldehit hücre zarı nüfuz edebilir ve 2.3-2.7 Â 3 bir dizi çapraz bağlama sahip olduğu için, protein kompleksleri, in vivo olarak çapraz bağlanabilir ve karmaşık parçaları birbirine yakın olması muhtemeldir. Bu makalede bizBir örnek olarak Tudor (Tud) protein kompleksinin izole edilmesini kullanarak bu yöntem açıklanmaktadır. Tud tohum çizgisi 4-7 gelişimi için gerekli olan bir tohum çizgisi proteindir. Bu protein için diğer polipeptidlerin 8-10 metillenmiş arginines veya lisin ile etkileşim için bilinen 11 Tud alanları içerir. Daha önce, fonksiyonel Tud 5 HA-etiketli ifade eder ve bu nedenle, spesifik bir anti-HA antikoru çapraz bağlamadan sonra Tud kompleksi aşağı çekmek için kullanılan bir transgenik Drosophila satır elde ettik. Protein-protein çapraz bağlar ek olarak, nükleik asit, formaldehit-protein çapraz bağlar oluşturabilir ve yonga-seq deneylerde kullanılır. Ayrıca, Drosophila, formaldehid ile çapraz bağlama, in vivo Vasa RNA helikaz protein 11 bir RNA hedefinin belirlenmesini sağladı. Bu yazıda in vivo çapraz bağlama ve pur için bir yöntem tarif ederkenDrosophila embriyolardan protein kompleksleri ification, bu yöntem diğer organizmalar ve dokular için uyarlanabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="858">
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Drosophila agar</td>
			<td style="width:235px;">Lab Scientific (http://www.labscientific.com/)</td>
			<td style="width:119px;">FLY-8020-1</td>
			<td style="width:289px;">Do not autoclave the water and agar mix for prolonged period of time as it will cause the apple juice plates to become fragile</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Methyl 4-hydroxybenzoate</td>
			<td style="width:235px;">Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)</td>
			<td style="width:119px;">H5501</td>
			<td style="width:289px;">Other name: TEGOSEPT</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Population cage</td>
			<td style="width:235px;">Flystuff (http://www.flystuff.com/)</td>
			<td style="width:119px;">59-104</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Fine nylon mesh</td>
			<td style="width:235px;">Flystuff (http://www.flystuff.com/)</td>
			<td style="width:119px;">57-102</td>
			<td style="width:289px;">When making the collection basket, cut the mesh slightly larger than the opening of the falcon tube cap to ensure a tight seal</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dounce homogenizer</td>
			<td style="width:235px;">Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)</td>
			<td style="width:119px;">D8938-1SET</td>
			<td style="width:289px;">Chill the homogenizer on ice and prerinse with cold lysis buffer before use to prevent protein degradation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Protease inhibitor cocktail&#160;</td>
			<td style="width:235px;">Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa)</td>
			<td style="width:119px;">4693132001</td>
			<td style="width:289px;">PBS could be used to prepare concentrated protease inhibitor stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-HA agarose beads</td>
			<td style="width:235px;">MBL international (http://www.mblintl.com/)</td>
			<td style="width:119px;">561-8</td>
			<td style="width:289px;">The kit also includes HA-peptide and spin columns</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HA-peptide</td>
			<td style="width:235px;">MBL international (http://www.mblintl.com/)</td>
			<td style="width:119px;">561-8</td>
			<td style="width:289px;">Prepare to 2 mg/ml with PBS&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Spin Column</td>
			<td style="width:235px;">MBL international (http://www.mblintl.com/)</td>
			<td style="width:119px;">561-8</td>
			<td style="width:289px;">Spin columns are included as part of the kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:235px;">Fisher Scientific (www.fishersci.com/&#8206;)</td>
			<td style="width:119px;">BP26324</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:235px;">Fisher Scientific (www.fishersci.com/&#8206;)</td>
			<td style="width:119px;">BP151-500</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Heptane</td>
			<td style="width:235px;">Fisher Scientific (www.fishersci.com/&#8206;)</td>
			<td style="width:119px;">H350-4</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:235px;">Invitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html)</td>
			<td style="width:119px;">AM9625</td>
			<td style="width:289px;">Dilute from 10 X to 1 X with nanopure water before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:235px;">Fisher Scientific (www.fishersci.com/&#8206;)</td>
			<td style="width:119px;">BP531-500</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycine</td>
			<td style="width:235px;">BioRad (www.bio-rad.com/&#8206;)</td>
			<td style="width:119px;">161-0724</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SDS</td>
			<td style="width:235px;">BioRad (www.bio-rad.com/&#8206;)</td>
			<td style="width:119px;">161-0301</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Urea</td>
			<td style="width:235px;">BioRad (www.bio-rad.com/&#8206;)</td>
			<td style="width:119px;">161-0730</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Phenylmethanesulfonyl fluoride</td>
			<td style="width:235px;">Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)</td>
			<td style="width:119px;">P7626-1G</td>
			<td style="width:289px;">Prepare 200 mM stock solution in isopropanol then dilute to working concentration of 2 mM in lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">IGEPAL CA-630</td>
			<td style="width:235px;">Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)</td>
			<td style="width:119px;">I8896-50ML</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tween 20</td>
			<td style="width:235px;">Fisher Scientific (www.fishersci.com/&#8206;)</td>
			<td style="width:119px;">BP337-100</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">15-ml tubes</td>
			<td style="width:235px;">USA Scientific (http://www.usascientific.com/)</td>
			<td style="width:119px;">1475-0511</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bleach</td>
			<td style="width:235px;">Clorox brand</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:289px;">Dilute with equal volume of nanopure water to make 50% bleach</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">50-ml tubes</td>
			<td style="width:235px;">BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp)</td>
			<td style="width:119px;">352098</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Top layer sieve</td>
			<td style="width:235px;">Fisher Scientific (www.fishersci.com/&#8206;)</td>
			<td style="width:119px;">04-884-1AK</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Bottom layer sieve</td>
			<td style="width:235px;">Fisher Scientific (www.fishersci.com/&#8206;)</td>
			<td style="width:119px;">04-884-1BA</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vivo crosslinking approach to isolate protein complexes from drosophila embryos

Pek çok hücresel süreçleri multisubunit protein kompleksleri tarafından kontrol edilir. Sıkça bu kompleksler geçici oluşturmak ve birleştirmek için doğal bir ortam gerektirir. Bu nedenle, bu işlevsel protein kompleksleri tespit etmek için, hücre lizizi ve daha sonra saflaştırma daha önce in vivo olarak bunları stabilize etmek için önemlidir. Burada Drosophila embriyolardan büyük niyetli protein komplekslerini izole etmek için kullanılan bir yöntem tarif eder. Bu yöntem, hücre zarını kolayca geçebilir formaldehit düşük bir konsantrasyonu kullanılarak in vivo çapraz bağlama ile embriyoların içine komplekslerin embriyo nüfuziyet ve stabilizasyon dayanmaktadır. Daha sonra, ilgilenilen protein kompleksi jel geçirilmiş, ardından arıtma ve kütle spektrometresi ile analiz edilir İmmüno. Bu tohum çizgisi gelişimi için gerekli olan bir Tudor protein kompleksi, saflaştırılmasını kullanarak bu yöntemi örneklemektedir. - Küçük Tudor birden Tudor etki alanı içeren büyük bir proteindirHedef proteinlerin metillenmiş arginines veya lisin ile etkileşim modülleri. Bu yöntem, farklı organizmalardan ve dokulardan yerli protein komplekslerinin izolasyonu için uyarlanabilir.

Western blot ve ardından (Şekil 1 &#39;de gösterilen)% 7 aşama jel (Şekil 2) -, çapraz bağlanma etkinliği ve çapraz bağlanmış Tud protein kompleksinin başarılı bir saflaştırma% 3 üzerinde SDS-PAGE ile analiz edildi. % 3 kullanmanın amacı, -% 7 adım jel kompleksinin geri kalan çapraz bağlanmamış Tud protein ve konsantrasyondan Tud çapraz bağlanmış protein kompleksinin etkili ayrılmasına dayanmaktadır. Yukarıda sözü edilen in vivo eden çapraz bağlama koşulları altında, Tud proteinin büyük bir kısmı hala çapraz bağlanmamış kalır olabilir. Bu serbest Tud protein SDS-PAGE ile ayırma kadar IP sırasında çapraz bağlanmış kompleksi ile copurify olacaktır. Açık tutma olmadan% 7 sınırına - boyutu büyük, Tud protein çapraz bağlanmamış olsa (285 kDa) 3% karşısında geçirir. Daha büyük bir moleküler ağırlığa sahip çapraz bağlanmış Tud protein kompleksi zorluk th sonuçlanan jel sınırdan geçiş gerekir isee kompleksi serbest Tud proteinden ayrılması, bu nedenle &quot;tuzak&quot; ve sınırına yakın sınır veya &quot;atık&quot; konsantre ve ediliyor. Uygun bir kontrol dahil, bu çapraz bağlama protokolü özgünlüğünü doğrulamak için çok önemlidir. Bu nedenle, çapraz bağlanma derecesini izlemek için HA-etiketli GFP proteini sentezleyen 14 embriyoları kullanılır. Sonuç (% 0.1 -% 0.5) ve HA-GFP etiketli ve kısmını ifade embriyo - (% 2% 0,1) Farklı formaldehit konsantrasyonları pilot deneyleri gerçekleştirdik (Şekil 3) burada gösterilmektedir. Bizim çapraz bağlama protokolü rasgele çevreleyen molekülüne çapraz bağlanma hedef proteini etmediğini doğrulanmış olan, muameleye tabi tutulan embriyolarda GFP protein (en fazla% 0.5 formaldehit) salt çoğunluğu çapraz bağlanmamış kaldığı açıktır. Uncr ile karşılaştırıldığında, özellikle% 0.2 &#39;lik formaldehit muamele (Şekil 3, satır 5 ve 6) bir çapraz bağlanmış ürün göstermemiştirbundan başka, bu protokolde% 0.2 formaldehit bizim seçim haklı film, uzatılmış maruz kalma süresi rağmen osslinked kontrol (Şekil 3, hat 1 ve 2). Birlikte Tud kompleks numuneler IP aşağıdaki ile% 7 adım jel - Ancak, GFP kontrol embriyolar hep aynı koşullar ve kontrol GFP protein örneklerinin altında Tud karmaşık çapraz bağlama ile paralel olarak çapraz bağlanmış olmalıdır% 3 çalıştırılması gerekir. Buna ek olarak, karmaşık Tud ve karşılık gelen GFP kontrol her ikisi de% 3 -% 7 jel alanları eksize edilir ve Tud karmaşık bandı ve GFP kontrol hem de mevcut olacaktır yanlış pozitif adaylar belirlenmesi için kütle spektrometresi analizi için gönderilmiştir. In vivo çapraz bağlanma etkinliği, çapraz bağlanmamış ve kontrol sırasıyla çapraz bağlanmış embriyolar örnekleri (Şekil 2A) için serbest Tud protein ve Tud kompleksi karşılaştırılarak belirlendi. Neredeyse exclusivel çapraz bağlanmamış kontrol embriyoların ücretsiz Tud proteinSınır bölgesinde (Şekil 2A, şerit 1) yakın tutulan az miktarda% 7 sınırına - y% 3 arasında göç. % 7 jel sınır (Şekil 2A, kuşak 2) -, bu aksine, çapraz bağlanmış embriyolar% 3 en büyük moleküler ağırlıklı çapraz bağlı Tud kompleksinin varlığını göstermiştir. Bu açıkça bir çapraz bağlama işlemi başarılı bir şekilde in vivo etkileşim ortakları (Şekil 2A şerit karşılaştırma 1 ve 2) ile total Tud proteininin yaklaşık olarak% 50 çapraz bağlı olduğunu göstermiştir. HA-peptid ile rekabet elüsyon saflandırılmasında doğruladı ve saflaştırılmış Tud protein kompleksinin (Şekil 2B) özgünlüğünü güçlendirdi. % 7 sınır alanı ve aynı zamanda serbest Tud protein (Şekil 2B, şerit 1) - HA-peptid ile elüsyon fraksiyonu yaklaşık% 3 konsantre edildi kompleksi içeriyordu. Aşağıdakiler SDS örnek tamponu elüt Tud (boncuk ve Tud kompleksin az miktarda kalan çok serbest <s<html> trong&gt; Şekil 2B, şerit 2). <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51387/51387fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51387/51387fig1.jpg" /> .% 3, Şekil 1 Şema -. SDS-PAGE için kullanılan% 7 adım jel% 3 -% 7 basamaklı bir jel el ile üç katman içeren bir şekilde dökülmektedir. Alt tepesinden, bu tabakalar% 3 istifleme jeli,% 3 ayırma jel ve% 7 ayırma jeli bulunmaktadır. Bu yazıda kullanılan Mini-PROTEAN sistemi (Bio-Rad) ile çalışmak için,% 3 ayıran jel yüksekliği şemada gösterildiği gibi, yaklaşık 1 cm olarak yapılmıştır. Not: 3% istifleme jeli ve% 3 ayıran jel katmanlar jeli tutarken yüzden bu tabakaların bozulmasını önlemek için ekstra dikkatli kullanmak son derece kırılgandır. upload/51387/51387fig2highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51387/51387fig2.jpg &quot;/&gt; .. Şekil 2, çapraz bağlanmış embriyolar ve embriyo kontrol lizatları ve IP Panel A, şerit 1 ile Tudor protein kompleksinin saflaştırılması Western blot sonuçları, çapraz bağlanmamış kontrol embriyolarının ham protein lisatı; şerit 2, formaldehit çapraz bağlanmış embriyolardan ham protein lizat. Panel B, şerit 1, çapraz bağlanmış embriyo lizatından IP sonra HA-peptid ile elüsyon; şerit 2, ilk HA peptit elüsyondan sonra 2 x SDS numune tamponu ile elüsyon. SDS-PAGE 3.5 saat boyunca 200 V&#39;ta çalıştırılmıştır. Anti-HA antikoru (1:1000), Western lekeleme kullanılmıştır. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51387/51387fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51387/51387fig3.jpg" /> Şekil 3,. HA-etiketli GFP ifade eden çapraz bağlanmış kontrol embriyoları ve embriyo Western blot sonuçları. Şerit 1, ham protein lizat of çapraz bağlanmamış kontrol embriyolar; şerit 1, ancak iki katı miktarı olarak aynı şerit 2; şerit 3,% 0.1 &#39;lik formaldehit ile çapraz bağlanmış embriyo ham protein lisatı; şerit 3, ancak iki katı miktarı olarak aynı şerit 4,; şerit 5,% 0.2 &#39;lik formaldehit ile çapraz bağlanmış embriyo ham protein lisatı; yol 5, ancak iki katı ile aynı şerit 6; şerit 7,% 0.3 formaldehid ile çapraz bağlanmış embriyo ham protein lisatı; şerit 7 ancak iki katı miktarı olarak aynı şerit 8,. Şerit 9,% 0.5 &#39;lik formaldehit ile çapraz bağlanmış embriyoların ham lizat. % 15 gradient jel - SDS-PAGE içinde% 4, 45 dakika boyunca 200 V&#39;ta çalıştırılmıştır. Anti-HA antikoru (1:1000), Western lekeleme kullanılmıştır.

Watch this Scientific Journal Video about An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos at JoVE.com

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Çok bileşenli protein kompleksleri hücre fonksiyonu ve gelişme sırasında çok önemli bir rol oynamaktadır. Burada çapraz bağlayıcı in vivo daha sonra yapı-işlev analizi için çapraz bağlı kompleksler, ardından arıtma ardından Drosophila embriyolardan yerli protein komplekslerini izole etmek için kullanılan bir yöntem tarif eder.

Bir In vivo</emŞu Protein Kompleksler yalıtmak için> Çapraz yaklaşım Drosophila Embriyolar

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

an-vivo-crosslinking-approach-to-isolate-protein-complexes-from

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

16.6K Görüntüleme.  Murray State University.  Çok bileşenli protein kompleksleri hücre fonksiyonu ve gelişme sırasında çok önemli bir rol oynamaktadır. Burada çapraz bağlayıcı in vivo daha sonra yapı-işlev analizi için çapraz bağlı kompleksler, ardından arıtma ardından Drosophila embriyolardan yerli protein komplekslerini izole etmek için kullanılan bir yöntem tarif eder. 

Video: An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces

In this video, we will present our approach to measure cellular traction forces using a microfabricated array of posts.  Traction forces are generated through myosin-actin interactions and play an important role in our physiology.  During development, they enable cells to move from one location to the next in order to form the early structures of tissue.  Traction forces help in the healing processes.  They are necessary for the proper closure of wounds or the migration and crawling of leukocytes through our body.  These same forces can be detrimental to our health in the case of cancer metastasis or vascular growth towards a tumor.  The most common method by which to study cells in vitro has been to use a glass or polystyrene dish.  However, the rigidity of the substrates makes it impossible to physically measure cell traction forces, and there are relatively few methods to study traction forces.  Our lab has developed a technique to overcome these limitations.  The method is based on a vertical array of flexible cantilevers, the stiffness and size scale of which are such that individual cells spread across many cantilevers and deflect them in the process.  The pillars we use are 3 &mu;m in diameter, 10 &mu;m tall, and are configured in a regular array with 9 &mu;m center-to-center spacing.  But these physical dimensions can be readily varied to accommodate a variety of studies.  We start with a silicon master, but the final posts are made out of silicone rubber called poly (dimethyl siloxane), or PDMS.  We can measure the deflections under a microscope and calculate the magnitude and direction of traction forces required to produce the observed deflections.  We call these substrates microfabricated post-array-detectors, or mPADs.  Here, we will show you how we fabricate and use the mPADs to assess modulations of cellular contractility.

Microfabricated Post-Array-Detectors mPADs: an Approach to Isolate Mechanical Forces

In this video, we demonstrate how to fabricate and utilize microfabricated post array detectors (mPADs) to assess modulations of cellular contractility.

Microfabricated Post-Dizi-Dedektörleri (mPADs): Mekanik Kuvvetleri yalıtın bir Yaklaşım

In this video, we will present our approach to measure cellular traction forces using a microfabricated array of posts.  Traction forces are generated ...

Biyoloji

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

Tek Moleküler Kompleksleri görselleştirme In Vivo Gelişmiş Floresan Mikroskopi

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Elektron Mikroskobu için embriyo Hazırlık Drosophila Embriyonik kalp tüpü

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

Dayanıksız Multi-protein Kompleksleri izolasyonu In vivo Kontrollü Hücresel Çapraz Bağlama ve immuno-manyetik Afinite Kromatografisi

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

Yapısal Kütle Spektrometresi büyük protein kompleksleri Analiz

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Kinesin İzolasyonu ve Saflaştırılması gelen Drosophila Embriyolar

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle microtubules to prevent anaphase onset until the chromosomes are properly connected. Cells use this mechanism to prevent aneuploidy or genomic instability, and hence cancers and other human diseases like birth defects and Alzheimer's1. A number of the SAC components such as Mad1, Mad2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10, Rod and Aurora B kinase have been identified and they are all kinetochore dynamic proteins2. Evidence suggests that the kinetochore is where the SAC signal is initiated. The SAC prime regulatory target is Cdc20. Cdc20 is one of the essential APC/C (Anaphase Promoting Complex or Cyclosome) activators3 and is also a kinetochore dynamic protein4-6. When activated, the SAC inhibits the activity of the APC/C to prevent the destruction of two key substrates, cyclin B and securin, thereby preventing the metaphase to anaphase transition7,8. Exactly how the SAC signal is initiated and assembled on the kinetochores and relayed onto the APC/C to inhibit its function still remains elusive.
Drosophila is an extremely tractable experimental system; a much simpler and better-understood organism compared to the human but one that shares fundamental processes in common. It is, perhaps, one of the best organisms to use for bio-imaging studies in living cells, especially for visualization of the mitotic events in space and time, as the early embryo goes through 13 rapid nuclear division cycles synchronously (8-10 minutes for each cycle at 25 &deg;C) and gradually organizes the nuclei in a single monolayer just underneath the cortex9.
Here, I present a bio-imaging method using transgenic Drosophila expressing GFP (Green Fluorescent Protein) or its variant-targeted proteins of interest and a Leica TCS SP2 confocal laser scanning microscope system to study the SAC function in flies, by showing images of GFP fusion proteins of some of the SAC components, Cdc20 and Mad2, as the example.

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The kinetochore is where the SAC initiates its signal monitoring the mitotic segregation of the sister chromatids. A method is described to visualize the recruitment and turnover of one of the kinetochore proteins and its coordination with the chromosome motion in Drosophila embryos using a Leica laser scanning confocal system.

Living Görselleştirilmesi Dinamik Kinetochore Protein Davranış ve Kromozom Hareket tarafından Mitotik Checkpoint incelenmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Sinsityal Embriyolar

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given point in time. The protocol dubbed Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture this mRNA translation process in a cell-type-specific manner. Based on the affinity purification of polysomes carrying a tagged ribosomal subunit, TRAP can be applied to translatome analyses in individual cells, making it possible to compare cell types during the course of developmental processes or to track disease development progress and the impact of potential therapies at molecular level. Here we report an optimized version of the TRAP protocol, called TRAP-rc (rare cells), dedicated to identifying engaged-in-translation RNAs from rare cell populations. TRAP-rc was validated using the Gal4/UAS targeting system in a restricted population of muscle cells in Drosophila embryos. This novel protocol allows the recovery of cell-type-specific RNA in sufficient quantities for global gene expression analytics such as microarrays or RNA-seq. The robustness of the protocol and the large collections of Gal4 drivers make TRAP-rc a highly versatile approach with potential applications in cell-specific genome-wide studies.

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos.

Nadir hücre popülasyonlarının gelen TUZAK-rc, Tercüme Ribozom Affinity Arıtma<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to dose-limiting toxicity and many adverse side effects. Targeting the genome with sequence-specific small molecules may enable molecules with increased therapeutic index and fewer off-target effects. N-methylpyrrole/N-methylimidazole polyamides are molecules that can be rationally designed to target specific DNA sequences with exquisite precision. And unlike most natural transcription factors, polyamides can bind to methylated and chromatinized DNA without a loss in affinity. The sequence specificity of polyamides has been extensively studied in vitro with cognate site identification (CSI) and with traditional biochemical and biophysical approaches, but the study of polyamide binding to genomic targets in cells remains elusive. Here we report a method, the crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC), that identifies polyamide binding sites across the genome. COSMIC is similar to chromatin immunoprecipitation (ChIP), but differs in two important ways: (1) a photocrosslinker is employed to enable selective, temporally-controlled capture of polyamide binding events, and (2) the biotin affinity handle is used to purify polyamide&#8211;DNA conjugates under semi-denaturing conditions to decrease DNA that is non-covalently bound. COSMIC is a general strategy that can be used to reveal the genome-wide binding events of polyamides and other genome-targeting chemotherapeutic agents.

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Identifying the direct targets of genome-targeting molecules remains a major challenge. To understand how DNA-binding molecules engage the genome, we developed a method that relies on crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC).

COSMIC ile Hücrelerde İlaç-DNA Etkileşimlerinin genom Haritalama (Küçük moleküllerinin çapraz bağlanmasını Kromatin yalıtmak için)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

Manyetik aktif hücre stratejileri yalıtmak ve Sinovyal sıvı elde edilen mezenkimal kök hücre bir tavşan modelinden arındırmak için sıralama

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Bir In vivo Çapraz yaklaşım Drosophila Embriyolar