Name: ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development
Uploaded: 2013-04-03T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development at JoVE.com

Diese Arbeit wurde Zuschüsse aus NINDS (NS066071) und der NIAAA unterstützt. (P50AA017823) an ECO. Die Autoren danken Dr. Robert Quinn und das Personal in der Abteilung für Versuchstierkunde Ressourcen für Tierpflege. Wir danken Judson Belmont für den technischen Support, Nicole Belletier für die Unterstützung als Sommer Undergraduate Research Fellow (SURF). Wir danken auch Dr. David Cameron für Kommentare und Änderungen auf eine frühere Version des Manuskripts.

1. Ex utero Elektroporationen mit Green Fluorescent Protein Expression Plasmid <ol><li> Plasmid-DNA werden mit Injektionslösungen CAG-eGFP DNA 27 verdünnt, um die endgültige Arbeitskonzentration von 0,33 mg / ml in ddH 2 O zubereitet Endo-Free Qiagen Maxi-Präparationen verwendet werden, um das Plasmid aus den transformierten Bakterien zu reinigen. Schnelle grünen Farbstoff bei ~ 0,02% (w / v endgültige) mit der DNA-Lösung als Injektion Tracer zugegeben. </li><li> Um den OP-Bereich...

Wir haben verbessert und ausgewertet eines experimentellen Modells - ganzen Hemisphäre Explantate - zur Untersuchung der frühen Entwicklung kortikalen (E13-E15). Das Modell hat sich für die Analyse der Migration und Differenzierung des exzitatorischen Neurons Linie, die Schicht 6 aus der Großhirnrinde 25,37 bildet nützlich. Die prinzipiellen Vorteile des Systems sind: 1) organotypischen Wachstum für 2 DIV, 2) Einfachheit der Zubereitung, und 3) experimentellen Zugang zu den Neuronen für die Elektropora...

Die Säugerzellen Großhirnrinde Formen durch den abgestimmten Proliferation, Migration und Differenzierung von nacheinander erzeugten Neuronen. Jedes Neuron in der ventrikulären Zone (VZ) geboren und wandert von der VZ in die Zwischenzone (IZ), Bilden des kortikalen Platte (CP) ein. Als sie durch die verschiedenen kortikalen Bereichen passieren, zeigen die Migration Neuronen mehrere Modi der Migration 2,3, die auf die extrazelluläre Umgebung und andere zelluläre Elemente (zB radiale Gliazellen) innerhalb des sich entwickelnden Gewebes ab. Kortikalen Neuronen dann verhaften Migration an der Spitze der bildenden kortikalen Platte in den zusammenfallenden Prozesse der neuronalen Migration Verhaftung und dendritogenesis 4. Kortikalen Entwicklung zwischen embryonalen Tag 11-13 (E11-13) 5 durch die Einrichtung des Ur plexiformen Schicht 6 oder Vorbeschichtungszyklus (PP), eine Schicht des Pioniers Neuronen, die über der VZ eingeleitet. ProspektivSchicht 6 kortikalen Neuronen (dh die ersten kortikalen Neuronen im VZ geboren), dann orientieren ihre Somata in einem stereotypen Muster und verbinden sich zu einer deutlichen Schicht innerhalb des PP 7. Diese Ereignisse spaltete die Vorbeschichtungszyklus in eine oberflächliche marginal (zukünftige kortikale Schicht 1) und einer tiefen Zone, die letztere Plattenaufbau Zellen (transiente kortikale Schicht 7) zusammen. Dieser Vorgang, genannt Vorbeschichtungszyklus Spaltung, ist ein grundlegendes Ereignis in der Zukunft Wachstum der Großhirnrinde 8. Viele genetische Mutationen identifiziert worden, die stören, die verschiedenen Aspekte der kortikalen Entwicklung 9. Kortikalen Entwicklung kann sich auch negativ durch die Exposition gegenüber aufgenommenen Gifte wie Kokain 10 und Alkohol 11 beeinflusst werden. Da kortikalen Fehlbildungen, die während der Entwicklung entstehen wahrscheinlich Beitragszahler neurologischen Erkrankungen (zB Autismus, Schizophrenie), sind empirische Untersuchungen von Störungen auf kortikalen Entwicklung inhärentenders wichtig. Es ist daher von großer Bedeutung, um Ansätze zu etablieren, um kortikalen Entwicklung, die eine schnelle Tests von genetischen oder Toxin Effekte erlauben die aber auch die Erhaltung der möglichen Wechselwirkungen zwischen differenzierenden Neuronen, andere Zelltypen und der extrazellulären Matrix (ECM) in dieser frühen Phase der Entwicklung des Gehirns 12 studierst . Scheibe Explantate 13 haben ein solches System zur Verfügung gestellt und sind weit Assay kortikalen Neuronen Entwicklung 14-16 verwendet. Allerdings kann Slice Assays unter dem Nachteil, dass neuronale Migration und Laminierung kann als abnormal 17 möglicherweise durch die Zellen, die den meningealen entwickelnden Gehirns und der radiale Anker glialen Stützgerüst umgeben beschädigen leiden. Als radiale Gliafasern ein wichtiger Substrat für kortikale Neuronen Migration 18 Störung der Basallamina durch Schneiden sind lokal zu stören radialen Gliazellen Architektur und führen zu veränderten kortikalen Migration. Neben der SLIced Oberflächen Explantate stellt einen Bereich aus toten Zellen, die den normalen Zusammensetzung der ECM in diesen Bereichen verändert werden kann. Neuere Ansätze haben ihre Analyse auf Zellen tief in der Scheibe, die durch geeignete gesunde Zelltypen und ECM umgeben befinden konzentriert. Jedoch kann in einigen Fällen diese neueren Ansätze können erfordern, dass die ursprüngliche Dicke kultivierten Slice Kryo-oder Paraffin-Schnitt geschnitten werden nach Fixierung, so daß die relativ normal Inneren der Scheibe zur Verfügung gestellt wird zur Analyse 19-21. Sowohl der ursprüngliche Vibratom Schneiden, um die Live-Scheiben für Kultur sowie der anschließenden Kryoschneiden von festen Scheiben für die Analyse vorzubereiten erfordern Sorgfalt und Mühe für diese Assays zu arbeiten. Um einen einfachen, ergänzenden Ansatz für Studien der frühen kortikalen Entwicklung, haben wir modifiziert eine bestehende Scheibe Ansätze 13 Studien der frühen kortikalen Entwicklung zu erleichtern. Wir haben eine wh entwickeltole Hemisphäre Explantat-Modell ähnlich einem bestehenden E14 ganzen Hemisphäre Modell, das geschüttelte Kulturen bei 65 Umdrehungen pro Minute und erlaubt organotypischen Wachstum für 16-18 Stunden 22,23 involviert. In unserem Ansatz werden ganzen Hemisphäre Explantate auf semipermeable Membran 13 mit einem hohen Sauerstoff-Atmosphäre Kultur 21,24 angeordnet, um organotypischen kortikalen Wachstum für 48 Stunden verlängern. Dieser Ansatz ermöglicht eine konsistente Elektroporation entwickelt kortikalen Neuronen. Die Embryonen werden aus der Gebärmutter entfernt und elektroporiert, Plasmid-DNA einzuführen und die Telencephalon wird dann seziert. Jede Hemisphäre wird isoliert und medialen Seite nach unten auf eine Kollagen-beschichtete Filter. Das Explantat wird dann für einen Zeitraum von 48 Stunden, eine Periode, die Vorbeschichtungszyklus Aufspaltung 8 umfasst kultiviert. Während der Anzucht, entwickeln L6 Neuronen aus Vorläuferzellen zu unterscheiden Neuron 25, richtig positioniert in der kortikalen Platte. Während dieser Zeit ist die Entwicklung vonNeuron wird durch die entsprechende ECM und Zelltypen, die die entsprechende Zelle in vivo zu konfrontieren würde umgeben. Dieses System hat sich bereits in der Entschlüsselung der zellulären Vorgänge, die Ethanol Toxizität 26, Schicht 6 Bildung und Vorbeschichtungszyklus Aufspaltung 7,25 zugrunde wertvoll.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name </td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 + GlutaMAX</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10565</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G5 Supplement 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17503-012</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Serum-Free Suppl. 50X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1504-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen / Strep Liquid 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 500 ml</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14025</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture insert collagen coated</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3492</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine skin gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9382</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7906</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX 830 Electroporator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer electrodes 10mm</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450166</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Billups Rothenberg</td>
			<td>MIC-101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (5 uL)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87930</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-04</td>
			<td>Specify 1" and style 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors Tough Cut 9 cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>14058-09</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development

Kortikalen Entwicklung beinhaltet komplexe Interaktionen zwischen Neuronen und nicht-neuronalen Elemente, einschließlich Vorläuferzellen, Blutgefäße, Hirnhäute und die damit verbundenen extrazellulären Matrix. Weil sie eine geeignete organotypischen Umfeld zu schaffen, sind kortikale Schicht Explantate oft verwendet, um die Wechselwirkungen, die neuronale Differenzierung und Entwicklung steuern zu untersuchen. Obwohl von Vorteil, kann die Scheibe Explantat-Modell von Nachteilen einschließlich aberrante zelluläre Laminieren und Migration leiden. Hier berichten wir über eine ganze Gehirnhälfte Explantat für Studien der frühen kortikalen Entwicklung, die einfacher herzustellen als kortikale Scheiben und zeigt konsistente organotypischen Migration und Laminierung. In diesem Modellsystem, frühe Laminierung und Migrationsmuster der Regel über eine Zeitspanne von zwei Tagen in vitro, einschließlich der Dauer der Vorbeschichtungszyklus Splitting, bei denen Interessenten Rindenschicht sechs Formen. Wir entwickelten eine ex utero Elektroporation (EUEP)Ansatz, ~ 80% Erfolg bei der Ausrichtung der GFP-Expression zu Neuronen entwickeln im dorsalen medialen Kortikalis erreicht. Die ganze Hemisphäre Explantat Modell macht frühen kortikalen Entwicklung zugänglich für die Elektroporation, pharmakologische Intervention und Live-Bildgebung. Dieses Verfahren vermeidet die Überlebensrate Chirurgie in utero Elektroporation (IUEP) erforderlich ist, während Ansätze Verbesserung sowohl Transfektion und Flächendichte Targeting Konsistenz. Dieses Verfahren erleichtert experimentelle Untersuchungen von neuronalen Proliferation, Migration und Differenzierung.

Die embryonale Nager Cortex weist eine quer neurogenetischen Gradienten in der Entwicklungsphase ist, so dass seitliche Neocortex ungefähr 1 Tag reifer als dorsalen medialen Neocortex 28. Die Masse der Schicht 6 Neuronen so erzeugte (dh weisen ihre endgültige S-Phase) auf E12 in seitlichen Kortex (auch als Feld 40 5) und bei E13 in der dorsalen medialen Kortex (auch als Feld 1 5). Vorbeschichtungszyklus Aufspaltung beginnt etwa 1 Tag nach Layer 6 Neuron Generation und wird som...

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Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Dieses Protokoll beschreibt eine verbesserte Explantat Verfahren, das umfasst<em&gt; Ex utero</em&gt; Elektroporation, Dissektion und Kultur des gesamten zerebralen Hemisphären aus dem embryonalen Maus. Die Vorbereitung erleichtert pharmakologischen Studien und Untersuchungen von Genfunktionen in der frühen kortikalen Entwicklung.

Ex utero Elektroporation und Whole Hemisphäre Explantate: A Simple Experimentelle Methode für Studien der frühen kortikalen Entwicklung

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Elektroporation gefolgt von primären neuronalen Kultur für ein Studium Gene Function in Subset von kortikalen Neuronen

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Forschung

Neurowissenschaften

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

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In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

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Visualisierung und genetische Manipulation von Dendriten und Dornen in der Maus Hirnrinde und im Hippocampus mit<em&gt; In utero</em&gt; Die Elektroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

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