agrobacterium-mediated transformation of chlorella vulgaris and confirmation of gene integration via colony pcr (cpcr)

Integrazione genica stabile in Chlorella vulgaris utilizzando Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens, a gram-negative soil-borne bacterium, possesses a unique interkingdom gene transfer ability, earning it the title &#34;natural genetic engineer&#34;1. This bacterium can transfer DNA (T-DNA) from a tumor-inducing plasmid (Ti-Plasmid) into host cells through a Type IV secretion system, resulting in the integration and expression of the T-DNA within the host genome1,2,3,4. In the natural setting, this process leads to tumor formation in plants, commonly known as crown gall disease. However, Agrobacterium can also transfer T-DNA into various other organisms, including yeast, fungi, algae, sea urchin embryos, and even human cells under laboratory conditions5,6,7,8.
Exploiting this natural system, Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (AMT) enables the random integration of gene(s) of interest into a host cell&#39;s nuclear genome by modifying the T-DNA region of the Ti-plasmid. For this purpose, a widely used AMT plant expression vector is pCAMBIA13029. Researchers can employ simple cloning workflows in E. coli before transferring the desired vector into A. tumefaciens for subsequent transfer to the host of interest.
Green microalgae are eukaryotes that share many similarities with land plants but are highly recalcitrant to genetic modification. However, genetic transformation plays a crucial role in both fundamental and biotechnological research of microalgae. In several microalgae species, particularly Chlamydomonas reinhardtii, genetic transformation via AMT has successfully introduced transgenes such as human interleukin-2 (hIL-2), the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 receptor-binding domain (SARS-CoV-2 RBD), and two antimicrobial peptides (AMPs)10,11,12,13. Among these, Chlorella vulgaris, a less fastidious and fast-growing green algae species, holds significant potential for the sustainable production of carbohydrates, proteins, nutraceuticals, pigments, and other high-value compounds14. However, the lack of reliable tools for creating transgenic strains of C. vulgaris hampers its commercial progress. Since there have been only a limited number of published works utilizing AMT in C. vulgaris15, and given the considerable differences between plant and microalgae cultivation, optimizing the AMT protocol becomes essential.
In this study, researchers inserted green fluorescent protein (mGFP5) downstream of the Cauliflower Mosaic Virus (CamV) 35S promoter and added a histidine tag to use it as a reporter gene for protein expression. Transformants were selected using Hygromycin B, and after subculturing for over twenty generations, the transformation remained stable. The pCAMBIA1302 plasmid employed in this work can be readily adapted to contain any gene of interest. Furthermore, the method and materials presented can be adjusted for other green algae species with an active CamV35S promoter, as this promoter is used for Hygromycin selection.

Autore in primo piano: Protocollo di trasformazione ottimizzato per la Chlorella vulgaris utilizzando l'Agrobacterium tumefaciens 

Ingegneria genetica mediata da Agrobacterium tumefaciens di microalghe verdi, Chlorella vulgaris

The scope of the research focused on the development and optimization of a protocol for the transformation of chlorella vulgaris. We aimed to create a stable transgenic strains of chlorella vulgaris using agrobacterium tumefaciens and a specific plasmid, pCAMBIA1302, that allowed them to insert gene of interest and the potential for bio technological applications. Metabolic engineering and synthetic biology, microscopy and imaging, CRISPR-Cas9 gene editing, bioinformatics, computational modeling, remote sensing and satellite imaging, nanotechnology, bioprocessing, and downstream processing.This study introduces an optimized agrobacterium tumefaciens media transformation protocol for the microalgae chlorella vulgaris using a specific plasmid and marker. It lays groundwork for enhancing microalgae by technology, overcoming previous limitations in reliable transformation tools for C.vulgaris.

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Agrobacterium-Mediated Transformation of Chlorella vulgaris  and Confirmation of Gene Integration via Colony PCR (CPCR)  

Trasformazione mediata da agrobatteri di Chlorella vulgaris e conferma dell'integrazione genica tramite PCR di colonia (cPCR)

Iniziare pipettando 0,5 millilitri di una coltura in fase logaritmica di clorella vulgaris. Distribuire la coltura su una piastra Tris-Acetato-Fosfato o TAP Agar. Coltiva la coltura per cinque giorni a 25 gradi Celsius.Successivamente, inoculare 10 millilitri di brodo LB integrato con un anello pieno di coltura elettroporata di agrobacterium tumefaciens in un pallone shaker. Incubare il pallone a 28-30 gradi Celsius e 250 RPM per una notte. Il giorno successivo, inoculare un millilitro della coltura notturna in 50 millilitri di LB integrato. Incubare il pallone a 28-30 gradi Celsius e 250 RPM.Co-coltivare le colture algali e batteriche. Per prima cosa, trasferisci la coltura di agrobatteri in una provetta da 50 millilitri. Centrifugare la provetta a 4.000 g per 30 minuti a temperatura ambiente.Quindi, pipettare il surnatante per scartarlo e lavare le cellule due volte usando il mezzo di induzione. Successivamente, aggiungere 25 millilitri di terreno di induzione sulla piastra di coltura di Chlorella Vulgaris. Trasferire le cellule in una provetta da 50 millilitri, quindi centrifugare a 4.000 G per 15 minuti a temperatura ambiente.Dopo aver smaltito il surnatante, unire il pellet di cellule algali con 200 microlitri di sospensione batterica. Agitare la coltura combinata in un'incubatrice rotante a 21-25 gradi Celsius, ad una temperatura di 150 giri/min per un'ora. Distribuire 200 microlitri di coltura mista su piastre di terreno di induzione, integrate con 15 millimoli di glucosio e incubare le piastre al buio a 21-25 gradi Celsius per tre giorni.Dopo tre giorni, raccogliere le microalghe in un pallone utilizzando 10 millilitri di terreno TAP. Integrato con 20 milligrammi per litro di tetraciclina. Incubare il pallone al buio per due giorni, mantenendo una temperatura compresa tra 21 e 25 gradi Celsius.Piastra 500 microlitri di coltura su terreni selettivi integrati con 20 milligrammi per litro di tetraciclina. Incubare le piastre a 21-25 gradi Celsius al buio per due giorni, prima di spostarle in una camera illuminata. Selezionare le singole colonie dalla piastra di trasformazione e striarle sulle piastre di agar TAP.Per eseguire la PCR delle colonie, iniziare aggiungendo un piccolo volume di cellule algali trasformanti a 10 microlitri di acqua sterile. Far bollire la soluzione a 98 gradi Celsius per 15 minuti. Allo stesso modo, elaborare un altro modello PCR per la conferma dell'assenza di agrobatteri nel campione.Eseguire i campioni di PCR su un gel di agarosio di DNA con una scala, per verificare le dimensioni dei frammenti risultanti. Le colonie trasformate sono state in grado di crescere su piastre contenenti igromicina con cefotaxima. Le colonie selvatiche non crescevano sulle placche.Sono state ottenute colonie resistenti fino a 70 milligrammi per litro di cefotaxima. L'amplicone PCR di pCAMBIA1302 era assente nei campioni algali. Tuttavia, MGFP5G nell'amplicone è stato rilevato in tutti e tre i campioni di alghe.Le colture algali che sono state ripetutamente sottocolture di Cefotaxima hanno mostrato l'assenza della proteina di virulenza E2, indicativa dell'assenza di plasmidi. È stata osservata una differenza significativa nella crescita delle alghe dei trasformanti e dei ceppi wild type. Nonostante una crescita inferiore, il trasformante aveva livelli di fluorescenza più elevati quando normalizzato per la densità cellulare.

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Agrobacterium-Mediated Transformation of Chlorella vulgaris and Confirmation of Gene Integration via Colony PCR (cPCR)

Agrobacterium tumefaciens-Mediated Genetic Engineering of Green Microalgae, Chlorella vulgaris

Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (AMT) serves as a widely employed tool for manipulating plant genomes. However, A. tumefaciens exhibit ...

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Preparation of Electrocompetent Agrobacterium tumefaciens Culture for Microalgal Genetic Engineering

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Preparazione di colture elettrocompetenti di Agrobacterium tumefaciens per l'ingegneria genetica delle microalghe

Electroporation of Agrobacterium tumefaciens for Genetic Engineering of Microalgal Cells

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Elettroporazione di Agrobacterium tumefaciens per l'ingegneria genetica di cellule microalgali