まず、安楽死させたラットを腹側を上にして解剖面に置きます。滅菌鉗子で皮膚層をつまみ、内臓の損傷を避けて表面レベルで切り込みを入れます。大きくて鋭利な解剖ハサミを使用して、腹部の中央に縦方向の表面レベルカットを行います。
次に、そのカットから、両側に1つずつ、2つの短い水平カットを作成します。鉗子を使用して、皮膚をはがして腹腔を露出させます。腹膜を切断して、腹腔内の内臓を完全に露出させ、腸にすぐにアクセスできるようにします。
はさみと鉗子を使用して、胃の位置を特定し、黄色がかったセグメントとして表示される約2〜3センチメートル離れた十二指腸を特定します。近位空腸は、トレイツの靭帯から約4〜5センチメートル遠位にあります。十二指腸と空腸の間の目印。
単離した腸の破片を10センチメートルのシャーレに入れます。腸間膜の所望の腸セグメントを、管腔内容物が取り除かれるまで10ミリリットルの氷冷PBSで洗い流します。ペーパータオルで、腸の部分を2センチメートルの長さに切ります。
次に、各腸片を縦方向に開いて、上皮を露出させます。ガラス顕微鏡スライドを使用して露出した管腔表面をこすり、絨毛を除去します。腸片を氷上のEDTA溶液に入れ、10RPMに設定されたチューブリボルバーで摂氏4度で30分間回転させます。
解剖顕微鏡で、チューブの内容物を10センチメートルのシャーレに注ぎます。さらに5ミリリットルの氷冷PBSを加えます。細かい鉗子を使用して、腸セグメントを保持し、激しく振って、PBSへの上皮放出を観察します。
当初、PBSには主に絨毛が含まれます。腸の断片を連続的に振とうし、絨毛を含むPBSを定期的に廃棄し、腸の断片に10ミリリットルの新鮮なPBSを加えます。フラグメントの振とうを続け、絨毛がPBSに放出されなくなるまでPBS洗浄ステップを繰り返します。
しかし、代わりに、PBSには主に地下室が含まれています。残りの腸の断片を廃棄し、ペトリ皿に残ったPBSを腸陰窩用に濃縮します。組織培養フードで、陰窩を含むPBSを回収し、70ミクロンの細胞ドレインでろ過します。
濾液を 250 x g で 5 分間遠心分離します。次に、上清を除去し、ペレットを5 mmの高度なDMEM plusに再懸濁します。250 x gで再び5分間遠心分離します。
そして、上清を取り除き、ペレットと一緒に50マイクロリットルの培地を残します。ペレットを残りの培地に再懸濁し、氷上で細胞外マトリックス抽出物またはEMEのアリコートに加えます。静かに上下にピペッティングして、気泡を作らないようにEME全体で陰窩を均等に吊り下げます。
50マイクロリットルのEMEドームを35ミリメートルの組織培養皿に入れます。摂氏37度、5%の二酸化炭素で20分間インキュベートします。インキュベーション後、Y27632とCHIR99021をそれぞれ10マイクロモルずつ含む2ミリリットルのラット腸管オルガノイド培地(RIOM)を加えます。
次に、ラット腸管オルガノイドを継代し、オルガノイドを含むプレートから培地を吸引し、1ミリリットルの解離試薬を添加してEMEドームからオルガノイドを遊離させます。断片化されたオルガノイドを含む解離試薬を15ミリリットルのコニカルチューブに移します。培養プレートを2ミリリットルの高度なDMEM plusで洗浄し、断片化したオルガノイドを含む15ミリリットルのコニカルチューブに加えます。
ガラス製の牧草地用ピペットを使用して、15〜20回静かに上下にピペット操作し、オルガノイドを断片化します。オルガノイドを 350 x g で 2 分間遠心分離し、チューブの底部から 50 マイクロリットルの溶液を EME に加えます。溶液を混合した後、50マイクロリットルのEMEドームを35ミリメートルの組織培養皿に播種し、5%二酸化炭素を含む摂氏37度で20分間インキュベートします。
インキュベーション後、Y27632とCHIR99021をそれぞれ10マイクロモルずつ含む2ミリリットルのRIOMを添加します。絨毛の破片と陰窩の代表的な画像が示されています。陰窩は絨毛に比べてサイズが小さいです。
メッキされた陰窩は、次の数日間で拡大し、4〜7日目までに芽を出し、分化し始めます。2日間の融解後、健康なオルガノイド培養物は、スフェロイドと出芽オルガノイドの両方の存在を示しました。継代後の同じオルガノイド株は、単一の陰窩様ドメインの存在を示しました。
