Для начала отсасывайте среду из лунок, где инкапсулированные гидрогелем клетки культивируются в 24-луночном планшете. Промойте гидрогели, пипетируя 500 микролитров PBS непосредственно на каждую лунку, содержащую гидрогели, а затем осторожно отсасывайте PBS. С помощью пипетки объемом 1000 микролитров добавьте 500 микролитров фиксирующего раствора на лунку, чтобы зафиксировать сфероиды в 24-луночном планшете.
Дайте фиксатору пропитаться гелями в течение 30 минут при комнатной температуре, прежде чем дозировать фиксирующий раствор и выбросить его в специальный контейнер для отходов. Затем промойте гидрогели PBS три раза, как было показано ранее. Если гидрогели не используются сразу, храните гидрогели в 500 микролитрах PBS на лунку при температуре четыре градуса Цельсия в течение одной недели.
Для окрашивания в инкапсулированных гидрогелем клетках сначала готовят соответствующим образом разведенные первичные антитела к нестину и SOX2. После отсасывания PBS из лунок добавьте по 50 микролитров разведенных антител в каждую лунку. Инкубируйте клетки с антителами в течение 24 часов, чтобы полностью окрасить их.
Затем с помощью пипетки объемом 1 000 микролитров удалите раствор для окрашивания и утилизируйте отходы соответствующим образом. После трех полосканий гидрогелей храните их в PBS при температуре четыре градуса Цельсия в течение двух недель перед визуализацией или сразу же сделайте снимок. Чтобы очистить окрашенный сфероид для повышения прозрачности изображения, сначала отсасывайте PBS из каждой лунки.
Затем последовательно обрабатывайте сфероиды 500 микролитрами 20%40% и 80%-ным формамидом на лунку в течение 90 минут каждая. Наконец, инкубируйте гидрогели в 100% формамиде в течение 24 часов перед визуализацией. Сфероиды были визуализированы на различной глубине z-стека, что позволило оценить жизнеспособность клеток в каждом месте внутри z-стека.
Максимальная проекция с использованием сфероида представляла собой наивысшую точку интенсивности света в каждом месте, упрощенную до одного изображения. Репрезентативные изображения окрашенных сфероидов показали, что самообновляющийся транскрипционный фактор, SOX2, был колокализован с DAPI в ядре. Напротив, маркер стволовых клеток нестин присутствовал во всех клетках.
Не было никакой разницы между свободно плавающим сфероидом без геля и инкапсулированными сфероидами, возможно, из-за инертности используемого геля PEG. Репрезентативные изображения оптических срезов на глубине около 90 микрон в очищенных и неочищенных сфероидах показали, что при выполнении очистки ядро сфероида может быть изображено примерно на 30 микрон глубже по сравнению с неочищенным сфероидом.
