Bu protokolün amacı, bir AD fare modelinin beyinlerindeki demir birikiminin miktarının ve dağılımının nasıl değerlendirileceğini açıklamaktır. Bu protokolde, AD fare modeli olarak sekiz aylık 5xFAD transgenik fareleri kullandık ve bunları aynı yaştaki vahşi tip farelerle karşılaştırdık. Kimyasal reaktifin hazırlanması, beynin kesitlere ayrılması, Perls/DAB boyamanın gerçekleştirilmesi ve elde edilen görüntülerin analiz edilmesi için prosedürlerin ayrıntılarını dahil ediyoruz.
Fareyi uygun şekilde uyuşturun ve anestezi ve analjezi derinliğini kontrol edin. Kalbini açığa çıkarın, ardından sağ atriyumu kesin. Sırayla sol ventrikülden 20 mililitre PBS ve% 4 PFA enjekte edin.
Fiksasyon titremelerinin gözlemlenmesi gerektiğine dikkat edin. Farenin kafasını kes ve beynini çıkar. Ardından, beyni 12 ila 24 saat boyunca% 4 PFA'da sabitleyin.
Beyni 12 ila 24 saat boyunca %15 ve %30 sükroz içine daldırın. Beyni ortadan sagittal olarak kesin ve bölümlere ayırmak için her iki yarısını da kullanın. Beyni topuzun üzerine monte edin, beynin etrafına bir kalay folyo halka koyun ve beyni gömmek için içine OCT ekleyin.
Kriyostatın kesitlerinin kalınlığını ve sıcaklığını ayarlayın. Sonra beyni kesin. Bölümler katlanırsa, bölümleri açmak için yumuşak fırçalar kullanın.
PBS ile her bölümü slaytlara toplayın, ardından bölümdeki baloncukları ortadan kaldırın. Sağlam beyin dokusuna sahip bir slayt seçin ve PBS ile doldurulmuş plastik bir boyama kutusuna yerleştirin. Kalan OCT bileşiğini iyice durulamak için kutuyu beş dakika boyunca yavaş bir hıza ayarlanmış döner çalkalayıcı üzerine yerleştirin.
20 mililitre% 2 potasyum ferrosiyanür ve% 2 eşit hacimde% 2 hidroklorik asit hazırlayın. Daha sonra 50 mililitrelik bir santrifüj tüpünde karıştırın. Slaytı forseps kullanarak tüpe sabitleyin ve karışımı önceden ısıtılmış su banyosunda 60 Santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.
Slaytı PBS ile yıkayın ve kağıt mendil kullanarak fazla sıvıyı silin. Slaytı laboratuvar tezgahının üzerine düz bir şekilde yerleştirin ve hatta bir pipet kullanarak doku üzerine DAB solüsyonu uygulayın. Perls boyamasını geliştirmek için 10 dakika inkübe edin.
Fazla DAB solüsyonunu çıkarın ve PBS ile üç kez yıkayarak dokuları durulayın. Bölümü, kademeli alkol çözeltileri ve ksilen içinde her biri üç dakika boyunca sırayla kurutun. Bölümleri nötr bir sakız ve bir lamel ile örtün.
Ardından, çeker ocakta kurumaya bırakın. Mikroskobu açın. Işık kaynağının parlaklığını ayarlayın.
4X büyütme hedefi altında beyin bölümüne odaklanın. Mikroskop tablasını, özellikle hipokampus ve serebral korteks olmak üzere yüksek Perls / DAB boyama sinyallerine sahip alanlara odaklanmak için hareket ettirin. ve görüntü yakalayın.
Objektif görüntüyü 10 büyütmede açın ve ardından görüntü formatını 8 bit gri tonlamaya dönüştürün. Görüntünün gri değerleri OD değerlerine dönüştürüldü ve ardından Perls/DAB boyama pozitif alanlarını kaplamak için eşik fonksiyonu kullanıldı. Aşağıdaki kurulum seçeneklerini seçin ve en önemlisi, arka plan gürültüsünü dışlamak için eşik sınırını seçin.
Son olarak, istatistiksel analiz için sonuçlar elde etmek üzere ölçümleri seçin. Bir AD fare modelinde demir dağılımını ve birikimini araştırmak için, sagital beyin bölümlerinin Perls / DAB boyamasını gerçekleştirdik. Hipokampus ve kortekste, özellikle 5xFAD farelerinin hipokampusunun subikulumunda yüksek Perls / DAB sinyalleri gözlenirken, hem iki aylık hem de sekiz aylık vahşi tip farelerin beyinleri daha zayıf sinyal gösterdi.
40 artı büyütme altında, 5xFAD farelerdeki sinyal, önceki çalışmalarla tutarlı olarak A-beta plak benzeri yapılarda görülür. Bu sonuçlar, demir tespiti için histokimyasal bir teknik olarak Perls/DAB'ın etkinliğini göstermektedir. Ayrıca başarısız boyamanın iki örneğini de gösteriyoruz.
Aşırı örtücülük veya uygun olmayan dehidrasyon bu durumlara neden olacaktır. Perls / DAB boyama, geleneksel Perls boyamadan daha güçlü bir sinyal ve daha iyi arka plan kontrastı sağlayarak demir algılamayı daha hassas ve doğru hale getirir. Ek olarak, gevşek bağlı protein komplekslerindeki ferrik demiri tespit eder.
Hemoglobinde olduğu gibi güçlü bir şekilde bağlı olan demir reaksiyona girmez. Bu, kırmızı kan hücrelerinde ve hemoglobinde demirin neden olduğu istenmeyen sinyalleri büyük ölçüde azaltır. Genel olarak, Perls/DAB boyaması hayvan deneyleri ve medial özgüllük ve duyarlılık gerektiren patolojik araştırmalar için uygundur.
Araştırmacılara daha az zaman ve maliyet pahasına demir birikimini görselleştirmek ve ölçmek için bir yöntem sağlar.
