Bu çalışma, Şanghay Bilim ve Teknoloji Komitesi (STCSM) Projesi (22S31902000) ve Şanghay Cilt Hastalıkları Hastanesi Klinik Araştırma Kuluçka Programı (NO. lcfy2021-10) tarafından desteklenmiştir.

Çalışma, Şanghay Cilt Hastalıkları Hastanesi Kurumsal İnceleme Kurulu (No. 2020-15) tarafından onaylandı. İnsan kan örneklerini içeren tüm deneysel prosedürler Biyogüvenlik Seviye II laboratuvarında gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. QD nano boncuklarının hazırlanması
NOT: QD nanoboncuk sentezi için, QD nanoboncukları sentezlemek için yağ fazının su fazına oranı 1:5 olan bir emülsiyon-çözücü buharlaştırma tekniği kullanıldı. Mini emülsiyon ultrasonikasyon yoluyla üretilir ve nanoboncuklar çözücü (kloroform) buharlaşması yoluyla katılaşır. Sodyum hidroksit, nanoboncuk yüzeyindeki anhidrit gruplarının hidrolizini katalize etmek ve bunları karboksil gruplarına dönüştürmek için kullanıldı.
<ol><li>Yağ fazı ve sulu faz çözeltilerinin hazırlanması<ol><li>1 mL yağ fazı hazırlayın: 0.4 mL poli (stiren-ko-maleik anhidrit) (PSMA) çözeltisi (50 mg / mL), 0.1 mL QD çözeltisi (100 mg / mL), 1 mL'den az herhangi bir hacmi kloroform ile doldurun.</li>
		<li>5 mL sulu faz hazırlayın: SDS sulu çözeltisi (ağırlıkça %0,5).</li>
	</ol></li>
	<li>Emülsiyonun hazırlanması ve katılaşması<ol><li>Bir şişeye (15 mL) 1 mL yağ fazı ve 5 mL sulu faz ekleyin ve şişeyi manyetik bir karıştırıcı üzerine yerleştirin. Manyetik karıştırıcının gücünü açın.</li>
		<li>Yağ ve sulu fazlar tamamen karıştırıldıktan sonra, şişeyi hemen programlanan (60 s, 3 sn darbe ve ardından 3 sn duraklama,% 50 genlik) ultrasonikasyona aktarın ve gücü açın.</li>
		<li>Ultrasonikasyondan sonra çözeltiyi gözlemleyin. Başlangıçta koyu kırmızı renkli çözelti, hala kırmızımsı bir alt tonu koruyan yanardöner bir faza geçti.</li>
		<li>Şişeyi, gece boyunca sürekli karıştırarak oda sıcaklığında manyetik karıştırıcıya geri yerleştirin. Kloroform yavaş yavaş buharlaştırıldı ve emülsiyon kompozit nanoboncuklar halinde katılaştı.</li>
	</ol></li>
	<li>Nanoboncukların yüzey modifikasyonu<ol><li>Nanoboncuk süspansiyonuna 1 saat boyunca 0.1 mL 0.1 mM sodyum hidroksit ekleyin. Nanoboncukların yüzeyindeki anhidrit grupları, karboksil gruplarına hidrolize olur.</li>
	</ol></li>
	<li>Nanoboncukların saflaştırılması<ol><li>Manyetik karıştırıcıyı kapatın ve katılaşmış nanoboncukları bir santrifüj tüpüne taşıyın. Tüpü oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 13523 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.</li>
		<li>Çökeltmeye ilk deiyonize su hacmini ekleyin, tüpü kapağıyla örtün, ultrasonik su banyosuna daldırın ve çökelti tamamen dağılana kadar daldırmayı sürdürün.</li>
		<li>1.4.1-1.4.2 adımlarını iki kez tekrarlayın ve son olarak nano boncukları cam şişeye aktarın. Kullanana kadar 4 °C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Nanoboncukların karakterizasyonu<ol><li>İletim elektronik mikroskobu (TEM) görüntüleme22 kullanarak QD nanoboncuklarının boyutunu ve morfolojisini karakterize edin. NOT: QD çözeltisi ve PSMA çözeltisinin oranı değiştirilerek farklı boyutlarda nanoboncuklar elde edilebilir. QDs nanoboncuklarının boyutu, dinamik ışık saçılımı (DLS)27 ile de belirlenebilir.</li>
	</ol></li>
</ol>2. QDNB-antikor konjugatlarının hazırlanması
<ol><li>Karboksil gruplarının aktivasyonu<ol><li>200 μL fosfat tamponuna (PB, 20 mM, pH 6.0) 100 μL hazırlanmış QDNB (10 mg / mL) ekleyin, ardından 6 μL EDC (20 mg / mL) ekleyin.</li>
		<li>Karışımı bir döner karıştırıcı üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.</li>
		<li>İnkübasyondan sonra, karışımı oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 13523 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.</li>
		<li>Çökeltmeye 100 μL PB (20 mM, pH 6.0) ekleyin, tüpü kapağıyla kapatın ve çökelti tamamen dağılana kadar tüpü operasyonel ultrasonik su banyosuna daldırın.</li>
	</ol></li>
	<li>Antikor ve nanoboncukların konjugasyonu<ol><li>100 μg antikoru 200 μL PB (20 mM, pH 6.0) içinde dağıtın ve adım 2.1'den elde edilen aktive edilmiş QDNB süspansiyonunu antikor çözeltisine ekleyin.</li>
		<li>Karışımı sürekli rotasyonla oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. 5 dakika boyunca (oda sıcaklığında) 6010 x g'da santrifüjleme ile fazla antikorları çıkarın ve ardından süpernatanı dikkatlice atın.</li>
	</ol></li>
	<li>Nanoboncukların engellenmesi<ol><li>Kalıntıya (adım 2.2.2'de elde edilen) 200 μL% 1 kazein çözeltisi (20 mM PB tamponunda, pH 7.4) ekleyin, tüpü kapağıyla kapatın ve kalıntı tamamen dağılana kadar operasyonel ultrasonik su banyosuna daldırın.</li>
		<li>Karışımı sürekli rotasyonla 2 saat oda sıcaklığında inkübe edin. NOT: Bu adımın amacı, QDNB'nin yüzeyindeki tepki vermemiş bölgeleri engellemektir.</li>
	</ol></li>
	<li>Konjugatların depolanması<ol><li>Karışıma 100 μL koruyucu solüsyon (20 mM PB tampon, pH 7.4, %1 BSA, %5 trehaloz, %6 sükroz, %0.1 S9, pH 7.4) ekleyin ve sonraki kullanım için 4 °C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Yanal akış immünoassay şeritlerinin hazırlanması
NOT: İmmünokromatografik şerit, bir nitroselüloz (NC) membran, bir numune pedi, bir eşlenik ped, bir emici ped ve bir polivinil klorür (PVC) levhadan oluşur (Şekil 1). Tüm solüsyonlar hemen hazırlanmalı ve kullanılmalıdır. Yanal akışlı immünoassay şeritlerinin kontrollü neme sahip temiz bir odada hazırlanması önerilir.
<ol><li>NC membranının hazırlanması<ol><li>Test hattı (T-hattı) ve kontrol hattı (C-hattı) kaplama çözeltisini hazırlayın: CRP yakalama antikorunu ve keçi anti-tavşan IgG'yi PB ile 1 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin.</li>
		<li>PVC levhayı düzgün bir şekilde yerleştirin ve PVC levhanın kenarından 25 mm uzakta bulunan koruyucu kağıdı çıkarın. NC membranı, kalan koruyucu kağıdın alt kenarı boyunca PVC levhaya hizalayın ve yapıştırın.</li>
		<li>T-line ve C-line kaplama solüsyonlarını NC membranına 1 μL/cm'lik bir püskürtme hızında dağıtın, üst kenardan 20 mm uzağa yerleştirildiğinden ve bir test çizgisi (1 mm genişliğinde) oluşturduğundan emin olun.</li>
		<li>NC membranı, kurutma için nem oranının %30'un altında ve 18-26 °C sıcaklık aralığının olduğu koşullara yerleştirin. Kuruma süresi en az 24 saat olmalıdır. NOT: NC membranın üst ve alt kenarlarının bitişik alanların karşılık gelen kenarlarıyla aynı hizada olduğundan emin olun. NC membranlara elle dokunulmamalıdır. Bu aşamadaki nem %45 ila %65 aralığında kontrol edilmelidir. Devam etmeden önce, T-line kaplama çözeltisi, C-line kaplama çözeltisi ve NC membranı aynı sıcaklığa dengelenmelidir.</li>
	</ol></li>
	<li>Eşlenik pedin hazırlanması<ol><li>Konjugat pedi konjuge ped arıtma çözeltisine daldırın (20 mM PB tamponu, pH 7.4,% 1 BSA).</li>
		<li>Islatılmış eşlenik pedi gece boyunca kurutma işlemi (oda sıcaklığı) için bir kurutma fırınına yerleştirin.</li>
		<li>Modifiye edilmiş eşlenik pedi PVC levhaya yavaşça yapıştırın.</li>
		<li>Hazırlanan QDNB-antikor konjuge çözeltisini koruyucu çözelti (20 mM PB tamponu, pH 7.4, %1 BSA, %5 trehaloz, %6 sükroz, %0.1 S9, pH 7.4) ile seyreltin.</li>
		<li>QDNB-antikor konjugat çözeltisini 1 μL/cm'lik bir püskürtme hızında konjugat ped üzerine dağıtın ve konjugat pedi 24 saat kurutun. NOT: Spesifik seyreltme oranı, tespit hedefine göre ayarlanmalıdır.</li>
	</ol></li>
	<li>Numune pedinin hazırlanması<ol><li>Numune pedini numune pedi işleme solüsyonuna daldırın (20 mM PB tamponu, pH 7.4, %1 BSA, %5 trehaloz, %6 sükroz, %0.1 S9, pH 7.4).</li>
		<li>Islatılmış numune pedini bir kurutma fırınına (45 °C) yerleştirin ve 24 saat kurutun.</li>
	</ol></li>
	<li>Kartın montajı ve şeritler halinde kesilmesi<ol><li>Şekil 1'de gösterildiği gibi, emici kağıdı (emici ped), eşlenik pedi ve numune pedini NC membranlı PVC levha üzerine art arda yerleştirin.</li>
		<li>Kartı 3,8 mm genişliğinde şeritler halinde kesin.</li>
	</ol></li>
	<li>Şeritlerin paketlenmesi<ol><li>Test şeritlerini plastik bir kasetle kaplayın ve kurutucu içeren bir alüminyum folyo poşeti kapatın.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Tahlil işlemi ve kalitatif değerlendirme
NOT: İnsan kan örneklerini içeren işlemlerin bir Biyogüvenlik Seviye II laboratuvarında yapılması önerilir. İnsan plazma örnekleri bir klinik laboratuvardan (kimliği belirsiz insan deneklerden) elde edildi. Tipik olarak, insan kanı bir EDTA vakum tüpü kullanılarak toplandı ve plazma standart protokol34'e göre izole edildi. Plazma ayırma için oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 3.000 × g'da santrifüjleyin. Sarı plazma üst tabakasını bir pipet kullanarak toplayın ve plazmayı 1,5 ml'lik bir tüpte -80 ° C'de kullanana kadar saklayın.
<ol><li>10 μL plazma numunesini veya kalibratör solüsyonunu %0,1 Tween 20 içeren 1 mL'lik bir PBS tamponuna pipetleyin. Daha sonra, hazırlanan seyreltilmiş numunenin 100 μL'sini test şeridinin numune pedine aktarın.</li>
	<li>15 dakikalık bir çalışmadan sonra, kalitatif sonuçlar elde etmek için ultraviyole ışığa maruz kalma altında T çizgisinin ve C çizgisinin floresan sinyallerini gözlemleyin.</li>
	<li>Kantitatif analiz için floresan yoğunluklarını elde etmek için şerit kartını bir floresan yanal akış tahlil okuyucusuna yerleştirin. NOT: Bu örnekte, sandviç immünoassay yöntemi kullanılmıştır35,36; Bir kırmızı çizgi (kontrol çizgisi) negatif bir sonucu gösterirken, iki kırmızı çizgi (test ve kontrol çizgileri) pozitif bir sonucu gösterir. Kontrol hattının olmaması, yapılan testin geçersiz olduğunu gösterir.</li>
</ol>

Biyobelirteç Tespitinde Gelişmiş Hassasiyet için Quantum Dot Nanobeads

<ol>
	<li>de Puig, H., Bosch, I., Gehrke, L., Hamad-Schifferli, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+of+the+nano-bio+interface+in+lateral+flow+and+dipstick+immunoassays.">Challenges of the nano-bio interface in lateral flow and dipstick immunoassays.</a> Trends Biotechnol. 35 (12), 1169-1180 (2017).</li><li>Miller, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spin-enhanced+nanodiamond+biosensing+for+ultrasensitive+diagnostics.">Spin-enhanced nanodiamond biosensing for ultrasensitive diagnostics.</a> Nature. 587 (7835), 588-593 (2020).</li><li>Gao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platinum-decorated+gold+nanoparticles+with+dual+functionalities+for+ultrasensitive+colorimetric+in+vitro+diagnostics.">Platinum-decorated gold nanoparticles with dual functionalities for ultrasensitive colorimetric in vitro diagnostics.</a> Nano Lett. 17 (9), 5572-5579 (2017).</li><li>Fan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deeply-dyed+nanobead+system+for+rapid+lateral+flow+assay+testing+of+drugs+at+point-of-care.">Deeply-dyed nanobead system for rapid lateral flow assay testing of drugs at point-of-care.</a> Sensors Actuators B Chem. 362, 131829 (2022).</li><li>Garcia, V. S., Guerrero, S. A., Gugliotta, L. M., Gonzalez, V. D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lateral+flow+immunoassay+based+on+colored+latex+particles+for+detection+of+canine+visceral+leishmaniasis.">A lateral flow immunoassay based on colored latex particles for detection of canine visceral leishmaniasis.</a> Acta Trop. 212, 105643 (2020).</li><li>You, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Household+fluorescent+lateral+flow+strip+platform+for+sensitive+and+quantitative+prognosis+of+heart+failure+using+dual-color+upconversion+nanoparticles.">Household fluorescent lateral flow strip platform for sensitive and quantitative prognosis of heart failure using dual-color upconversion nanoparticles.</a> ACS Nano. 11 (6), 6261-6270 (2017).</li><li>Ye, Z., Tan, M., Wang, G., Yuan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+fluorescent+europium+chelate-doped+silica+nanoparticles:+preparation,+characterization+and+time-resolved+fluorometric+application.">Novel fluorescent europium chelate-doped silica nanoparticles: preparation, characterization and time-resolved fluorometric application.</a> J Mater Chem. 14 (5), 851 (2004).</li><li>Xu, Y., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+fluorescent+labeling+of+silica+nanoparticles+with+lanthanide+chelates+for+highly+sensitive+time-resolved+immunofluorometric+assays.">Multiple fluorescent labeling of silica nanoparticles with lanthanide chelates for highly sensitive time-resolved immunofluorometric assays.</a> Clin Chem. 53 (8), 1503-1510 (2007).</li><li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+detection+sensitivity+by+oriented+bioconjugation+of+antibodies+to+quantum+dots+with+a+flexible+spacer+arm+for+immunoassay.">Improving detection sensitivity by oriented bioconjugation of antibodies to quantum dots with a flexible spacer arm for immunoassay.</a> RSC Adv. 6 (55), 50119-50127 (2016).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+sensitive+detection+of+protein+biomarker+using+a+portable+fluorescence+biosensor+based+on+quantum+dots+and+a+lateral+flow+test+strip.">Rapid and sensitive detection of protein biomarker using a portable fluorescence biosensor based on quantum dots and a lateral flow test strip.</a> Anal Chem. 82 (16), 7008-7014 (2010).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+strip+sensor+for+rapid+determination+of+toxins.">Fluorescent strip sensor for rapid determination of toxins.</a> Chem Commun. 47 (5), 1574-1576 (2011).</li><li>Medintz, I. L., Uyeda, H. T., Goldman, E. R., Mattoussi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+dot+bioconjugates+for+imaging,+labeling+and+sensing.">Quantum dot bioconjugates for imaging, labeling and sensing.</a> Nat Mater. 4 (6), 435-446 (2005).</li><li>Smith, A. M., Nie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compact+quantum+dots+for+single-molecule+imaging.">Compact quantum dots for single-molecule imaging.</a> J Vis Exp. 68, e4236 (2012).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-by-layer+assembly+of+magnetic-core+dual+quantum+dot-shell+nanocomposites+for+fluorescence+lateral+flow+detection+of+bacteria.">Layer-by-layer assembly of magnetic-core dual quantum dot-shell nanocomposites for fluorescence lateral flow detection of bacteria.</a> Nanoscale. 12 (2), 795-807 (2020).</li><li>Hu, J., Tang, F., Jiang, Y. Z., Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+screening+and+quantitative+detection+of+Salmonella+using+a+quantum+dot+nanobead-based+biosensor.">Rapid screening and quantitative detection of Salmonella using a quantum dot nanobead-based biosensor.</a> Analyst. 145 (6), 2184-2190 (2020).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+graphene+oxide-supported+multilayer-quantum+dots+nanofilm+into+multiplex+lateral+flow+immunoassay:+A+rapid+and+ultrasensitive+point-of-care+testing+technique+for+multiple+respiratory+viruses.">Introduction of graphene oxide-supported multilayer-quantum dots nanofilm into multiplex lateral flow immunoassay: A rapid and ultrasensitive point-of-care testing technique for multiple respiratory viruses.</a> Nano Res. 16 (2), 3063-3073 (2023).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric-fluorescent+dual-signal+enhancement+immunochromatographic+assay+based+on+molybdenum+disulfide-supported+quantum+dot+nanosheets+for+the+point-of-care+testing+of+monkeypox+virus.">Colorimetric-fluorescent dual-signal enhancement immunochromatographic assay based on molybdenum disulfide-supported quantum dot nanosheets for the point-of-care testing of monkeypox virus.</a> Chem Eng J. 472, 144889 (2023).</li><li>Zheng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-color+MoS2@QD+nanosheets+mediated+dual-mode+lateral+flow+immunoassay+for+flexible+and+ultrasensitive+detection+of+multiple+drug+residues.">Dual-color MoS2@QD nanosheets mediated dual-mode lateral flow immunoassay for flexible and ultrasensitive detection of multiple drug residues.</a> Sensors Actuators B Chem. 403, 135142 (2024).</li><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+incorporation+of+quantum+dots+into+porous+microspheres+through+a+solvent-evaporation+approach.">Efficient incorporation of quantum dots into porous microspheres through a solvent-evaporation approach.</a> Langmuir. 28 (14), 6141-6150 (2012).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+lateral+flow+immunoassay+for+highly+sensitive+detection+of+eight+anticoagulant+rodenticides+based+on+cadmium-free+quantum+dot-encapsulated+nanospheres.">Fluorescent lateral flow immunoassay for highly sensitive detection of eight anticoagulant rodenticides based on cadmium-free quantum dot-encapsulated nanospheres.</a> Sensors Actuators B Chem. 324, 128771 (2020).</li><li>Gao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+dendritic+mesoporous+silica+nanoparticles'+surface+chemistry+for+quantum+dot+enrichment+and+an+ultrasensitive+lateral+flow+immunoassay.">Rational design of dendritic mesoporous silica nanoparticles' surface chemistry for quantum dot enrichment and an ultrasensitive lateral flow immunoassay.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 13 (18), 21507-21515 (2021).</li><li>Xu, L. D., Zhu, J., Ding, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoassay+of+SARS-CoV-2+nucleocapsid+proteins+using+novel+red+emission-enhanced+carbon+dot-based+silica+spheres.">Immunoassay of SARS-CoV-2 nucleocapsid proteins using novel red emission-enhanced carbon dot-based silica spheres.</a> Analyst. 146 (16), 5055-5060 (2021).</li><li>Tao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-Cov-2+Spike-S1+antigen+test+strip+with+high+sensitivity+endowed+by+high-affinity+antibodies+and+brightly+fluorescent+QDs/silica+nanospheres.">SARS-Cov-2 Spike-S1 antigen test strip with high sensitivity endowed by high-affinity antibodies and brightly fluorescent QDs/silica nanospheres.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 15 (23), 27612-27623 (2023).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+ultrasensitive+fluorescent+immunochromatographic+assay+based+on+multilayer+quantum+dot+nanobead+for+simultaneous+detection+of+SARS-CoV-2+antigen+and+influenza+A+virus.">Development of an ultrasensitive fluorescent immunochromatographic assay based on multilayer quantum dot nanobead for simultaneous detection of SARS-CoV-2 antigen and influenza A virus.</a> Sensors Actuators B Chem. 345, 130372 (2021).</li><li>Chen, L., Chen, C., Li, R., Li, Y., Liu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CdTe+quantum+dot+functionalized+silica+nanosphere+labels+for+ultrasensitive+detection+of+biomarker.">CdTe quantum dot functionalized silica nanosphere labels for ultrasensitive detection of biomarker.</a> Chem Commun. 19, 2670-2672 (2009).</li><li>Chu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+preparing+quantum+dot+nanospheres+with+narrow+size+distribution.">A novel method for preparing quantum dot nanospheres with narrow size distribution.</a> Nanoscale. 2 (4), 542-547 (2010).</li><li>Zhang, P., Lu, H., Chen, J., Han, H., Ma, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+sensitive+detection+of+HBsAg+by+using+a+quantum+dots+nanobeads+based+dot-blot+immunoassay.">Simple and sensitive detection of HBsAg by using a quantum dots nanobeads based dot-blot immunoassay.</a> Theranostics. 4 (3), 307-315 (2014).</li><li>Ouyang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+on-site,+ultra-sensitive,+quantitative+sensing+method+for+the+determination+of+total+aflatoxin+in+peanut+and+rice+based+on+quantum+dot+nanobeads+strip.">An on-site, ultra-sensitive, quantitative sensing method for the determination of total aflatoxin in peanut and rice based on quantum dot nanobeads strip.</a> Toxins. 9 (4), 137 (2017).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+ciprofloxacin+on-site+rapid+detections+using+quantum+dot+microsphere+based+immunochromatographic+test+strips.">Quantitative ciprofloxacin on-site rapid detections using quantum dot microsphere based immunochromatographic test strips.</a> Food Chem. 335, 127596 (2021).</li><li>Chen, Y., Fu, Q., Xie, J., Wang, H., Tang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+high+sensitivity+quantum+dot-based+fluorescent+quenching+lateral+flow+assay+for+the+detection+of+zearalenone.">Development of a high sensitivity quantum dot-based fluorescent quenching lateral flow assay for the detection of zearalenone.</a> Anal Bioanal Chem. 411 (10), 2169-2175 (2019).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+detection+using+quantum+dot+fluorescence+immunochromatography+combined+with+isothermal+amplification+and+CRISPR/Cas13a.">SARS-CoV-2 detection using quantum dot fluorescence immunochromatography combined with isothermal amplification and CRISPR/Cas13a.</a> Biosens Bioelectron. 202, 113978 (2022).</li><li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-based+quantum+dot+nanobead+lateral+flow+assay+for+facile+detection+of+varicella-zoster+virus.">CRISPR-based quantum dot nanobead lateral flow assay for facile detection of varicella-zoster virus.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 107 (10), 3319-3328 (2023).</li><li>Liu, Y., Xiao, M., Xu, N., Yang, M., Yi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point-of-need+quantitation+of+2,4-dichlorophenoxyacetic+acid+using+a+ratiometric+fluorescent+nanoprobe+and+a+smartphone-based+sensing+system.">Point-of-need quantitation of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid using a ratiometric fluorescent nanoprobe and a smartphone-based sensing system.</a> Sensors Actuators B Chem. 367, 132083 (2022).</li><li>McCafferty, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+collection+processing+and+handling+for+plasma+and+serum+proteomics+BT+-+Serum/plasma+proteomics.">Blood collection processing and handling for plasma and serum proteomics BT - Serum/plasma proteomics.</a> Methods Mol Biol. 2628, 33-40 (2023).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+quantitative+detection+of+C-reactive+protein+based+on+quantum+dots+and+immunofiltration+assay.">Rapid and quantitative detection of C-reactive protein based on quantum dots and immunofiltration assay.</a> Int J Nanomedicine. 10, 6161-6173 (2015).</li><li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+and+quantitative+detection+of+C-reaction+protein+based+on+immunofluorescent+nanospheres+coupled+with+lateral+flow+test+strip.">Sensitive and quantitative detection of C-reaction protein based on immunofluorescent nanospheres coupled with lateral flow test strip.</a> Anal Chem. 88 (12), 6577-6584 (2016).</li><li>Fan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-component+dual-readout+aggregation-induced+emission+nanobeads+for+qualitative+and+quantitative+detection+of+c-reactive+protein+at+the+point+of+care.">One-component dual-readout aggregation-induced emission nanobeads for qualitative and quantitative detection of c-reactive protein at the point of care.</a> Anal Chem. 96 (1), 401-408 (2024).</li><li>Gui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+and+reverse+fluorescence+dual-signal+readout+immunochromatographic+assay+for+the+sensitive+determination+of+sibutramine.">Colorimetric and reverse fluorescence dual-signal readout immunochromatographic assay for the sensitive determination of sibutramine.</a> ACS Omega. 9 (6), 7075-7084 (2024).</li></ol>

Pengfei Zhang, Shanghai Kundao Biotech'in kurucusudur ve bu şirketle potansiyel finansal çıkarları vardır.

Burada, kuantum nokta nanoboncukların (QDNB)27 hazırlanması için bir protokol ve floresan yanal akış immünolojik testlerinin (LFIA) hazırlanması için QDNB'nin kullanımını açıklıyoruz. Numunelerde CRP'nin kalitatif ve kantitatif ölçümü gösterilmiştir. Bu QDNB bazlı LFIA, diğer hastalık biyobelirteçlerine 25,32, gıda toksinlerine29,30, virüslere 16,...

Yanal akış immünoassay (LFIA) şeritleri, özellikle salgın hastalıklar sırasında hastalık taramasında, bakım noktası 1,2'de çok önemli hızlı tespit araçları olarak hizmet eder. Bununla birlikte, geleneksel kolloidal altın bazlı LFIA test şeritleri, düşük algılama hassasiyeti sergiler ve yalnızca kalitatif sonuçlar sağlar3. LFIA'nın algılama hassasiyetini artırmak için, renkli lateks 4,5, yukarı dönüşümlü floresan nanopartiküller6, zamana bağlı floresan mikroküreler 7,8 ve kuantum noktaları 9,10,11 dahil olmak üzere çeşitli yeni nanopartiküller ortaya çıkmıştır. Yarı iletken nanokristaller olarak da bilinen kuantum noktaları (QD'ler)12,13, ayarlanabilir emisyon dalga boyları, geniş bir uyarma aralığı ve yüksek lüminesans verimliliği sunarak onları biyolojik görüntüleme için ideal etiketler haline getirir.
Bununla birlikte, tek tek kuantum noktaları tarafından yayılan floresan sinyali zayıf kalır ve bu da immünolojik testlerde nispeten düşük algılama duyarlılığı ile sonuçlanır. Mikroküreler içinde çok sayıda kuantum noktasının kapsüllenmesi, sinyalleri yükseltebilir ve kuantum nokta tabanlı immünolojik testlerin hassasiyetini artırabilir. Mikro kürelerin içindeki kuantum noktalarını kapsüllemek için katman katman kendi kendine montaj 14,15,16,17,18, şişme yöntemi19,20 ve silika mikroküre 21,22,23,24 kapsülleme gibi çeşitli yöntemler kullanılmıştır. Örneğin, kuantum nokta ile işlevselleştirilmiş silika nanosfer etiketleri, sıkıştırılmış immünoreaksiyon25 başına QD yüklemesi artırılarak elde edilebilir. Nano ölçekli QD-BSA nanosferleri hazırlamak için ultrasonik atomizer ile donatılmış bir sprey kurutucu da kullanılmıştır26. Bununla birlikte, yukarıda belirtilen yöntemler karmaşık çok adımlı, floresan söndürme ve düşük üretkenlikten muzdariptir.
Önceki çalışmamız27'de, polimer nanoboncukların içindeki kuantum noktalarını kapsüllemek için bir emülsiyon-çözücü buharlaştırma yöntemi rapor edilmiştir. Bu hazırlama tekniği basittir, QD'lerin floresan verimliliğini korur, yüksek kapsülleme verimliliği sağlar ve kolay ölçeklenebilir üretime olanak tanır. Çeşitli araştırma grupları, gıda toksini tespiti 28,29,30, bulaşıcı hastalık biyobelirteç tespiti31,32 ve çevresel izleme 33 dahil olmak üzere uygulamalar için bu yöntemle hazırlanan QDNB'leri kullanarak LFIA şeritlerini başarıyla geliştirmiştir.
Bu protokol, kuantum nokta nanoboncuklar (QDNB), QDNB ve antikor konjugasyonu, QDNB tabanlı LFIA'nın hazırlanması ve insan plazma örneklerinde C-reaktif protein (CRP) ölçümü için özel hazırlık adımları sunar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(dimethylamino)propyl)-N&#8217;-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbance paper&#160;</td>
			<td>Kinbio Biotech</td>
			<td>CH37K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CdSe/ZnS quantum dot</td>
			<td>Suzhou Mesolight Inc.</td>
			<td>CdSe/ZnS-625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choloroform</td>
			<td>Sino Pharm</td>
			<td>10006818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CRP antibody</td>
			<td>Hytest Biotech</td>
			<td>4C28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent lateral flow assay reader</td>
			<td>Suzhou Helmence Precision Instrument</td>
			<td>FIC-H1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass fiber pad</td>
			<td>Kinbio Biotech</td>
			<td>SB06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>D111018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane&#160;</td>
			<td>Satorious</td>
			<td>CN140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(styrene-maleic anhydride) copolymer&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S458066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>D110502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sino Pharm</td>
			<td>30166428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sino Pharm</td>
			<td>10019718</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescent lateral flow immunoassay based on quantum dots nanobeads

Yarı iletken nanokristaller olarak da bilinen kuantum noktaları, biyolojik görüntüleme ve algılama için yeni floresan etiketlerdir. Bununla birlikte, zahmetli saflaştırma prosedürleri ile hazırlanan küçük boyutlu (~ 10 nm) kuantum nokta-antikor konjugatları, yanal akış immünoassay şeritleri kullanılarak belirli eser hastalık belirteçlerini tespit etmede sınırlı hassasiyet gösterir. Burada, tek adımlı bir emülsiyon buharlaştırma yöntemi kullanılarak kuantum nokta nanoboncuklarının (QDNB) hazırlanması için bir yöntem sunuyoruz. Hazırlandığı gibi QDNB kullanılarak, örnek olarak C-reaktif protein (CRP) kullanılarak hastalık biyobelirteçlerini tespit etmek için bir floresan yanal akış immünolojik testi üretildi. Tek kuantum nokta nanopartiküllerinden farklı olarak, kuantum nokta nanoboncuk-antikor konjugatları, yüzlerce kuantum noktasını tek bir polimer kompozit nanoboncukta kapsülleyerek sinyal amplifikasyonu nedeniyle immünoassay etiketleri olarak daha hassastır. Ayrıca, QDNB'lerin daha büyük boyutu, QDNB'leri antikorlarla konjuge ederken daha kolay santrifüjleme ayrımını kolaylaştırır. QDNB'lere dayalı floresan yanal akış immünolojik testi üretildi ve numunedeki CRP konsantrasyonu 15 dakika içinde ölçüldü. Test sonuçları, UV ışığı aydınlatması altında kalitatif olarak değerlendirilebilir ve 15 dakika içinde bir floresan okuyucu kullanılarak kantitatif olarak ölçülebilir.

Lateral flow immunoassay (LFIA) strips serve as crucial rapid detection tools at point-of-care1,2, particularly in disease screening during epidemics. However, traditional colloidal gold-based LFIA test strips exhibit low detection sensitivity and only provide qualitative results3. To enhance the detection sensitivity of LFIA, various new nanoparticles have emerged, including colored latex4,5, upconversion fluorescent nanoparticles6, time-resolved fluorescent microspheres7,8, and quantum dots9,10,11. Quantum dots (QDs)12,13, also known as semiconductor nanocrystals, offer tunable emission wavelengths, a wide excitation range, and high luminescence efficiency, making them ideal labels for biological imaging.
However, the fluorescence signal emitted by individual quantum dots remains weak, resulting in relatively low detection sensitivity in immunoassays. Encapsulation of numerous quantum dots within microspheres can amplify signals and improve the sensitivity of quantum dot-based immunoassays. Various methods, such as layer-by-layer self-assembly14,15,16,17,18, the swelling method19,20, and silica microsphere21,22,23,24 encapsulation, have been employed to encapsulate quantum dots inside microspheres. For example, quantum dot-functionalized silica nanosphere labels can be achieved by increasing QD loading per sandwiched immunoreaction25. A spray dryer equipped with an ultrasonic atomizer has also been used to prepare nanoscale QD-BSA nanospheres26. However, the aforementioned methods suffer from complex multi-steps, fluorescence quenching, and low productivity.
In our previous work27, an emulsion-solvent evaporation method for encapsulating quantum dots inside polymer nanobeads was reported. This preparation technique is simple, maintains the fluorescent efficiency of QDs, ensures high encapsulation efficiency, and allows for easy scalable production. Several research groups have successfully developed LFIA strips using QDNBs prepared through this method for applications, including food toxin detection28,29,30, infectious disease biomarker detection31,32, and environmental monitoring33.
This protocol presents specific preparation steps for quantum dot nanobeads (QDNB), QDNB and antibody conjugation, preparation of QDNB-based LFIA, and measurement of C-reactive protein (CRP) in human plasma samples.

Yazar Spotlight: Hassas Floresan Yanal Akış İmmünoanalizler için Yüksek Kaliteli Quantum Dot Nanoboncuklar

Kuantum Noktaları Nano Boncuklara Dayalı Floresan Yanal Akış İmmünoassay

Our research interests currently focus on constructing high-quality multifunctional nanomaterials and their application in the development of ultrasensitive point-of-care diagnostics. Lateral flow immunoassay strips serve as critical rapid detection tools at the point-of-care, particularly in disease screening during epidemics to enhance the detection sensitivity to lateral flow immunoassay. Various new nanoparticle has emerged, including colored latex, upcoercion fluorescent nanoparticles, timed-result fluorescent microspheres, and quantum dots.We presented a one-step emulsion evaporation method for preparing quantum dot nanobeads and other applications in sensitivity, for instance, lateral fluoro-immunoassays. Common to other methods of preparing quantum dot nanobeads, this protocol offers the advantage of simplicities of operation and high productivity. Additionally, the polymer composite nanobeads are biocompatible, unlike silica nanobeads, which generally need additional surface modification with polymers.Sensitive fluorescent lateral flow immunoassay strips have been developed using prepared quantum dot nanobeads. These strips can be used to qualitatively and quantitatively detect disease biomarkers at point-of-care. This new assay could help medical professionals diagnose diseases quickly and accurately.

QDNB hazırlama prosedürleri Şekil 1A'da şematik olarak gösterilmiştir. Kloroformda QD'ler ve polimer içeren yağ fazı su fazı ile karıştırıldı ve sonikasyon ile bir mini emülsiyon elde edildi. Emülsiyon, kloroformun kademeli olarak buharlaştırılmasıyla katılaştırıldı. QDNB'nin transmisyon elektron mikrografı (TEM) Şekil 2A'da sunulmuştur. QDNB'ler, TEM görüntülerinde 50 QDNB'nin üzerinde ölçülen, ortalama çapları 96 nm olan k...

Burada, kuantum nokta nanoboncukların (QDNB) hazırlanması ve QDNB bazlı yanal akış immünoassay şeritleri kullanılarak hastalık biyobelirteçlerinin tespiti için bir protokol açıklıyoruz. Test sonuçları, UV ışığı aydınlatması altında kalitatif olarak değerlendirilebilir ve 15 dakika içinde bir floresan şerit okuyucu kullanılarak kantitatif olarak ölçülebilir.

Quantum dots, also known as semiconductor nanocrystals, are novel fluorescent labels for biological imaging and sensing. However, quantum dot-antibody ...

fluorescent-lateral-flow-immunoassay-based-on-quantum-dots-nanobeads

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescent Lateral Flow Immunoassay Based on Quantum Dots Nanobeads

487 Görüntüleme.  Tongji University. Araştırma ilgi alanlarımız şu anda yüksek kaliteli çok işlevli nanomalzemelerin oluşturulmasına ve bunların ultra hassas hasta başı teşhislerinin geliştirilmesinde uygulanmasına odaklanmaktadır. Yanal akış immünoassay şeritleri, yanal akış immünolojik testine karşı algılama duyarlılığını artırmak için özellikle salgınlar sırasında hastalık taramasında, bakım noktasında kritik hızlı tespit araçları olarak hizmet ed...