Name: ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development
Uploaded: 2013-04-03T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development at JoVE.com

وأيد هذا العمل من المنح NINDS (NS066071) وNIAAA و. (P50AA017823) لECO. الكتاب أشكر الدكتور روبرت كوين والموظفين في وزارة الثروة الحيوانية مختبر لرعاية الحيوانات. نشكر جودسون بلمونت حصول على الدعم الفني، نيكول Belletier للمساعدة على أنه باحث الصيفية الجامعية (SURF). نشكر أيضا الدكتور ديفيد كاميرون للتعليق عليها وتعديلات على إصدار سابق من المخطوطة.

1. Electroporations الرحم السابق مع الأخضر التعبير بروتين فلوري البلازميد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم إعداد البلازميد الحمض النووي مع حلول حقن CAG-DNA 27 EGFP المخفف لتركيز العمل النهائية قدره 0.33 ملغ / مل في DDH 2 O. وتستخدم QIAGEN إندو خالية من م...

وقد قمنا بتحسين وتقييم نموذج تجريبي - إإكسبلنتس نصف الكرة كله - لدراسة التنمية القشرية في وقت مبكر (E13 E15-). أثبت نموذجا مفيدا لتحليل الهجرة وتمايز الخلايا العصبية من نسب مثير تشكل طبقة 6 من قشرة الدماغ 25،37. مزايا مبدأ النظام هي 1) النمو عضوي النمط لمدة 2 DIV، 2) إعداد ب?...

والثدييات أشكال قشرة الدماغ من خلال الهجرة متضافرة، والانتشار والتمايز للخلايا العصبية ولدت على التوالي. ولادة كل الخلايا العصبية في منطقة البطين (VZ) ويهاجر من VZ إلى منطقة وسيطة (IZ)، وتشكيل لوحة القشرية (CP) 1. لأنها تمر من خلال المجالات المختلفة القشرية، الخلايا العصبية المهاجرة عرض وسائط متعددة من الهجرة 2،3 التي تعتمد على البيئة خارج الخلية والعناصر الخلوية الأخرى (مثل الخلايا الدبقية شعاعي) داخل الأنسجة النامية. الخلايا العصبية القشرية اعتقال ثم الترحيل في الجزء العلوي من لوحة لتشكيل القشرية في عمليات الاعتقال تتزامن الهجرة العصبية و 4 dendritogenesis. يبدأ التنمية القشرية بين 11-13 يوما الجنينية (E11-13) من 5 إلى إنشاء طبقة ضفيري البدائية 6 أو preplate (PP)، طبقة من الخلايا العصبية التي يعتلي رائدة في VZ. محتملطبقة 6 الخلايا العصبية القشرية (أي الخلايا العصبية القشرية 1 لدت في VZ) ثم توجيه بهم somata في نمط النمطية ويندمج في طبقة متميزة في PP 7. تقسيم هذه الأحداث إلى preplate (طبقة المستقبل القشرية 1) هامشية سطحية وعميقة منطقة، وهذا الأخير يتألف من خلايا subplate (طبقة قشرية عابرة 7). هذه العملية، تسمى تقسيم preplate، هو حدث تأسيسي في النمو المستقبلي للقشرة الدماغ 8. وقد تم تحديد العديد من الطفرات الوراثية التي تعطل مختلف جوانب التنمية القشرية 9. ويمكن أيضا أن تتأثر التنمية القشرية سلبا التعرض للسموم بلعها مثل الكوكايين 10 و الكحول 11. لأن التشوهات القشرية التي تنشأ خلال التنمية هي من المساهمين المحتمل أن الاضطرابات العصبية (مثل التوحد وانفصام الشخصية)، والتحقيقات التجريبية للاضطرابات في التنمية القشرية متأصلةالمهم لي. ولذلك من الأهمية بمكان وضع نهج لدراسة التنمية القشرية التي تسمح المقايسات السريع للآثار السمية الوراثية أو التي تحفظ ولكن أيضا التفاعلات الممكنة بين الخلايا العصبية التمييز، وغيرها من أنواع الخلايا المصفوفة خارج الخلية (ECM) خلال هذه الفترة المبكرة من نمو الدماغ 12 . وقد وفرت إإكسبلنتس شريحة 13 مثل هذا النظام واستخدمت على نطاق واسع في التنمية فحص الخلايا العصبية القشرية 14-16. ومع ذلك، يمكن المقايسات شريحة تعاني من عيب أن الهجرة العصبية ويمكن أن يكون غير طبيعي التصفيح 17 ربما بسبب الضرر الذي يلحق الخلايا السحائي التي تحيط الدماغ النامية ومرساة وشعاعي الدبقية سقالة. كما قد الدبقية الألياف الشعاعية هي الركيزة الهامة لتعطيل الخلايا العصبية القشرية 18 الهجرة من الصفيحة القاعدية عن طريق تشريح تعطيل محليا العمارة الدبقية شعاعي وتؤدي إلى الهجرة القشرية تغييرها. وبالإضافة إلى ذلك سليدائرة الهندسة المدنية من السطوح إإكسبلنتس يوفر المنطقة من الخلايا الميتة التي قد تغير من تركيبة طبيعية من ECM في هذه المجالات. وقد ركزت المناهج الأكثر حداثة تحليلهم على خلايا تقع في عمق شريحة التي تحيط بها أنواع الخلايا المناسبة صحية وECM. ومع ذلك، في بعض الحالات يمكن لهذه المناهج الجديدة تتطلب أن شريحة المثقفين الأصلي سميكة يكون البرد مقطوع مقطوع أو البارافين، بعد التثبيت بحيث يتم الداخلية عادية نسبيا من شريحة المتاحة للتحليل 19-21. كل من vibratome الأصلي تقطيع لإعداد شرائح حية للثقافة وكذلك cryosectioning اللاحقة من شرائح محددة للتحليل تتطلب الرعاية والجهد لهذه المقايسات للعمل. لتوفير بسيطة، نهج تكميلية لدراسات التنمية القشرية في وقت مبكر، وقمنا بتعديل النهج القائمة شريحة 13 إلى تسهيل الدراسات القشرية للتنمية في وقت مبكر. وقد وضعنا WHأوله نموذج يزدرع نصف الكرة مماثلة لنموذج موجود E14 نصف الكرة بأكملها التي تشارك الثقافات تهز في 65 دورات في الدقيقة والنمو عضوي النمط يسمح ل16-18 ساعة 22،23. في نهجنا، يتم وضع إإكسبلنتس نصف الكرة كله على غشاء شبه منفذ 13 مع الأكسجين في جو الثقافة العالية 21،24 تمديد نمو عضوي النمط القشرية لمدة 48 ساعة. هذا النهج يسمح أيضا الصعق الكهربائي ثابت من الخلايا العصبية النامية القشرية. تتم إزالة الأجنة من الرحم وelectroporated DNA البلازميد لإدخال ويتم تشريح الدماغ الانتهائي ثم. يتم عزل كل نصف الكرة ووضعها أسفل على الجانب الإنسي مرشح الكولاجين المغلفة. ويستزرع ثم ​​يزدرع لمدة 48 ساعة، وهي الفترة التي تشمل تقسيم preplate 8. خلال الفترة الثقافة، L6 الخلايا العصبية من تطوير الخلايا العصبية مقدمة لتمييز 25، صحيح داخل لوحة القشرية. طوال هذه الفترة الناميةوتحيط الخلايا العصبية من قبل ECM المناسبة والتي من شأنها أن أنواع الخلايا مواجهة الخلية المقابلة في الجسم الحي. وقد أثبت هذا النظام بالفعل قيمة في فك رموز أحداث الخلوية التي تكمن وراء سمية الإيثانول 26، وتشكيل طبقة 6 preplate تقسيم 7،25.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name </td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 + GlutaMAX</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10565</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G5 Supplement 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17503-012</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Serum-Free Suppl. 50X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1504-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen / Strep Liquid 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 500 ml</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14025</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture insert collagen coated</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3492</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine skin gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9382</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7906</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX 830 Electroporator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer electrodes 10mm</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450166</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Billups Rothenberg</td>
			<td>MIC-101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (5 uL)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87930</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-04</td>
			<td>Specify 1" and style 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors Tough Cut 9 cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>14058-09</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development

القشرية التنمية ينطوي على التفاعلات المعقدة بين الخلايا العصبية وغير العصبية العناصر بما في ذلك الخلايا السلائف، والأوعية الدموية، والسحايا المصفوفة خارج الخلية المرتبطة بها. لأنها توفر بيئة مناسبة عضوي النمط، وغالبا ما تستخدم إإكسبلنتس شريحة القشرية للتحقيق في تلك التفاعلات العصبية التي تتحكم التمايز والتنمية. على الرغم من فائدة، لا يمكن للنموذج يزدرع شريحة تعاني من عيوب بما في ذلك التصفيح الخلوية الشاذة والهجرة. نحن هنا نورد ككل يزدرع نصف الكرة المخية نظام لدراسات التنمية في وقت مبكر القشرية التي هي أسهل لإعداد شرائح من القشرية وعروض الهجرة عضوي النمط ثابت والتصفيح. في هذا النظام النموذجي، التصفيح المبكر وأنماط الهجرة بشكل طبيعي لمدة يومين في المختبر، بما في ذلك فترة تقسيم preplate خلالها طبقة قشرية المحتملين ستة أشكال. ونحن بعد ذلك وضعت الصعق الكهربائي الرحم EX (EUEP)النهج الذي يحقق النجاح ~ 80٪ في استهداف التعبير GFP إلى الخلايا العصبية في القشرة النامية الإنسي الظهرية. ويزدرع نصف الكرة كله يجعل من تطوير نموذج القشرية في وقت مبكر للوصول للتدخل، الصعق الكهربائي الدوائية والنهج التصوير الحية. هذا الأسلوب يتجنب الجراحة المطلوبة من البقاء على قيد الحياة في الرحم الصعق الكهربائي (IUEP) النهج مع تحسين كل من ترنسفكأيشن والمساحي الاتساق الاستهداف. وهذه الطريقة تسهل من الدراسات التجريبية العصبية الهجرة، والانتشار والتمايز.

والجنينية القشرة القوارض يسلك الانحدار العصبية الوراثية عرضية خلال الفترة الإنمائية، مثل القشرة المخية الحديثة أن ما يقرب من 1 الوحشي اليوم أكثر نضجا من القشرة المخية الحديثة الإنسي الظهرية 28. وبالتالي يتم إنشاء الجزء الأكبر من طبقة 6 الخلايا العصبية (أي ?...

Watch this Scientific Journal Video about Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development at JoVE.com

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

يصف هذا البروتوكول إجراء يزدرع المحسنة التي ينطوي<em&gt; السابقين الرحم</em&gt; الصعق الكهربائي، وتشريح ثقافة نصفي الكرة المخية بالكامل من الماوس الجنينية. إعداد الدراسات الدوائية ويسهل المقايسات وظيفة الجين خلال التنمية القشرية في وقت مبكر.

بحكم الرحم الصعق الكهربائي وإإكسبلنتس نصف الكرة المجموع: طريقة بسيطة للدراسات التجريبية التنمية القشرية في وقت مبكر

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

في الرحم بعد Electroporation للثقافة متعلق بالخلايا العصبية الأولية لدراسة وظائف الجينات في مجموعة فرعية من العصبونات القشرية

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

فأر في الرحم Electroporation : الشواهد ترنسفكأيشن جين Spatiotemporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

التصور والتلاعب الجيني من التشعبات والاعمده الفقريه في قشرة الدماغ والحصين ماوس باستخدام<em&gt; في الرحم</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

جيل من الفئران المعدلة وراثيا من قبل موضعيا<em&gt; في الرحم</em&gt; التثقيب الكهربائي و<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; ضوء بارد الفرز

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

عزل السائل المخي الشوكي من أجنة القوارض للاستخدام مع إإكسبلنتس مشرح القشرية الدماغية

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

-النوع الفرعي انتقائية Electroporation للمن القشرية Interneurons

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

رواية استراتيجية الجمع بين CGH الصفيف وتعاقب كل اكسومي وانهانسر في الرحم في القوارض لتحديد الجينات المسببة لتشوهات الدماغ

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

في الرحم النهج Electroporation لللدراسة استثارة الخلايا العصبية القطعان والربط وحيدة الخلية

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

طريقة الكهربية لالكامل خلية الجهد المشبك تسجيلات من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; المستقبلات الضوئية

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

تصوير [كنفوكل] عالية الدقة لحاجز الدم في الدماغ: التصوير، وإعادة البناء ثلاثي الأبعاد، والتقدير الكمي ترانسسيتوسيس

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...