Protokolümüz, altın standart ELISA tekniği ile karşılaştırılabilir analit konsantrasyonlarının kantitatif immüno-tespiti için akrilik bir mikroakışkan cihaz üretmek için yüksek çözünürlüklü bir mikrofrezeleme yöntemini açıklamaktadır. Önemli olan, temiz bir oda olmadan basit ve düşük maliyetli bir termoplastik mikroakışkan cihazın üretilmesidir, bu da daha kısa tahlil sürelerine ve nicel olarak iyi algılama limitlerine izin verir. Yüzey taşlama ile başlayın.
1,3 milimetre kalınlığındaki PMMA'nın 9 x 25 milimetrelik dikdörtgenlerini 800 mikrometre parmak freze ucu ile kesin. Bu dikdörtgenlerden birini piezoelektrik platforma çift taraflı yapışkan bantla dikkatlice takın. Z-sensörünü PMMA dikdörtgeninin yüzeyine bağlayın ve yerleştirin.
Algılama pimini seçin ve sensör yüzeyinin üzerinde hareket ettirin. Sensöre temas etmeden pimi manuel olarak indirin. Z-sıfır algılama modunu etkinleştirin.
200 mikrometre parmak freze ucunu 14.500 rpm'de döndürün. Yavaşça z eksenindeki başlangıç koordinatına indirin. Ardından, z eksenini kaynağın 30 mikrometre altına sıfırlayın.
Bu koordinatı yeni Z-kaynağı olarak ayarlayın. Kesme panelini etkinleştirmek için mikro freze makinesi yazılımındaki Kes düğmesine tıklayın. Ekle düğmesine tıklayın ve akrilik yüzeyin taşlanması için önceden oluşturulmuş bir kod içeren TXT dosyasını seçin.
İşlemi başlatmak için Çıktı düğmesine tıklayın. Beş mikrometre kısıtlamasının frezelenmesi için, önce parmak freze ucunun dönme hızını 11.000 rpm'ye ayarlayın. Ardından, piezoelektrik platformun arayüzü ile platformu 6,5 mikrometre yükseltin.
Parmak freze ucunu y ekseni boyunca 500 mikrometre hareket ettirin. Piezoelektrik platformu, kontrol arayüzü ile z eksenindeki başlangıç değerine geri döndürün. Ardından, daha önce oluşturulan tasarım dosyasını tasarım yazılımından açarak mikro kanalların frezelenmesini gerçekleştirin.
Yazdır düğmesine tıklayın, özellikler menüsüne erişin ve işlenecek tasarımı içeren katmana karşılık gelen renk penceresine tıklayın. İmalat parametrelerini takım panelinde ayarlayın. Deliklerin frezelenmesi için 800 mikrometrelik parmak freze ucuna geçin.
İlgili renk penceresine tıklayarak ve ilgili imalat parametrelerini seçerek 1,2 milimetre çapındaki deliklerin tasarım katmanını etkinleştirin. Akriliğin yeni bir platformda ters çevrilmiş bir şekilde hizalanması için dikdörtgenin karşıt köşelerinde iki ek delik açın. Akriliği çevirin ve işlenmiş sütunlarla adaptörün üzerine çift taraflı yapışkan bantla bantlayın.
Tasarım yazılımından karşı yüz için deliklerin tasarımını içeren dosyayı açın. Reaktif giriş ve çıkış deliklerinin kalan yarısını 1,5 milimetre çapında ve 0,7 milimetre derinlikte frezeleyin. Her iki akrilik dikdörtgen levhayı izopropil alkol ile temizleyin ve damıtılmış suyla durulayın.
Akriliği 10 dakika boyunca ultrasonik bir banyoya batırın. Her iki akrilik tabakayı da kurutun ve çift taraflı bantla cam Petri çanak kapağının içine bantlayın. Ardından cam Petri kabının tabanını daha büyük bir cam Petri kabının içine yerleştirin.
Petri kabının tabanına bir mililitre kloroform dökün ve kapağı akrilik tabakalarla hızla yerleştirin. Hemen daha büyük Petri kabının tabanına, Petri kabı kapağının seviyesine kadar damıtılmış su ekleyin. Akriliğin bir dakika boyunca kloroform gaza maruz kalmasına izin verin.
Ardından su contasını kırmak için Petri kabını eğin ve hemen Petri kabını ortaya çıkarın. Yapıştırma için, her iki akriliği kloroforma maruz kalan taraflarla yüz yüze hizalayın ve bir sandviç oluşturun. Akrilikleri, akriliğin hizalamasını değiştirerek iki dakikalık iki aralıkla prese yerleştirin.
Ardından, anında kuruyan sıvı yapıştırıcı ile cihazın deliklerinin her birine iki ila üç santimetre hortum takın. Bir şırınga kullanarak kanalları damıtılmış suyla doldurun. Cihazı 10 dakika boyunca ultrasonik bir banyoya batırın.
Daha sonra cihaz kanallarının içindeki suyu boşaltın ve% 5 BSA çözeltisi vermek için bir şırınga kullanın. % 5 BSA'da 7.5 mikrometrede çapı demir mikropartiküllerinin bir süspansiyonunu hazırlayın. Çipi ve mikropartikül süspansiyonunu blokaj çözeltisi ile oda sıcaklığında en az bir saat boyunca inkübe edin.
Daha sonra, mikropartikülleri yan kanal çıkış hortumundan bir şırınga iğnesi ile çipe yerleştirin. Çipi dikey olarak yerleştirin, ardından çipi 90 derecelik iki adımda döndürün, böylece mikropartiküller beş mikrometre kısıtlamasında hedeflenir ve sıkıştırılır. Akrilik cihazın tüm hortumlarını ısı ile kapatın.
Giriş hortumunu sadece birkaç milimetre kalana kadar kesin. Dağıtım iğnesini yıkama tamponu ile doldurun ve kesilmiş hortuma yerleştirin. Çözümün damlamasına izin verin ve ardından iğneyi cihaza bağlayın.
Çıkış hortumunu yanal kanaldan kesin, ardından şırınga pompasına bağlayın. Ardından, ana kanal çıkış hortumu için aynı prosedürü tekrarlayın. Ardından çipi mıknatısa takın.
İmmün tespit için, yıkama tamponunun saatte 50 mikrolitrede 10 dakika boyunca akmasını sağlayın. Kalan yıkama tamponunu dağıtım iğnesinden bir mikropipetle çıkarın ve 50 mikrolitre nanopartikül süspansiyonu ekleyin. Nanopartikül süspansiyonunu saatte 100 mikrolitre akış hızında yedi dakika boyunca akıtın.
Ardından akış hızını saatte 50 mikrolitre olarak değiştirin ve akışa 15 dakika daha devam edin. Dağıtım iğnesini değiştirin ve yıkama tamponunu aynı hızda 10 dakika boyunca akıtın. Kalan yıkama tamponunu dağıtım iğnesinden bir mikropipetle çıkarın ve 100 mikrolitre florojenik substrat ekleyin.
Substrat girişi, floresan ölçümü ve yıkama adımı için akış hızını ve zaman parametrelerini ayarlayın. Florojenik substratın giriş akışını saatte 50 mikrolitrede altı dakika boyunca aktive edin. Substrat akışı durmadan 15 saniye önce, mikroskopun floresansını açın.
Substrat 1.000 milisaniyelik bir pozlama süresiyle durmadan 10 saniye önce mikroskop kamerasının yazılımıyla görüntü yakalamaya başlayın. Substrat yıkama durduktan hemen sonra istenen akış hızı parametresinin Başlat düğmesine tıklayın. Saniyede bir kare hızında altı dakika boyunca görüntüleme gerçekleştirin.
Seçilen ölçüm akışı durduktan hemen sonra yıkama akışının Başlat düğmesine tıklayın. İmmünoassay için lizozim konjuge nanopartiküller ve at turpu peroksidaz konjuge sekonder antikor kullanıldı. Farklı primer antikor konsantrasyonları için floresan yoğunluğunda bir artış, tuzaktan önceki ve sonraki bölgeler karşılaştırılarak gözlendi ve substrat floresansındaki değişimin primer antikorun konsantrasyonu ile doğru orantılı olduğunu gösterdi.
Belirli bir primer antikor konsantrasyonu için, floresan yoğunluğu, florojenik substratın farklı akış hızlarında zamanın bir fonksiyonu olarak çizildi. Substratın HRP enzimi tarafından dönüşüm kapasitesi, akış hızıyla ters orantılıydı, saatte bir mikrolitrelik bir akış hızı için maksimum yoğunluk elde edildi. Çeşitli birincil antikor konsantrasyonları için farklı akış hızları için, immünoreaksiyondan sonra ve önce floresan farklılıklarının eğrileri, mililitre başına 1.000 nanogramlık bir konsantrasyon için, floresanın değerlendirilen tüm akış hızları için doygun olduğunu göstermiştir.
Her bir akış hızı için birincil antikor konsantrasyonuna göre elde edilen floresan yoğunluğundaki farklılıkların maksimum değeri kullanılarak bir kalibrasyon eğrisi hazırlandı. Saatte bir mikrolitredeki yüksek değişkenlik ve yüksek floresan seviyeleri, hızın reaksiyona giren substratın akışını desteklemediğini ve tuzaktan hemen sonra birikme eğiliminde olduğunu göstermiştir. Kloroforma maruz kalmak sıcaklığa karşı çok hassas olduğu için mikrokanalların sızdırmazlık adımlarına özel dikkat gösterilmelidir.
Tekrarlanabilir sonuçlar için, sıcaklık her zaman aynı olmalıdır. Sistemimiz, mikropartiküllerin kompaktlığının ve boyutunun, nanopartikül boyutunun, antijenlerin, tespit antikorunun ve substratın nanopartikül bazlı mikroakışkan immünoassayda tespit sınırı için belirleyici faktörler olduğunu anlamaya yardımcı olur.
