Name: ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development
Uploaded: 2013-04-03T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development at JoVE.com

この作品は、NINDS（NS066071）とNIAAAからの助成金をサポートされていました。 （P50AA017823）エコへ。著者は、ロバート·クインと動物のケアのための実験動物資源学科のスタッフに感謝します。私たちは夏の学部リサーチフェロー（SURF）などの支援については、テクニカル·サポートのためにニコールBelletierをジャドソンベルモントに感謝します。また、コメントにデビッドキャメロンに感謝し、原稿の以前のバージョンで編集します。

プラスミドグリーン蛍光タンパク質発現との1。 のEx子宮内エレクトロポ<ol><li>プラスミドDNAの注射液は、蒸留H 2 O中0.33 mg / mlの最終作業濃度まで希釈したCAG-EGFP DNAを27を用いて製造されるキアゲン遠藤フリーマキシプレップは、形質転換された細菌からプラスミドを精製するために使用されています。 〜0.02％（w / vの最終）での高速グリーン色素が注入トレーサとし?...

全体の半球外植片 - - 早期皮質発達の研究（E13-E15）のための我々は実験モデルを改善し、評価した。モデルは、移行および大脳皮質25,37の層6を構成する興奮性ニューロン系統の分化の解析に有用であることが証明されました。システムの主な利点は、準備が単純、脳の発達のこの早期、臨界期中にエレクトロポレーション、薬理学的操作とイメージングのためのニューロン〜3）実?...

連続して生成されたニューロンの協調的な増殖、遊走及び分化を通じて哺乳類大脳皮質を形成する。各ニューロンは脳室帯に生まれた（VZ）と皮質板（CP）の1を形成し 、中間帯（IZ）にVZから移動されています。彼らは異なる皮質領域を通過する際、移行のニューロンが細胞外環境と開発組織内の他の細胞成分（ 例えば放射状グリア）に依存する移行2,3の複数のモードを表示します。皮質ニューロンはその後ニューロン移動の逮捕とdendritogenesis 4の同時プロセスにおける成形皮質板の上部に移行を逮捕。 皮質の発達は、胚の始原日網状層6またはpreplate（PP）、その上に重なるVZパイオニアニューロンの層の設立を通じて、11月13日（E11-13）5との間で開始されます。プロスペクティブその後層6皮質ニューロン（VZで生まれすなわち第一皮質ニューロン）の向きは、そのステレオタイプのパターンで細胞体およびPP 7内の別個の層に合体。これらのイベントは、表面的な限界（将来の皮質第1層）とディープゾーン、サブプレート細胞（一過性皮質の第7層）から成る後者にpreplateを分割します。このプロセスは、preplate分割と呼ばれる、大脳皮質8の将来の成長の基盤となるイベントです。 多くの遺伝的変異は皮質発達9の様々な側面を混乱させることが確認されている。皮質の開発も悪影響コカイン10とアルコール11と摂取毒素への暴露によって影響を受ける可能性があります。開発中に発生する皮質奇形、神経障害（ 例えば自閉症、統合失調症）への貢献者である可能性が高いので、皮質発達に摂動の実証的調査が内在している重要LY。これは、遺伝的または毒素効果の迅速なアッセイを可能にするだけでなく、脳の発達12の初めに、この期間中に差別ニューロン、他のタイプの細胞と細胞外マトリックス（ECM）との間の相互作用の可能性を維持することが皮質の発達を研究するための手法を確立するためにかなりのに重要である。 スライス外植片13は、このようなシステムを提供していると広くアッセイ皮質ニューロンの発達14から16に使用されてきた。しかし、スライスアッセイは、神経細胞の遊走およびラミネーションは、おそらく脳の発達とアンカー放射状グリア足場を囲む髄膜細胞への損傷によって17異常なことができないという欠点に苦しむことができます。放射状グリア繊維はスライスによる基底膜の皮質ニューロンの移行18中断のための重要な基質であるとしてローカルに放射状グリアアーキテクチャを混乱させ、変化した皮質の移行につながる可能性があります。加えてSLI外植片の表面CEDは、これらの分野におけるECMの通常の構図を変化させることができる死んだ細胞の領域を提供します。 より最近のアプローチは適切な健康な細胞型とECMに囲まれているスライスの奥深くにある細胞に自分の分析を当てている。しかし、いくつかのケースでは、これらの新しいアプローチは、元の厚い培養スライスはスライスの比較的正常なインテリアが分析19から21のために利用可能になるように固定後、凍結切片またはパラフィン包埋切片であることを必要とすることができます。文化だけでなく、分析のために固定されたスライスのその後の凍結セクショニングのライブスライスを準備するセクショニングオリジナルビブラトーム両方がこれらのアッセイのためのケアと労力が動作する必要があります。 初期の皮質の発達についての研究のためのシンプルな、補完的なアプローチを提供するために、我々は初期の皮質の発達についての研究を促進する13既存のスライスのアプローチを変更しました。我々は、WHを開発した65分当たりの回転数と16〜18時間22,23に対して許可される器官の成長で振とう培養を関与して既存のE14全半球モデルに似たOLE半球植モデル。我々のアプローチでは、全体の半球の外植片を48時間器官皮質の成長を延長するために、高酸素培養雰囲気21,24内で半透膜13の上に配置されます。また、このアプローチは、皮質ニューロンの開発の一貫したエレクトロポレーションを可能にします。胚が子宮から取り出され、プラスミドDNAを導入するエレクトロポレーションとは、その後、終脳解剖されています。各半球を単離し、コラーゲンコートフィルタで内側を下に配置されます。外植片は、その後、48時間、preplate分割8を含む期間の期間培養する。培養期間中、L6のニューロンは皮質板内に正しく配置区別ニューロン25に前駆体から開発しています。この期間を通じて開発神経細胞は、 生体内の対応するセルに立ち向かうであろう適切なECMと細胞型に囲まれています。このシステムはすでにエタノール毒性26、層6の形成とpreplate分割7,25の根底にある携帯電話のイベントを解読に貴重であると判明しました。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name </td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 + GlutaMAX</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10565</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G5 Supplement 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17503-012</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Serum-Free Suppl. 50X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1504-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen / Strep Liquid 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 500 ml</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14025</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture insert collagen coated</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3492</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine skin gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9382</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7906</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX 830 Electroporator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer electrodes 10mm</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450166</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Billups Rothenberg</td>
			<td>MIC-101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (5 uL)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87930</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-04</td>
			<td>Specify 1" and style 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors Tough Cut 9 cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>14058-09</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development

皮質の発達は、前駆細胞、血管、髄膜および関連する細胞外マトリックスを含む神経細胞と非神経要素間の複雑な相互作用を伴います。彼らは適切な器官の環境を提供するため、皮質スライス外植片は、多くの場合、ニューロンの分化·発達を制御し、それらの相互作用を調べるために使用されます。有益なものの、スライス植モデルは異常な細胞積層および移行などの欠点に苦しむことができます。ここでは、皮質切片より準備が簡単で、一貫性のある器官の移行およびラミネーションを示す初期の皮質の発達についての研究のために全体の大脳半球の植​​システムについて報告する。このモデルシステムでは、初期のラミネーションと移行パターンは、preplate分割の期間を含め、in vitroでの 2日間にわたって、通常の前向き皮質層の間に6フォームを進みます。次に、 元の子宮内エレクトロポレーション（EUEP）を開発背内側皮質に開発ニューロンにGFPの発現を標的に〜80％の成功を実現したアプローチ。 全体の半球植モデルはエレクトロポレーション、薬理学的介入とライブイメージングアプローチのための初期の皮質発達にアクセスできるようになります。トランスフェクションおよび面積ターゲティング一貫性の両方を向上させながら、この方法では、 子宮内エレクトロポレーション（IUEP）アプローチで求められる生存の手術を回避することができます。この方法では、神経細胞の増殖、遊走および分化の実験的研究を促進するであろう。

げっ歯類の胚性皮質が発達期間を通して横neurogenetic勾配を示し、そのようなその横新皮質は、背内側皮質28よりも約1日より成熟している。 6層のニューロンの大部分はこのように横皮質でE12に（また、フィールド40 5と呼ばれる）とE13で背内側野（またフィールド1〜5と呼ばれる）で（S期の最終的なを示すIE）が生成されます。 Preplate分割は6層ニューロンの生成?...

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Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

このプロトコルは含ま改良植手順を説明<em&gt; EX子宮</em&gt;マウス胎児から全体の大脳半球のエレクトロポレーション、解剖や文化。準備が早い皮質開発中に遺伝子機能の薬理試験およびアッセイを容易にします。

exの子宮内エレクトロポレーションと全半球植：早期皮質の発達についての研究のための簡単な実験方法

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

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子宮内エレクトロポレーションは、皮質ニューロンのサブセットで、遺伝子機能の研究のために初代神経培養した

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

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マウス子宮内でエレクトロポレーション：制御時空間遺伝子導入

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

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使用して、マウス大脳皮質および海馬における可視化と樹状突起と棘の遺伝子操作<em&gt;子宮内で</em&gt;エレクトロポレーション

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

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局所トランスジェニックラットの発生により<em&gt;子宮内</em&gt;エレクトロポレーションおよび<em&gt;インビボ</em&gt;生物発光スクリーニング

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

解剖大脳皮質植で使用するための齧歯類の胚から脳脊髄液の分離

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

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皮質介在ニューロンのサブタイプ選択的エレクトロポレーション

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

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脳奇形の原因となる遺伝子を識別するアレイ CGH、全エキソーム配列と齧歯動物の子宮にエレクトロポレーションを組み合わせた新たな戦略

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

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子宮内エレクトロポレーションは、神経部分集団の興奮とシングルセルの接続を研究するためのアプローチ

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

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全細胞電圧クランプ記録のための電気生理学的方法<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;感光体

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

血液-脳関門の高分解能共焦点イメージング: イメージング、三次元、トランスサイトーシスの定量化

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...