Name: ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development
Uploaded: 2013-04-03T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על מענקים מNINDS (NS066071) וNIAAA. (P50AA017823) לECO. המחברים מודים לד&quot;ר רוברט קווין וצוות במחלקת המשאבים חיו מעבדה לטיפול בבעלי חיים. אנו מודים ג&#39;דסון למונט לתמיכה טכנית, ניקול Belletier לסיוע כעמיתת מחקר לתואר ראשון קיץ (SURF). אנו מודים גם לד&quot;ר דיוויד קמרון להערות ועריכות בגרסה קודמת של כתב היד.

1. Electroporations רחם אקס עם ביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק פלסמיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרוני הזרקת DNA פלסמיד שהוכנו CAG-27-DNA eGFP המדולל לריכוז העבודה הסופי של 0.33 מ&quot;ג / מ&quot;ל בDDH 2 O. -Preps מקסי Endo-חינם Qiagen משמש כדי לטהר פלסמיד מחיידקים ...

יש לנו שיפור ומוערך מודל ניסויי - explants אונה השלמה - למחקר על התפתחות קליפת מוח המוקדמת (E13-E15). המודל הוכיח שימושי לניתוח של הגירה ובידול של שושלת נוירון המעוררת שמהווה שכבה 6 של קליפת מוח 25,37. יתרונותיה העיקריים של המערכת הם: 1) צמיחת organotypic ל2 DIV, 2) פשטות של הכנה, ו3) גי...

צורות יונקי קליפת המוח באמצעות התפשטות, ההגירה ובידול המרוכז של נוירונים שנוצרו ברציפות. כל נוירון הוא נולד באזור חדרית (VZ) ונודד מVZ לאיזור ביניים (א.ת.), ויצר את צלחת קליפת המוח (CP) 1. כשהם עוברים דרך תחומים שונים של קליפת מוח, תאי העצב הנודד יציג את המצבים מרובים של הגירת 2,3 התלויים בסביבה התאית ומרכיבים תאיים אחרים (למשל גליה רדיאלי) בתוך הרקמה המתפתחת. נוירונים בקליפת מוח ואז לעצור את ההגירה בראש צלחת קליפת המוח להרכיב בתהליכים החופפים מעצר הגירה ועצבי 4 dendritogenesis. התפתחות קליפת המוח היא שיזם בין ימים עובריים 11-13 (E11-13) 5 עד הקמתה של השכבה הקדמונית plexiform 6 או preplate (PP), שכבה של תאי עצב חלוץ שoverlies VZ. לעתידשכבת 6 נוירונים בקליפת מוח (כלומר נוירונים בקליפת המוח הראשונים שנולדו בVZ) ואז לכוון אותם בsomata דפוס סטריאוטיפי ולהתגבש לשכבה ברורה בתוך 7 PP. אירועים אלה לפצל preplate ל( שכבת עתיד קורטיקלי 1) שטחית שולית ואזור עמוק, שהאחרון המורכב של תאי קליפת המוח (שכבת subplate חולפת 7). תהליך זה, המכונה פיצול preplate, הוא אירוע מכונן בצמיחה העתידית של קליפת מוח 8. מוטציות גנטיות רבות זוהו לשבש היבטים שונים של התפתחות קליפת המוח 9. התפתחות קליפת המוח יכולה גם להיות מושפעת לרעה על ידי חשיפה לרעלי ingested כמו קוק 10 ו 11 באלכוהול. בגלל מומים בקליפת המוח שמתעוררים במהלך פיתוח הם תורמים צפויים הפרעות נוירולוגיות (למשל אוטיזם, סכיזופרניה), חקירות אמפיריות של הפרעות להתפתחות קליפת מוח טבועותly החשוב. לכן חשיבות רבה להקמת גישות ללמוד פיתוח קליפת המוח שייאפשרו מבחנים מהירים של השפעות גנטיות או רעל אבל זה גם לשמור על אינטראקציות האפשריות בין הנוירונים מבדילים, סוגי תאים אחרים ומטריקס (ECM) בתקופה המוקדמת של התפתחות המוח 12 . explants Slice 13 ספק מערכת כזו והיה בשימוש נרחב לפיתוח נוירון קורטיקלי assay 14-16. עם זאת, מבחנים פרוסים יכולים לסבול מהחסרון שההגירה ולמינציה עצבית יכולים להיות נורמלית 17 אולי בשל ניזק לתאי meningeal המקיפים את המוח ועוגן פיתוח רדיאלי גליה פיגום. כסיבי גליה רדיאליים הם מצע חשוב ל18 שיבוש הגירת נוירון קורטיקלי של lamina הבסיס של חיתוך עלול לשבש באופן מקומי ארכיטקטורת גלייה רדיאלי ולהוביל להגירת קליפת מוח שונה. בנוסף SLIמשטחי CED של explants מספקים אזור של תאים מתים שעשוי לשנות את ההרכב הרגיל של ECM באזורים אלה. גישות מאוחרות יותר התמקדו הניתוח שלהם בתאים הנמצאים עמוק בפרוסה שמוקפות בסוגים מתאימים בריאים סלולריים וECM. עם זאת, במקרים מסוימים גם גישות חדשות אלו יכולות לדרוש שהפרוסה העבה התרבותית המקורית להיות cryo-נותחה או פרפין נותח לאחר קיבוע כך שהחלק הפנימי הנורמלי יחסית של הפרוסה נעשתה זמין לניתוח 19-21. שניהם vibratome המקורי חתך להכין את הפרוסות החיות לתרבות כמו גם cryosectioning הבא של פרוסות קבועות לניתוח דורש טיפול ומאמץ למבחנים אלה לעבודה. כדי לספק גישה פשוטה, ללימודים משלימה של התפתחות קליפת מוח מוקדם, יש לנו גישות שונות an פרוס קיימות 13 כדי להקל על מחקרים של התפתחות קליפת מוח בשלב מוקדם. פתחנו WHמודל ole אונת explant דומה למודל קיים E14 כל אונה שמעורבות תרבויות רועדות ב 65 סיבובים לדקה וצמיחת organotypic מותר ל16-18 שעות 22,23. בגישה שלנו, explants אונה השלמה מונחים על קרום חדיר למחצה עם 13 באווירת תרבות חמצן גבוהה 21,24 להאריך צמיחת קליפת המוח organotypic עבור 48 שעות. גישה זו גם מאפשרת לelectroporation העקבי של פיתוח נוירונים בקליפת המוח. העוברים יוסרו מהרחם וelectroporated להציג את ה-DNA פלסמיד ולאחר מכן telencephalon מנותח. אונה כל מבודדת והניחה את הצד המדיאלי על מסנן קולגן מצופה. אז explant בתרבית לתקופה של 48 שעות, תקופה שכוללת פיצול preplate 8. בתקופת התרבות, L6 הנוירונים להתפתח ממבשרים 25 נוירון המובחן, ממוקם כראוי בתוך צלחת קליפת המוח. בכל תקופה זו מתפתחתנוירון מוקף ECM המתאים וסוגי תאים שיעמידו התא המתאים בגוף חי. שיטה זו כבר הוכיחה יקרה בפענוח האירועים התאיים העומדים בבסיס רעילות אתנול 26, 6 והיווצרות שכבת preplate פיצול 7,25.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name </td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 + GlutaMAX</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10565</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G5 Supplement 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17503-012</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Serum-Free Suppl. 50X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1504-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen / Strep Liquid 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 500 ml</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14025</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture insert collagen coated</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3492</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine skin gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9382</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7906</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX 830 Electroporator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer electrodes 10mm</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450166</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Billups Rothenberg</td>
			<td>MIC-101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (5 uL)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87930</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-04</td>
			<td>Specify 1" and style 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors Tough Cut 9 cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>14058-09</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development

התפתחות קליפת מוח כרוך אינטראקציות מורכבות בין תאי עצב ואלמנטים שאינם עצביים בין תאים מבשרים, כלי דם, קרום מוח ומטריקס המשויך. משום שהם מספקים סביבה מתאימה organotypic, explants הפרוס קליפת המוח משמשים לעתים קרובות כדי לחקור אינטראקציות אלה ששולטים בהתמיינות והתפתחות עצביות. אמנם מועיל, מודל explant פרוסה יכול לסבול מחסרונות כוללים למינציה סלולרית חריגות והגירה. כאן אנו מדווחים מערכת כל חץ כדור מוחית explant ללימודים של התפתחות קליפת המוח הקדומה שיותר קל להכין מפרוסות ומופעי קליפת מוח הגירת organotypic עקבית ולמינציה. במערכת מודל זה, למינציה המוקדמת ודפוסי נדידה להמשיך כרגיל לתקופה של ימים במבחנה, לרבות תקופת פיצול preplate, במהלך ששכבת קליפת מוח פוטנציאלית שש צורות. אז פתחנו electroporation הרחם לשעבר (EUEP)גישה שמשיגה הצלחה ~ 80% במיקוד הביטוי של GFP לנוירונים בקליפת המוח המתפתחים המדיאלי הגבה. כל מודל explant האונה עושה פיתוח נגיש עבור electroporation התערבות, תרופתית וגישות הדמיה חיות מוקדם קליפת המוח. שיטה זו מונעת ניתוח ההישרדות הנדרשת ברחם electroporation (IUEP) גישות תוך השיפור גם transfection ועקביות מיקוד Areal. שיטה זו תאפשר מחקרים ניסיוניים של שגשוג, נדידה והתמיינות של תאי עצב.

המכרסם העוברית הקליפה מציגה שיפוע neurogenetic רוחבי לאורך כל תקופת ההתפתחות, שהניאוקורטקס כגון רוחב הוא יום כ 1 בוגר יותר מ 28 הניאוקורטקס המדיאלי הגבה. חלק הארי של שכבה 6 הנוירונים נוצרים כך (כלומר, תציג S-השלב הסופי שלהם) על E12 בקליפת מוח לרוחב (המכונה גם שדה 40 5)...

Watch this Scientific Journal Video about Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development at JoVE.com

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

פרוטוקול זה מתאר הליך explant משופר הכולל<em&gt; לשעבר רחם</em&gt; Electroporation, נתיחה והתרבות של אונות מוח שלמות מהעכבר העוברי. ההכנה מאפשרת לימודים ומבחנים פרמקולוגיים של תפקוד גן במהלך התפתחות קליפת מוח בשלב מוקדם.

לשעבר הרחם electroporation וexplants חצי כדור שלם: שיטה ניסיונית פשוטה למחקרים בהתפתחות קליפת מוח הקדומה

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

ברחם electroporation ואחריו תרבות עצבית ראשונית ללימוד פונקציה ג&#39;ין בתת קבוצה של נוירונים קליפתיים

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

עכבר בתוך הרחם Electroporation: ג&#39;ין מבוקרת transfection Spatiotemporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

להדמיה מניפולציה גנטית של דנדריטים עם קוצים בקליפת עכבר היפוקמפוס מוחין באמצעות<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

דור של חולדות למריחה מהונדסים על ידי<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation ו<em&gt; בvivo</em&gt; הקרנת פליטת אור

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

בידוד של נוזל השדרתי מעוברים מכרסמים לשימוש עם explants מוחות קליפתיים גזור

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

Electroporation תת סוג סלקטיבי של בקליפת המוח interneurons

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

אסטרטגיה רומן המשלב מערך-CGH, רצף שלם-exome and בתוך הרחם אלקטרופורציה בחולדות לזיהוי גנים סיבתי של מומים המוח

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

ברחם Electroporation גישות לחקר רגישות של העצבית subpopulations וקישוריות תא יחיד

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

שיטה אלקטרו-קולית לקולקציית מתח מלא<em&gt; תסיסנית</em&gt; פוטורספטורים

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

דימות ברזולוציה קונאפוקלית של מחסום הדם - מוח: הדמיה, שחזור תלת-ממד, כימות של Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...