Name: ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development
Uploaded: 2013-04-03T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet tilskud fra NINDS (NS066071) og NIAAA. (P50AA017823) til ECO. Forfatterne takker Dr. Robert Quinn og personale på Institut for forsøgsdyr ressourcer til pasning af dyr. Vi takker Judson Belmont for teknisk support, Nicole Belletier for assistance som en sommer Undergraduate Research Fellow (SURF). Vi takker også Dr. David Cameron for kommentarer og redigeringer på en tidligere version af manuskriptet.

1. Ex utero elektroporeringer med Green Fluorescent Protein Expression Plasmid <ol><li> Plasmid-DNA injektionsopløsninger fremstilles med CAG-EGFP DNA 27 fortyndet til den endelige bearbejdning koncentration på 0,33 mg / ml i ddH 2 O. Qiagen Endo-Free Maxi-Preps anvendes til at oprense plasmid fra transformerede bakterier. Fast green farvestof på ~ 0,02% (vægt / volumen endelig) sættes til DNA-opløsningen som en injektion sporstof. </li><li> For at forberede det kirurgiske område,...

Vi har forbedret og evalueret en eksperimentel model - hele halvkugle eksplantater - til undersøgelse af tidlige kortikale udvikling (E13-E15). Modellen har vist sig nyttig til analyse af migrering og differentiering af excitatoriske neuroner slægt, der udgør laget 6 i den cerebrale cortex 25,37. De vigtigste fordele ved systemet er 1) organotypisk vækst for 2 DIV, 2) enkel tilberedning, og 3) eksperimentelle adgang til neuroner for elektroporation, farmakologisk manipulation og billedbehandling i løbet ...

De pattedyr cerebral cortex former gennem den samordnede proliferation, migration og differentiering af successivt genererede neuroner. Hver neuron fødes i den ventrikulære zone (VZ) og migrerer fra VZ i den mellemliggende zone (IZ) og danner den kortikale plade (CP) 1. Når de passerer gennem forskellige kortikale områder, de vandrende neuroner viser flere former for migration 2,3, der afhænger af det ekstracellulære miljø og andre cellulære bestanddele (fx radial glia) i udviklende væv. Corticale neuroner derefter standse migration i toppen af den formgivende kortikale plade i de sammenfaldende processer neuronal migration anholdelse og dendritogenesis 4. Cortical udvikling initieres mellem embryonale dag 11-13 (E11-13) 5 gennem etablering af det oprindelige netformige lag 6 eller præplade (PP), et lag af pioner neuroner, der ligger over VZ. Prospectivelag 6 kortikale neuroner (dvs. det første kortikale neuroner født i VZ) derefter orientere deres somata i en stereotyp mønster og smelter sammen til en særskilt lag i PP 7. Disse begivenheder opdele præplade i en overfladisk marginal (fremtidige kortikale lag 1) og en dyb zone, hvor sidstnævnte består af subplate celler (forbigående kortikal lag 7). Denne proces, der kaldes præplade opdeling, er en grundlæggende begivenhed i den fremtidige vækst i hjernebarken 8. Mange genetiske mutationer er blevet identificeret som forstyrrer forskellige aspekter af cortical udvikling 9. Cortical udvikling kan også blive negativt påvirket af udsættelse for indtagne toksiner, såsom kokain 10 og alkohol 11. Fordi corticale misdannelser, der opstår under udvikling er sandsynlige bidragydere til neurologiske lidelser (f.eks autisme, skizofreni), empiriske undersøgelser af perturbationer til kortikale udvikling er iboendely vigtig. Det er derfor af stor betydning at etablere metoder til at studere kortikale udvikling, der giver hurtige analyser af genetiske eller toksin virkninger, men som også bevare de mulige interaktioner mellem differentiere neuroner, andre celletyper og ekstracellulær matrix (ECM) i løbet af denne tidlige periode af hjernens udvikling 12 . Skær eksplantater 13 har givet et sådant system, og er ofte blevet brugt til at analysere cortical neuron udvikling 14-16. Imidlertid kan skive assays lider af den ulempe, at neuronal migration og laminering kan være unormal 17 muligvis på grund af beskadigelse af meningeal celler, der omgiver den udviklende hjerne og forankre radial glia scaffold. Som radiale glial fibre er en vigtig substrat for cortical neuron migrering 18 afbrydelse af den basale lamina ved skæring kan lokalt forstyrrer radial glia arkitektur og føre til ændret kortikale migration. Desuden SLIced overflader af eksplantater giver en region af døde celler, der kan ændre den normale sammensætning af ECM i disse områder. Nyere tilgange har fokuseret deres analyse på celler placeret dybt i den skive, der er omgivet af behørige sunde celletyper og ECM. Men i nogle tilfælde kan disse nyere fremgangsmåder kan kræve, at den oprindelige tykke dyrkede skive være cryo-snit eller paraffin-snit efter fiksering, således at den relativt normale indre skive gøres tilgængelig til analyse 19-21. Både den oprindelige vibratome sectioning til fremstilling af levende skiver til kultur samt den efterfølgende cryosectioning af faste skiver til analyse kræver omhu og indsats for disse assays til at arbejde. At give en enkel, komplementær tilgang til studier af tidlig kortikale udvikling, har vi ændret en eksisterende skive tilgange 13 lette undersøgelser af tidlig kortikale udvikling. Vi har udviklet en whole halvkugle eksplantat model ligner eksisterende E14 hel halvkugle model, der involverede rystende kulturer ved 65 omdrejninger i minuttet og tilladt organotypisk vækst i 16-18 timer 22,23. I vores fremgangsmåde, er hele halvkugle eksplantater anbragt på semipermeabel membran 13 med en høj oxygen-kultur atmosphere 21,24 at udvide organotypisk kortikale vækst i 48 timer. Denne fremgangsmåde giver også mulighed for konsekvent elektroporering for at udvikle corticale neuroner. Embryonerne udtages fra livmoderen og elektroporeret at introducere plasmid-DNA og telencephalon derpå dissekeret. Hver halvkugle isoleres og anbringes mediale side nedad på en collagen-coated filter. Eksplantatet dyrkes derefter i et tidsrum på 48 timer, et tidsrum, som omfatter præplade opsplitning 8. I løbet af dyrkningsperioden, udvikler L6-neuroner fra precursor til differentieret neuron 25 korrekt placeret i den korticale plade. I hele denne periode udviklingslandeneneuron er omgivet af en passende ECM-og celletyper, som vil konfrontere den tilsvarende celle in vivo. Dette system har allerede vist sig værdifulde i at decifrere de cellulære begivenheder, der ligger til grund for ethanol toksicitet 26, lag 6 dannelse og præplade opdeling 7,25.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name </td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 + GlutaMAX</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10565</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G5 Supplement 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17503-012</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Serum-Free Suppl. 50X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1504-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen / Strep Liquid 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 500 ml</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14025</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture insert collagen coated</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3492</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine skin gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9382</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7906</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX 830 Electroporator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer electrodes 10mm</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450166</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Billups Rothenberg</td>
			<td>MIC-101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (5 uL)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87930</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-04</td>
			<td>Specify 1" and style 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors Tough Cut 9 cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>14058-09</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development

Cortical udvikling rummer et komplekst samspil mellem neuroner og ikke-neuronale elementer, herunder precursorceller, blodkar, hjernehinderne og tilhørende ekstracellulære matrix. Fordi de tilvejebringer en passende organotypisk miljø, corticale skive eksplantater ofte til at undersøge de interaktioner, der styrer neuronal differentiering og udvikling. Selvom gavnlig, kan skive eksplantat model lider af ulemper, herunder afvigende cellulær laminering og migration. Her rapporterer vi en hel hjernehalvdel eksplantat for studier af tidlig kortikale udvikling, der er lettere at forberede end kortikale skiver og viser konsekvent organotypisk migration og laminering. I denne model system skal du gøre tidlig laminering og migrationsmønstre normalt for en periode på to dage in vitro, inklusive perioden for præplade opdeling, hvor potentielle kortikale lag seks former. Vi derefter udviklet en ex utero elektroporation (EUEP)fremgangsmåde, der opnår ~ 80% succes med at målrette GFP udtryk for neuroner udvikler sig i den dorsale mediale cortex. Hele halvkugle eksplantat model gør tidlig cortical udvikling tilgængelig for elektroporering, farmakologisk intervention og levende billeddannende fremgangsmåder. Denne metode undgår overlevelse kirurgi kræves af in utero elektroporation (IUEP) tilgange og samtidig forbedre både transfektion og areal målretning konsistens. Denne metode vil lette eksperimentelle studier af neuronal proliferation, migration og differentiering.

Den embryonale gnaver cortex udviser en tværgående neurogenetic gradient hele den udviklingsmæssige periode, således at lateral neocortex er cirka 1 dag mere moden end dorsale mediale neocortex 28. Hovedparten af laget 6 neuroner dermed kan (dvs. udviser deres endelige S-fase) på E12 i lateral cortex (også kaldet Felt 40 5) og på E13 i den dorsale mediale cortex (også kaldet Felt 1 5). Præplade opdeling begynder cirka 1 dag efter Layer 6 neuron generation, og dermed er ...

Watch this Scientific Journal Video about Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development at JoVE.com

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Denne protokol beskriver en forbedret explant proces, der omfatter<em&gt; Ex utero</em&gt; Elektroporation, dissektion og kultur af hele hjernehalvdele fra den embryonale mus. Præparatet letter farmakologiske undersøgelser og analyser af genfunktion i den tidlige kortikale udvikling.

Ex utero Elektroporation og Whole halvkugle Eksplantater: A Simple eksperimentel metode til Studier af tidlig Cortical Development

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualisering og genetisk manipulering af dendritter og udløberne i mus cerebrale cortex og hippocampus under anvendelse<em&gt; I utero</em&gt; Elektroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Generering af Topisk Transgene rotter ved<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporation og<em&gt; In vivo</em&gt; Bioluminescens Screening

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

Isolering af cerebrospinalvæske fra Gnaver Embryoner til brug med dissekeret Cerebral Cortikale Eksplantater

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

Subtype-selektive Elektroporation af Kortikal interneuroner

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

En roman-strategien kombinere Array-CGH, hele-exome sekvensering og In Utero elektroporation i gnavere for at identificere sygdomsfremkaldende gener for hjernens misdannelser

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

I Utero Elektroporation Approaches to Undersøgelse ophidselse af neuronale subpopulationer og Single-celle Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Elektrofysiologisk metode til hele celle spænding clamp optagelser fra<em&gt; Drosophila</em&gt; Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

Høj opløsning Konfokal billeddannelse af blod - hjerne barrieren: Imaging, 3D rekonstruktion og kvantificering af Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...