Gli autori desiderano ringraziare il Prof. Paul Hooykaas per aver gentilmente fornito il vettore pCAMBIA1302 e l'Agrobacterium tumefaciens AGL1 dell'Istituto di Biologia di Leida, Università di Leiden, Paesi Bassi. Gli autori desiderano anche ringraziare Eva Colic per il suo aiuto nella crescita dei trasformanti fluorescenti. Questo lavoro è stato finanziato dal Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada e dal programma Mitacs Accelerate.

Tutti i terreni e le soluzioni devono essere sterilizzati in autoclave prima dell'uso, salvo diversa indicazione. Tutte le provette da centrifuga, i puntali delle pipette, ecc., devono essere sterili o sterilizzati in autoclave prima dell'uso. Per una facile consultazione, le ricette dei terreni utilizzati in questo protocollo sono elencate nella Tabella 1.
1. Preparazione di cellule elettrocompetenti di A. tumefaciens 
<ol><li>Inoculare Agrobacterium (AGL-1) in un matraccio sterile da 25 mL di terreno LB (integrato con rifampicina, 20 mg/L-1) da una scorta di glicerolo congelato e far crescere per una notte a 28-30 °C e 150 giri/min. NOTA: Il ceppo di Agrobacterium AGL-1 è (vedi Tabella dei materiali) resistente alla rifampicina, all'ampicillina, al cloramfenicolo e alla streptomicina e può essere ottenuto da diversi fornitori.</li>
	<li>Il giorno seguente, diluire la coltura di 1.00.000 volte aggiungendo 0,5 μL di coltura notturna a 50 mL di acqua ultrapura sterilizzata in autoclave e spargere 10 μL di questa coltura diluita su una piastra LB, quindi incubare a 28-30 °C per 1-3 giorni.</li>
	<li>Prelevare una colonia e iniziare una coltura notturna da 20 mL in LB con rifampicina a 28-30 °C.</li>
	<li>Il giorno successivo, inoculare 500 mL di terreno LB (senza antibiotico) in un matraccio con 9 mL di coltura notturna e far crescere a 28-30 °C fino a quando l'OD600 raggiunge 0,5.</li>
	<li>Dividere uniformemente la coltura in dieci provette da centrifuga da 50 ml e raffreddare su ghiaccio per 30 minuti. Preraffreddare la centrifuga a 4 °C.</li>
	<li>Centrifugare le provette a 4 °C e 4000 x g per 15 min. Successivamente, rimuovere quanto più surnatante possibile utilizzando una pipetta e risospendere il pellet in ciascuna provetta in 50 mL di acqua ghiacciata.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 4 °C e 4000 x g per 15 min. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 25 mL di acqua ghiacciata in ogni provetta.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 4 °C e 4000 x g per 15 min. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL di glicerolo ghiacciato al 10% (p/v) in ciascuna provetta.</li>
	<li>Unire tutte le provette in un'unica provetta da 50 mL e centrifugare le cellule a 4 °C e 4000 x g per 15 min. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 400 μL di glicerolo ghiacciato al 10% (p/v). La concentrazione cellulare dovrebbe essere di circa 1-3 x 1010 cellule/mL.</li>
	<li>Distribuire le cellule come aliquote da 50 μL in microprovette sterili preraffreddate. Congelare in azoto liquido e conservare in congelatore a -80 °C.</li>
</ol>2. Elettroporazione di A. tumefaciens
<ol><li>Aggiungere 50 μL di celle elettrocompetenti AGL-1 A. tumefaciens in una cuvetta preraffreddata da 0,1 mm e aggiungere 2 μL di pCAMBIA1302 o plasmide simile (conc 15 ng/μL) (vedere la tabella dei materiali).</li>
	<li>Elettroporare a 2400 V utilizzando un elettroporatore (200 Ω, estensore di capacità 250 μFD, capacità 25 μFD, decadimento esponenziale, vedi Tabella dei materiali). La costante di tempo dovrebbe essere >4,5 ms per un'elettroporazione di successo con decadimento esponenziale.</li>
	<li>Aggiungere immediatamente 1 mL di terreno LB alla cuvetta e pipettare delicatamente su e giù per mescolare. Trasferire 1 mL di cellule risospese in una microprovetta da 1,5 mL e incubarla a 28-30 °C per almeno 1 ora per recuperare.</li>
	<li>Placcare le cellule su LB agar contenente l'antibiotico appropriato (cioè 50 mg/L di kanamicina per pCAMBIA1302 per la selezione procariotica).</li>
	<li>Incubare a 28-30 °C per 2-3 giorni.</li>
	<li>Selezionare una colonia, coltivare per una notte in LB con la selezione appropriata (50 mg/L di kanamicina per pCAMBIA1302) e crioconservare il ceppo contenente plasmidi utilizzando glicerolo al 50% a -80 °C per un uso futuro.</li>
</ol>3. AMT di C. vulgaris
NOTA: Preparare le colture di C. vulgaris (UTEX 395, vedi Tabella dei materiali) e A. tumefaciens in parallelo per la co-coltivazione. Le colture di C. vulgaridevono essere iniziate 3 giorni prima di preparare le colture di A. tumefaciens. Il protocollo è stato modificato sulla base di quello pubblicato da Kumar et al.7.
<ol><li>Preparare la coltura di C. vulgaris <ol><li>C. vulgaris è tradizionalmente conservato in pendenza o mantenuto in colture in fase logaritmica in condizioni di illuminazione. Da una coltura in fase logaritmica a OD600 = 1,0, distribuire 0,5 mL su piastre di agar tris-acetato-fosfato (TAP, vedere tabella 1) ( 1,2% p/v agar A) e far crescere per 5 giorni a 25 °C con illuminazione (50 μE/m2s). In questo modo si otterranno circa 5 x 106 celle.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparare la coltura di A. tumefaciens <ol><li>Coltivare il ceppo A. tumefaciens AGL-1 pCAMBIA1302 in un pallone agitatore inoculando 10 mL di terreno LB integrato con 15 mM di glucosio, 20 mg/L di rifampicina e 50 mg/L di kanamicina (vedi Tabella dei materiali) utilizzando la scorta di glicerolo. Incubare a 28-30 °C e 250 rpm per una notte.</li>
		<li>Inoculare 1 mL di coltura notturna in 50 mL di LB con 15 mM di glucosio, 20 mg/L di rifampicina e 50 mg/L di kanamicina e incubare a 28-30 °C e 250 rpm fino a quando l'OD600 raggiunge 1,0.</li>
	</ol></li>
	<li>Cocoltivare C. vulgaris e A. tumefaciens
	<ol><li>Per preparare la coltura di A. tumefaciens per la co-coltivazione, trasferire la coltura coltivata in una provetta da 50 ml e centrifugare a 4000 x g per 30 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante utilizzando una pipetta e lavare le cellule due volte con il mezzo di induzione. NOTA: Il terreno di induzione utilizzato è un terreno TAP regolato a pH 5,5 e integrato con metalli in tracce e vitamine F/2 con acetosiringone da 200 μM (AS, vedere la tabella dei materiali). Risospendere le cellule in un terreno di induzione in modo tale che OD600 = 0,5.</li>
		<li>Per preparare la coltura di C. vulgaris per la co-coltivazione, aggiungere 25 mL di terreno di induzione alla piastra di C. vulgaris contenente ~ 5 x 106 cellule. Trasferire in una provetta da 50 ml. Centrifugare le cellule a 4000 x g per 15 minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante.</li>
		<li>Miscelare il pellet di cellule algali con 200 μL di sospensione batterica (OD600: 0,5) e incubarli in un agitatore rotante a 21-25 °C a 150 giri/min per 1 ora.</li>
		<li>Distribuire la coltura mista (200 μL) su piastre di terreno di induzione integrate con glucosio 15 mM e incubare a 21-25 °C al buio per 3 giorni.</li>
		<li>Dopo 3 giorni, utilizzare 10 mL di terreno TAP integrato con 400 mg/L di cefotaxima o 20 mg/L di tetraciclina (vedi Tabella dei Materiali) per raccogliere le microalghe e incubare al buio a 21-25 °C per 2 giorni per eliminare A. tumefaciens dalla coltura.</li>
		<li>Piastra 500 μL della coltura su terreni selettivi, ad es. terreni TAP integrati con 20-70 mg/L di Igromicina B (quando si utilizza pCAMBIA1302) e 400 mg/L-1 cefotaxima o 20 mg/L di tetraciclina. Incubare a 21-25 °C al buio per 2 giorni prima di metterli in una camera illuminata. NOTA: Le colonie resistenti appariranno 5-7 giorni dopo l'esposizione alla luce.</li>
		<li>Prelevare singole colonie dalla piastra di trasformazione e ri-striarle su piastre di agar TAP integrate con 400 mg/L di cefotaxima o 20 mg/L di tetraciclina e 20-70 mg/L di igromicina B.</li>
	</ol></li>
</ol>4. PCR di colonia (cPCR) per confermare l'integrazione genica nei trasformanti di C. vulgaris 
<ol><li>Estrarre il DNA genomico da un trasformante di C. vulgaris dopo aver subcolturato almeno due volte da una singola colonia utilizzando un kit di estrazione del DNA genomico vegetale (vedi Tabella dei materiali). Usando questo come modello per la PCR, progetta primer per la regione mgfp5 del T-DNA (mgfp5-Fwd: 5' CCCATCTCATAAATAACGTC 3' e M13-Rev: 5' CAGGAAACAGCTATGAC 3').<ol><li>Utilizzando un kit di master mix di DNA polimerasi ad alta fedeltà Q5 (vedere la tabella dei materiali), eseguire la reazione a catena della polimerasi (PCR) per convalidare l'integrazione del transgene. NOTA: Per il presente studio sono state utilizzate le seguenti condizioni: 98 °C per 3 min; 35 cicli (98 °C per 10 s, 57 °C per 30 s, 72 °C per 1 min); 72 °C per 5min. Utilizzare pCAMBIA1302 come controllo positivo e DNA genomico di C. vulgaris wild-type come controllo negativo.</li>
	</ol></li>
	<li>Per confermare che non è presente pCAMBIA1302 nel campione a causa della contaminazione residua da A. tumefaciens, utilizzare la PCR di colonia. Aggiungere una piccola quantità di cellule trasformanti a 10 μL di acqua sterile e far bollire a 98 °C per 15 minuti. Usalo come modello per la PCR.<ol><li>Progettare primer per una regione al di fuori del T-DNA su pCAMBIA1302 (B1-Fwd: 5'AGTAAAGGAGAAGAACTTTTC 3' e B1-Rev: 5'CCTGATGCGGTATTTTCTC 3'). NOTA: Per il presente studio sono state utilizzate le seguenti condizioni: 94 °C per 3 minuti; 30 cicli (94 °C per 30 s, 48 °C per 30 s, 68 °C per 5 min); 68 °C per 7 min. Utilizzare una colonia bollita di A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) come controllo positivo e una colonia bollita di C. vulgaris selvatico come controllo negativo.</li>
	</ol></li>
	<li>Per confermare che non vi sia contaminazione da A. tumerfaciens presente nel campione, utilizzare la PCR di colonia. Aggiungere una piccola quantità di cellule trasformanti a 10 μL di acqua sterile e far bollire a 98 °C per 15 minuti. Usalo come modello per la PCR.<ol><li>Progettare primer per il gene virE2 contenuto nel plasmide di virulenza AGL-1 (virE2-Fwd: 5' AGGGAGCCCTACCCG 3' e virE2-Rev: 5' GAACCAGCCTGGAGTTCG 3'). NOTA: Per il presente studio sono state utilizzate le seguenti condizioni: 94 °C per 3 minuti; 30 cicli (94 °C per 30 s, 53 °C per 30 s, 68 °C per 3 min); 68 °C per 7 min. Utilizzare una colonia bollita di A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) come controllo positivo e una colonia bollita di C. vulgaris selvatico come controllo negativo.</li>
	</ol></li>
	<li>Eseguire campioni di PCR su un gel di agarosio di DNA insieme a una scala (scala di DNA da 1 Kbp, vedere la tabella dei materiali) per confermare le dimensioni dei frammenti risultanti16.</li>
</ol>5. Misurazione della fluorescenza dei trasformanti
<ol><li>Inoculare ciascun trasformante da una coltura di mantenimento in fase logaritmica o da un agar TAP inclinato in 50 mL di TAP integrato con 200 mg/L-1 di cefotaxima e 25 mg/L-1 di igromicina B in modo tale che il OD iniziale600 = 0,1. Inoculare una coltura con C. vulgaris wild-type e solo 200 mg/L-1 di cefotaxima come controllo negativo. Incubare a 25 °C a 150 giri/min con 150 μmol/m2s di luce fotosinteticamente attiva (vedi Tabella dei materiali).</li>
	<li>Ogni 24 ore, prelevare un campione di 300 μL e misurare l'assorbanza e la fluorescenza (eccitazione 488 nm, emissione 526 nm) in un lettore di piastre a 96 pozzetti o in uno spettrometro UV/Vis e fluorimetro (vedere la tabella dei materiali). Utilizzare una piastra nera con fondo trasparente per misurazioni simultanee.</li>
</ol>6. Estrazione di proteine grezze, purificazione di proteine ed elettroforesi SDS-PAGE
<ol><li>Inoculare il trasformante (#50) da una coltura di mantenimento in fase logaritmica in 300 mL di TAP integrato con 200 mg/L-1 di cefotaxima e 25 mg/L-1 di igromicina B per raggiungere l'OD680 = 0,1. Inoculare una coltura con C. vulgaris wild-type e solo 200 mg/L-1 di cefotaxima come controllo negativo. Incubare a 25 °C a 150 rpm con 150 μmol/m2s di luce fotosinteticamente attiva.</li>
	<li>Estrarre il campione di proteina grezza dal trasformante (#50) e dai ceppi wild-type utilizzando un tampone di lisi da 5 mL (vedere la Tabella 1), seguito da sonicazione per 4 minuti.</li>
	<li>Purificare il campione di proteina grezza con una resina Ni-NTA attraverso colonne di polipropilene da 5 mL (vedi Tabella dei materiali).</li>
	<li>Liofilizzare i campioni proteici purificati da 15 mL e risospenderli in un tampone di lisi da 1 mL per l'analisi SDS-PAGE17.</li>
</ol>

Integrazione genica stabile in Chlorella vulgaris utilizzando Agrobacterium tumefaciens

<ol>
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Non sono stati dichiarati conflitti di interesse.

L'efficienza della trasformazione è associata a diversi parametri. La scelta dei ceppi di A. tumefaciens utilizzati per l'AMT è fondamentale. AGL-1 è uno dei ceppi più invasivi scoperti e, per questo motivo, è stato utilizzato abitualmente nell'AMT vegetale. Anche l'integrazione del mezzo di induzione con glucosio (15-20 mM) è importante per l'efficienza dell'AMT. Considerando che C. vulgaris può crescere sia in condizioni fototrofiche che eterotrofe, il glucosio o altre fonti di carbonio vengono...

L'Agrobacterium tumefaciens, un batterio gram-negativo trasmesso dal suolo, possiede una capacità unica di trasferimento genico tra regni, che gli è valsa il titolo di "ingegnere genetico naturale"1. Questo batterio può trasferire il DNA (T-DNA) da un plasmide che induce il tumore (Ti-Plasmide) nelle cellule ospiti attraverso un sistema di secrezione di tipo IV, con conseguente integrazione ed espressione del T-DNA all'interno del genoma ospite 1,2,3,4. Nell'ambiente naturale, questo processo porta alla formazione di tumori nelle piante, comunemente noti come malattia della galla della corona. Tuttavia, l'Agrobacterium può anche trasferire il T-DNA in vari altri organismi, tra cui lieviti, funghi, alghe, embrioni di ricci di mare e persino cellule umane in condizioni di laboratorio 5,6,7,8.
Sfruttando questo sistema naturale, la trasformazione mediata da Agrobacterium tumefaciens (AMT) consente l'integrazione casuale di geni di interesse nel genoma nucleare di una cellula ospite modificando la regione T-DNA del plasmide Ti. A questo scopo, un vettore di espressione delle piante AMT ampiamente utilizzato è pCAMBIA13029. I ricercatori possono utilizzare semplici flussi di lavoro di clonazione in E. coli prima di trasferire il vettore desiderato in A. tumefaciens per il successivo trasferimento all'ospite di interesse.
Le microalghe verdi sono eucarioti che condividono molte somiglianze con le piante terrestri, ma sono altamente recalcitranti alla modificazione genetica. Tuttavia, la trasformazione genetica svolge un ruolo cruciale sia nella ricerca di base che in quella biotecnologica delle microalghe. In diverse specie di microalghe, in particolare Chlamydomonas reinhardtii, la trasformazione genetica tramite AMT ha introdotto con successo transgeni come l'interleuchina-2 umana (hIL-2), il dominio legante il recettore 2 del coronavirus 2 della sindrome respiratoria acuta grave (SARS-CoV-2 RBD) e due peptidi antimicrobici (AMP)10,11,12,13. Tra queste, la Chlorella vulgaris, una specie di alga verde meno esigente e a crescita rapida, ha un potenziale significativo per la produzione sostenibile di carboidrati, proteine, nutraceutici, pigmenti e altri composti di alto valore14. Tuttavia, la mancanza di strumenti affidabili per la creazione di ceppi transgenici di C. vulgaris ostacola il suo progresso commerciale. Poiché è stato pubblicato solo un numero limitato di lavori che utilizzano AMT in C. vulgaris15, e date le notevoli differenze tra la coltivazione di piante e microalghe, l'ottimizzazione del protocollo AMT diventa essenziale.
In questo studio, i ricercatori hanno inserito la proteina fluorescente verde (mGFP5) a valle del promotore 35S del virus del mosaico del cavolfiore (CamV) e hanno aggiunto un tag di istidina per utilizzarlo come gene reporter per l'espressione proteica. I trasformanti sono stati selezionati utilizzando l'igromicina B e, dopo la subcoltura per oltre venti generazioni, la trasformazione è rimasta stabile. Il plasmide pCAMBIA1302 impiegato in questo lavoro può essere facilmente adattato per contenere qualsiasi gene di interesse. Inoltre, il metodo e i materiali presentati possono essere adattati per altre specie di alghe verdi con un promotore attivo CamV35S, poiché questo promotore viene utilizzato per la selezione dell'igromicina.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1 Kb Plus DNA ladder</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>DM015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D26665G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agrobacterium tumefaciens</td>
			<td>Gold Biotechnologies</td>
			<td>Strain: AGL-1; Gift from Prof. Paul Hooykaas</td>
			<td>Genotype: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>89151-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9224-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefotaxime</td>
			<td>AK Scientific</td>
			<td>J90010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorella vulgaris</td>
			<td>University of Texas at Austin Culture Collection of Algae</td>
			<td>Strain: UTEX 395</td>
			<td>Wildtype strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C8661-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4&#183;5H2O</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CX2185-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3&#183;6H2O</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9234-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Xcell Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652662</td>
			<td>Main unit equipped with PC module.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Plant Genome Purification Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K0791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CABDH3093-2.2P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>GB0232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H-3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ6068103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9266-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Gold Biotechnologies</td>
			<td>K-250-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9268-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2&#183;4H2O</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>BAKR2540-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2CO3</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7971-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2EDTA&#183;2H2O</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>8993-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2MoO4&#183;2H2O</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>BAKR3764-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7257-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4 H2O</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CA80058-650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaNO3&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH4574-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBExpress Ni Resin</td>
			<td>NewEngland BioLabs</td>
			<td>NEB #S1427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9208-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAMBIA1302</td>
			<td>Leiden University</td>
			<td>Gift from Prof. Paul Hooykaas</td>
			<td>pBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S promoter/mgpf5-6xhis/NOS terminator)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Columns (5 mL)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>34964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, 1 mL</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>R3501-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SunBlaster LED Strip Light 48 Inch&#160;</td>
			<td>SunBlaster</td>
			<td>210000000906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy 4 Microplate UV/Vis spectrometer&#160;</td>
			<td>BioTEK</td>
			<td>S4MLFPTA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Thermo Scientific Chemicals</td>
			<td>CAAAJ61714-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 12%</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>TCI America</td>
			<td>T0181-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>TG217(G211)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12 (cyanocobalamin)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>89151-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>G0961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4&#183;7H2O</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>4382-01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agrobacterium tumefaciens-mediated genetic engineering of green microalgae, chlorella vulgaris

La trasformazione mediata dall'Agrobacterium tumefaciens (AMT) funge da strumento ampiamente utilizzato per manipolare i genomi delle piante. Tuttavia, A. tumefaciens mostra la capacità di trasferimento genico a una vasta gamma di specie. Numerose specie di microalghe non dispongono di metodi consolidati per integrare in modo affidabile i geni di interesse nel loro genoma nucleare. Per sfruttare i potenziali benefici della biotecnologia delle microalghe, sono fondamentali strumenti di manipolazione del genoma semplici ed efficienti. In questo articolo, viene presentato un protocollo AMT ottimizzato per la specie di microalghe industriali Chlorella vulgaris, utilizzando la proteina fluorescente verde reporter (mGFP5) e il marcatore di resistenza agli antibiotici per l'igromicina B. I mutanti sono selezionati attraverso la placcatura su terreni Tris-Acetato-Fosfato (TAP) contenenti igromicina B e cefotaxima. L'espressione di mGFP5 è quantificata tramite fluorescenza dopo oltre dieci generazioni di subcoltura, indicando la trasformazione stabile della cassetta T-DNA. Questo protocollo consente la generazione affidabile di più colonie transgeniche di C. vulgaris in meno di due settimane, impiegando il vettore di espressione vegetale pCAMBIA1302 disponibile in commercio.

Agrobacterium tumefaciens, a gram-negative soil-borne bacterium, possesses a unique interkingdom gene transfer ability, earning it the title &#34;natural genetic engineer&#34;1. This bacterium can transfer DNA (T-DNA) from a tumor-inducing plasmid (Ti-Plasmid) into host cells through a Type IV secretion system, resulting in the integration and expression of the T-DNA within the host genome1,2,3,4. In the natural setting, this process leads to tumor formation in plants, commonly known as crown gall disease. However, Agrobacterium can also transfer T-DNA into various other organisms, including yeast, fungi, algae, sea urchin embryos, and even human cells under laboratory conditions5,6,7,8.
Exploiting this natural system, Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (AMT) enables the random integration of gene(s) of interest into a host cell&#39;s nuclear genome by modifying the T-DNA region of the Ti-plasmid. For this purpose, a widely used AMT plant expression vector is pCAMBIA13029. Researchers can employ simple cloning workflows in E. coli before transferring the desired vector into A. tumefaciens for subsequent transfer to the host of interest.
Green microalgae are eukaryotes that share many similarities with land plants but are highly recalcitrant to genetic modification. However, genetic transformation plays a crucial role in both fundamental and biotechnological research of microalgae. In several microalgae species, particularly Chlamydomonas reinhardtii, genetic transformation via AMT has successfully introduced transgenes such as human interleukin-2 (hIL-2), the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 receptor-binding domain (SARS-CoV-2 RBD), and two antimicrobial peptides (AMPs)10,11,12,13. Among these, Chlorella vulgaris, a less fastidious and fast-growing green algae species, holds significant potential for the sustainable production of carbohydrates, proteins, nutraceuticals, pigments, and other high-value compounds14. However, the lack of reliable tools for creating transgenic strains of C. vulgaris hampers its commercial progress. Since there have been only a limited number of published works utilizing AMT in C. vulgaris15, and given the considerable differences between plant and microalgae cultivation, optimizing the AMT protocol becomes essential.
In this study, researchers inserted green fluorescent protein (mGFP5) downstream of the Cauliflower Mosaic Virus (CamV) 35S promoter and added a histidine tag to use it as a reporter gene for protein expression. Transformants were selected using Hygromycin B, and after subculturing for over twenty generations, the transformation remained stable. The pCAMBIA1302 plasmid employed in this work can be readily adapted to contain any gene of interest. Furthermore, the method and materials presented can be adjusted for other green algae species with an active CamV35S promoter, as this promoter is used for Hygromycin selection.

Autore in primo piano: Protocollo di trasformazione ottimizzato per la Chlorella vulgaris utilizzando l'Agrobacterium tumefaciens 

Ingegneria genetica mediata da Agrobacterium tumefaciens di microalghe verdi, Chlorella vulgaris

The scope of the research focused on the development and optimization of a protocol for the transformation of chlorella vulgaris. We aimed to create a stable transgenic strains of chlorella vulgaris using agrobacterium tumefaciens and a specific plasmid, pCAMBIA1302, that allowed them to insert gene of interest and the potential for bio technological applications. Metabolic engineering and synthetic biology, microscopy and imaging, CRISPR-Cas9 gene editing, bioinformatics, computational modeling, remote sensing and satellite imaging, nanotechnology, bioprocessing, and downstream processing.This study introduces an optimized agrobacterium tumefaciens media transformation protocol for the microalgae chlorella vulgaris using a specific plasmid and marker. It lays groundwork for enhancing microalgae by technology, overcoming previous limitations in reliable transformation tools for C.vulgaris.

Per dimostrare il successo della trasformazione utilizzando il metodo di cui sopra, C. vulgaris è stato co-coltivato con AGL-1 contenente il plasmide pCAMBIA1302 o senza il plasmide (wild-type e placcato su agar TAP integrato con igromicina B e cefotaxima (Figura 1A). La placca più a sinistra mostra le colonie trasformate in grado di crescere sulle piastre di igromicina B/cefotaxima, mentre la placca centrale mostra che l'AGL-1 wild-type non può crescere sulle piastre di igromici...

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Questo protocollo delinea l'utilizzo della trasformazione mediata da Agrobacterium tumefaciens (AMT) per l'integrazione di geni di interesse nel genoma nucleare della microalga verde Chlorella vulgaris, portando alla produzione di trasformanti stabili.

Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (AMT) serves as a widely employed tool for manipulating plant genomes. However, A. tumefaciens exhibit ...

Lo scopo della ricerca si è concentrato sullo sviluppo e l'ottimizzazione di un protocollo per la trasformazione della clorella vulgaris. Il nostro obiettivo era quello di creare un ceppo transgenico stabile di chlorella vulgaris utilizzando agrobacterium tumefaciens e un plasmide specifico, pCAMBIA1302, che permettesse loro di inserire il gene di interesse e il potenziale per applicazioni biotecnologiche. Ingegneria metabolica e biologia sintetica, microscopia e imaging, editing genetico CRISPR-Cas9, bioinformatica, modellazione computazionale, telerilevamento e imaging satellitare, nanotecnologie, bioprocessi e processi a valle.Questo studio introduce un protocollo ottimizzato di trasformazione dell'agrobacterium tumefaciens per la microalga chlorella vulgaris utilizzando un plasmide e un marcatore specifici. Getta le basi per migliorare le microalghe attraverso la tecnologia, superando i precedenti limiti negli strumenti di trasformazione affidabili per C. vulgaris.

agrobacterium-tumefaciens-mediated-genetic-engineering-green

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Agrobacterium tumefaciens-Mediated Genetic Engineering of Green Microalgae, Chlorella vulgaris

2.2K Views.  University of Waterloo. Lo scopo della ricerca si è concentrato sullo sviluppo e l'ottimizzazione di un protocollo per la trasformazione della clorella vulgaris. Il nostro obiettivo era quello di creare un ceppo transgenico stabile di chlorella vulgaris utilizzando agrobacterium tumefaciens e un plasmide specifico, pCAMBIA1302, che permettesse loro di inserire il gene di interesse e il potenziale per applicazioni biotecnologiche. Ingegneria metabolica e biologia sintetica, microscopia e imaging, editing genetico CR...

Video: Autore in primo piano: Protocollo di trasformazione ottimizzato per la Chlorella vulgaris utilizzando l'Agrobacterium tumefaciens 

Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (AMT) serves as a widely employed tool for manipulating plant genomes. However, A. tumefaciens exhibit the capacity for gene transfer to a diverse array of species. Numerous microalgae species lack well-established methods for reliably integrating genes of interest into their nuclear genome. To harness the potential benefits of microalgal biotechnology, simple and efficient genome manipulation tools are crucial. Herein, an optimized AMT protocol is presented for the industrial microalgae species Chlorella vulgaris, utilizing the reporter green fluorescent protein (mGFP5) and the antibiotic resistance marker for Hygromycin B. Mutants are selected through plating on Tris-Acetate-Phosphate (TAP) media containing Hygromycin B and cefotaxime. Expression of mGFP5 is quantified via fluorescence after over ten generations of subculturing, indicating the stable transformation of the T-DNA cassette. This protocol allows for the reliable generation of multiple transgenic C. vulgaris colonies in under two weeks, employing the commercially available pCAMBIA1302 plant expression vector.

This protocol outlines the utilization of Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (AMT) for integrating gene(s) of interest into the nuclear genome of the green microalgae Chlorella vulgaris, leading to the production of stable transformants.

Ricerca

Bioingegneria

Preparation of Electrocompetent Agrobacterium tumefaciens Culture for Microalgal Genetic Engineering

Preparation of Electrocompetent  Agrobacterium tumefaciens  Culture for Microalgal Genetic Engineering  

Start by diluting 0.5 microliters of the overnight cultures of Agrobacterium tumefaciens culture with 50 milliliters of autoclaved ultrapure water. Spread 10 microliters of this diluted culture on a lysogeny broth or LB plate. Incubate the plate at 28 to 30 degrees Celsius for one to three days.Now, inoculate a single colony in 20 milliliters of LB media supplemented with rifampicin. Incubate the culture overnight at 28 to 30 degrees Celsius. The next day, inoculate 500 milliliters of plain LB media in a shaker flask with nine milliliters of overnight culture.Place the cultures on a shaker at 28 to 30 degrees Celsius. Following incubation and dividing the cultures into tubes, centrifuge the chilled tubes at four degrees Celsius and 4, 000 G for 15 minutes. Using a pipette, remove the supernatant and resuspend each pellet in 50 milliliters of ice cold water.After centrifuging and discarding the supernatant, resuspend the pellet in 25 milliliters of ice cold water in each tube. Centrifuge as before, then resuspend the pellet in one milliliter of ice cold 10%glycerol. Now, combine the contents of all the tubes into a single 50-milliliter tube before centrifuging.Finally, after discarding the supernatant, resuspend the pellet in 400 microliters of ice cold glycerol.

Preparazione di colture elettrocompetenti di Agrobacterium tumefaciens per l'ingegneria genetica delle microalghe

Electroporation of Agrobacterium tumefaciens for Genetic Engineering of Microalgal Cells

Electroporation of  Agrobacterium tumefaciens  for Genetic Engineering of Microalgal Cells  

Begin by adding 50 microliters of electrocompetent Agrobacterium tumefaciens cells into a pre-chilled 0.1-millimeter Q-vet. Add two microliters of pCAMBIA1302 to the Q-vet. now use an electroporator at 2, 400 volts to eelectroporate the cells.Immediately add one milliliter of LB media to the Q-vet and pipette the solution up and down to mix gently. Next, transfer the resuspended cells into a 1.5-milliliter microtube. Then incubate it at 24 to 30 degrees Celsius for a minimum of one hour to recover.Now plate the cells on antibiotic supplemented LB auger. Incubate the plates at 28 to 30 degrees Celsius for two to three days. Finally, inoculate a single colony in LB broth.Allow the culture to grow overnight. Then cryopreserve the plasmid-containing strain with a 50%glycerol solution at 80 degrees Celsius for future use.

Elettroporazione di Agrobacterium tumefaciens per l'ingegneria genetica di cellule microalgali

Agrobacterium-Mediated Transformation of Chlorella vulgaris and Confirmation of Gene Integration via Colony PCR (cPCR)

Agrobacterium-Mediated Transformation of Chlorella vulgaris  and Confirmation of Gene Integration via Colony PCR (CPCR)  

Begin by pipetting out 0.5 milliliters of a log phase culture of chlorella vulgaris. Spread the culture on at Tris-Acetate-Phosphate or TAP Agar plate. Grow the culture for five days at 25 degrees Celsius.Next, inoculate 10 milliliters of supplemented LB broth with a loop full of electroporated agrobacterium tumefaciens culture in a shaker flask. Incubate the flask at 28 to 30 degrees Celsius and 250 RPM overnight. The next day, inoculate one milliliter of the overnight culture into 50 milliliters of supplemented LB.Incubate the flask at 28 to 30 degrees Celsius and 250 RPM.To co-cultivate the algal and bacterial cultures. First, transfer the agrobacterium culture into a 50 milliliter tube. Centrifuge the tube at 4, 000 G for 30 minutes at room temperature.Then, pipette out the supernatant to discard it and wash the cells twice using the induction medium. Next, add 25 milliliters of induction media onto the Chlorella Vulgaris culture plate. Transfer the cells into a 50 milliliter tube, then centrifuge at 4, 000 G for 15 minutes at room temperature.After disposing of the supernatant, combine the algal cell pellet with 200 microliters of the bacterial suspension. Shake the combined culture in a rotary incubator at 21 to 25 degrees Celsius, said at 150 RPM for one hour. Spread 200 microliters of the mixed culture onto induction medium plates, supplemented with 15 millimoles of glucose and incubate the plates in the dark at 21 to 25 degrees Celsius for three days.After three days, collect the microalgae into a flask using 10 milliliters of TAP media. Supplemented with 20 milligrams per liter of tetracycline. Incubate the flask in the dark for two days, maintaining a temperature between 21 to 25 degrees Celsius.Plate 500 microliters of the culture onto selective media supplemented with 20 milligrams per liter of tetracycline. Incubate the plates at 21 to 25 degrees Celsius in darkness for two days, before shifting them into an illuminated chamber. Select single colonies from the transformation plate and streak them onto TAP agar plates.To perform colony PCR, start by adding a small volume of the transformant algal cells to 10 microliters of sterile water. Boil the solution at 98 degrees Celsius for 15 minutes. Similarly process another PCR template for the confirmation of agrobacterium absence in the sample.Run the PCR samples on a DNA agarose gel with a ladder, to verify the size of the resulting fragments. Transformed colonies were able to grow on plates containing hygromycin with cefotaxime. The wild type colonies did not grow on the plates.Colonies resistant up to 70 milligrams per liter of cefotaxime were obtained. Colony PCR Amplicon of pCAMBIA1302 was absent in the algal samples. However MGFP5G in amplicon was detected in all three algal samples.Algal cultures that were repeatedly subcultures of Cefotaxime showed the absence of the virulence protein E2, indicative of plasmid absence. A significant difference in algal growth of the transformants and wild type strains were observed. Despite lower growth, the transformant had higher fluorescence levels when normalized for cell density.