Name: ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development
Uploaded: 2013-04-03T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund subsidies van NINDS (NS066071) en de NIAAA. (P50AA017823) naar ECO. De auteurs danken dr. Robert Quinn en het personeel van de afdeling Proefdierkunde Middelen voor verzorging van dieren. Wij danken Judson Belmont voor technische ondersteuning, Nicole Belletier voor bijstand als een zomer Undergraduate Research Fellow (SURF). We danken ook dr. David Cameron voor commentaar en bewerkingen op een eerdere versie van het manuscript.

1. Ex utero elektroporaties met Green Fluorescent Protein expressieplasmide <ol><li> Plasmide DNA injectieoplossingen worden bereid met CAG-eGFP DNA 27 verdund tot de uiteindelijke werkende concentratie van 0,33 mg / ml in ddH 2 O. Endo-Free Qiagen Maxi-Preps worden gebruikt om het plasmide te zuiveren van getransformeerde bacteriën. Fast green kleurstof bij ~ 0,02% (w / v final) toegevoegd aan de DNA oplossing als injectie tracer. </li><li> Om het operatiegebied te bereiden, Spuit werk...

We hebben verbeterd en geëvalueerd een experimenteel model - hele halfrond explantaten - voor de studie van de vroege corticale ontwikkeling (E13-E15). Het model nuttig is gebleken voor de analyse van migratie en differentiatie van de excitatoire neuron lijn die laag 6 van de cerebrale cortex 25,37 vormt. De belangrijkste voordelen van het systeem zijn 1) organotypische groei 2 DIV, 2) eenvoud van bereiding en 3) experimentele toegang tot de neuronen voor elektroporatie, farmacologische manipulatie en beeldv...

De zoogdieren hersenschors vormen door de gecoördineerde proliferatie, migratie en differentiatie van achtereenvolgens gegenereerde neuronen. Elk neuron is geboren in de ventriculaire zone (VZ) en migreert van de VZ in de tussenliggende zone (IZ), de vorming van de corticale plaat (CP) 1. Als ze door verschillende corticale gebieden, de migrerende neuronen tonen verschillende modi van migratie 2,3 die afhangen van het extracellulaire milieu en andere cellulaire elementen (bijv. radiale glia) in de zich ontwikkelende weefsel. Corticale neuronen dan arresteren migratie bovenaan de vormende corticale plaat in de samenvallende processen van neuronale migratie arrestatie en dendritogenesis 4. Corticale ontwikkeling wordt gestart tussen embryonale dag 11-13 (E11-13) 5 tot oprichting van de primordiale plexiform laag 6 of preplate (PP), een laag van pionier neuronen die ligt over de VZ. Aanstaandelaag 6 corticale neuronen (dwz de eerste corticale neuronen geboren in de VZ), dan oriënteren hun somata in een stereotype patroon en samenvloeien tot een aparte laag in de PP 7. Deze gebeurtenissen splitsing van de preplate in een oppervlakkige marginale (toekomstige corticale laag 1) en een diepe zone, waarbij de laatste bestaat uit aansluitplaat cellen (voorbijgaande corticale laag 7). Dit proces, genaamd preplate splitsen, is een fundamentele gebeurtenis in de toekomstige groei van de hersenschors 8. Veel genetische mutaties geïdentificeerd die verstoren de verschillende aspecten van de corticale ontwikkeling 9. Corticale ontwikkeling kan ook negatief worden beïnvloed door blootstelling aan geconsumeerde stoffen als cocaïne 10 en alcohol 11. Omdat corticale afwijkingen die ontstaan ​​tijdens de ontwikkeling zijn waarschijnlijk bijdragen aan neurologische aandoeningen (bijv. autisme, schizofrenie), empirische onderzoeken van storingen aan de corticale ontwikkeling zijn inherently belangrijk. Het is daarom van groot belang om benaderingen vast te stellen corticale ontwikkeling dat een snelle testen van genetische of toxine effecten toestaan, maar dat ook de mogelijke interacties tussen differentiëren neuronen, andere celtypes en extracellulaire matrix (ECM) behouden tijdens deze vroege periode van ontwikkeling van de hersenen 12 studiepunten . Slice explantaten 13 hebben een dergelijk systeem en zijn alom gebruikt voor het testen corticale neuron ontwikkeling 14-16. Echter, slice assays het nadeel dat neuronale migratie en lamineren kan abnormaal mogelijk 17 door schade aan de meningeale cellen die de ontwikkelende hersenen en verankeren de radiale gliale steiger omringen. Als radiale gliale vezels een belangrijk substraat voor corticale neuron migratie 18 verstoring van de basale lamina door het snijden kan plaatselijk verstoren radiale gliale architectuur en leiden tot gewijzigde corticale migratie. Bovendien de sliCED oppervlakken van explantaten biedt een regio van dode cellen die de normale samenstelling van de ECM in deze gebieden kunnen veranderen. Meer recente benaderingen richtten hun analyse op cellen diep in de slice die worden omringd door passende gezonde soorten cellen en ECM. In sommige gevallen deze nieuwere benaderingen vereisen dat de oorspronkelijke dikke plak gekweekte cryo-sectie of paraffine secties na fixatie zodat de relatief normale inwendige van het segment beschikbaar is voor analyse 19-21. Zowel de originele vibratome snijden de live segmenten voor cultuur en de daaropvolgende cryosectioning vaste segmenten voor analyse te maken dient zorg en inspanning voor deze assays werken. Om een eenvoudige en complementaire aanpak voor de studie van de vroege corticale ontwikkeling te bieden, hebben we gewijzigd van een bestaande slice benaderingen 13 tot studies van de vroege corticale ontwikkeling mogelijk te maken. We hebben een whole halfrond explantaat model vergelijkbaar met een bestaande E14 hele halfrond model dat schudden culturen die op 65 omwentelingen per minuut en toegestane organotypische groei gedurende 16-18 uur 22,23. In onze benadering worden volledige halfrond explantaten bovenaan semi-permeabel membraan 13 met een zuurstofrijke atmosfeer cultuur 21,24 tot organotypische corticale groei verlengen gedurende 48 uur. Deze aanpak maakt het ook mogelijk consistente elektroporatie ontwikkelen corticale neuronen. De embryo&#39;s verwijderd uit de baarmoeder en geëlektroporeerd met plasmide DNA te introduceren en de grote hersenen wordt dan ontleed. Elk halfrond is geïsoleerd en geplaatst mediale zijde naar beneden op een collageen gecoate filter. Het explantaat wordt vervolgens gekweekt gedurende 48 uur, een periode die preplate splitsing 8 omvat. Tijdens de kweekperiode, L6 neuronen ontwikkelen van voorloper van gedifferentieerde neuron 25, de juiste positie binnen de corticale plaat. Gedurende deze periode is de ontwikkeling vanneuron wordt omringd door de juiste ECM en celtypen die de desbetreffende cel in vivo zouden voordoen. Dit systeem heeft al bewezen waardevol bij het ​​ontcijferen van de cellulaire gebeurtenissen die ethanol toxiciteit 26, laag 6 vorming en preplate splitsen 7,25 ten grondslag liggen.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name </td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 + GlutaMAX</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10565</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G5 Supplement 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17503-012</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Serum-Free Suppl. 50X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1504-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen / Strep Liquid 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 500 ml</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14025</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture insert collagen coated</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3492</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine skin gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9382</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7906</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX 830 Electroporator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer electrodes 10mm</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450166</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Billups Rothenberg</td>
			<td>MIC-101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (5 uL)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87930</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-04</td>
			<td>Specify 1" and style 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors Tough Cut 9 cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>14058-09</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development

Corticale ontwikkeling brengt complexe interacties tussen neuronen en niet-neuronale elementen waaronder precursor cellen, bloedvaten, meninges en bijbehorende extracellulaire matrix. Omdat ze een geschikte organotypische omgeving worden corticale slice explantaten vaak gebruikt om de interacties die neuronale differentiatie en ontwikkeling controleren onderzoeken. Hoewel nuttig, kan de slice explantaat model last hebben van nadelen waaronder afwijkende cellulaire lamineren en migratie. Hier rapporteren geheel hersenhelft explant voor studies van vroege corticale ontwikkeling die gemakkelijker te bereiden dan corticale schijfjes en shows consistente organotypische migratie en lamineren. In dit modelsysteem vroege lamineren en migratiepatronen normaal doorgaan gedurende twee dagen in vitro, inclusief de periode van preplate splitsen, waarbij potentiële corticale laag zes vormen. Vervolgens hebben we ontwikkelden een ex utero elektroporatie (EUEP)aanpak die ~ 80% succes bij de opsporing van GFP expressie om neuronen te ontwikkelen in de dorsale mediale cortex bereikt. De hele halfrond explantatie model maakt vroege corticale ontwikkeling toegankelijk voor elektroporatie, farmacologische interventie en live imaging benaderingen. Deze methode vermijdt het voortbestaan ​​operatie vereist van in utero elektroporatie (IUEP) benaderingen, terwijl het verbeteren van zowel de transfectie en areal gericht consistentie. Deze werkwijze vergemakkelijkt experimentele studies van neuronale proliferatie, migratie en differentiatie.

De embryonale knaagdier cortex vertoont een dwarse neurogenetische gradiënt gedurende de ontwikkelingsperiode, zodanig dat laterale neocortex is ongeveer 1 dag volwassener dan dorsale mediale neocortex 28. Het grootste deel van laag 6 neuronen aldus verkregen (dwz vertonen hun laatste S-fase) op E12 in laterale cortex (ook wel Field 40 5) en E13 in de dorsale mediale cortex (ook wel Field 1 5). Preplate splitsen begint na ongeveer 1 dag Laag 6 neuron generatie en dus wordt inge...

Watch this Scientific Journal Video about Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development at JoVE.com

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Dit protocol beschrijft een verbeterde explantaat procedure die inhoudt dat<em&gt; Ex utero</em&gt; Elektroporatie, dissectie en de cultuur van volledige hersenhelften uit de embryonale muis. De voorbereiding vergemakkelijkt farmacologische studies en analyses van gen-functie tijdens de vroege corticale ontwikkeling.

Ex utero elektroporatie en Whole halfrond Explantaten: Een eenvoudige experimentele methode voor bestudering van vroege corticale ontwikkeling

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Elektroporatie gevolgd door primaire neuronale Cultuur voor het bestuderen van Gene Functie in subset van de corticale neuronen

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Muis In Utero Elektroporatie: Gecontroleerde spatiotemporele Gene Transfectie

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualisatie en genetische manipulatie van dendrieten en stekels in de muis Cerebral cortex en de hippocampus met behulp van<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporatie

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Generatie Topisch transgene Rats door<em&gt; In de baarmoeder</em&gt; Elektroporatie en<em&gt; In vivo</em&gt; Bioluminescence Screening

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

Isolatie van de cerebrospinale vloeistof uit Knaagdieren Embryo&#39;s voor gebruik met Ontleed cerebrale corticale Explantaten

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

Subtype-selectieve Electroporatie van corticale Interneurons

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Een nieuwe strategie combinatie matrix-CGH, geheel-exome Sequencing en In Utero Electroporation bij knaagdieren ter identificatie van de oorzakelijke genen voor hersenen misvormingen

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Elektroporatie benaderingen om de prikkelbaarheid van neuronale subpopulaties en Single-cell Connectivity Studie

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Elektrofysiologische methode voor opname van volledige spanningsklemmen van<em&gt; Drosophila</em&gt; Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

Hoge resolutie Confocal beeldvorming van de bloed - hersen barrière: Imaging, 3D reconstructie en kwantificering van Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...