Name: ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development
Uploaded: 2013-04-03T12:00:00
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이 작품은 NINDS (NS066071)과 NIAAA의 보조금을 지원했다. (P50AA017823) ECO합니다. 저자는 박사 로버트 퀸과 동물 보호를위한 실험실 동물 자원학과에서 직원을 감사드립니다. 우리는 여름 학부 연구원 (서핑) 등 지원, 기술 지원 니콜 Belletier을 저드슨 벨몬트 감사드립니다. 우리는 또한 의견 박사 데이비드 카메론 감사하고 원고의 이전 버전에 수정할 수 있습니다.

플라스미드 녹색 형광 단백질 표현 1. 예를 자궁에 Electroporations <ol><li> 플라스미드 DNA 주입 솔루션은 ddH 2 O.에서 0.33 MG / ML의 최종 작업 농도로 희석 편대의 편대장-eGFP DNA 27와 함께 준비가되어 있습니다 Qiagen 엔도 - 무료 맥시 - 최상의 상태로 준비가 변형 박테리아의 플라스미드를 정화하는 데 사용됩니다. ~ 0.02 % (w / V 최종)에서 고속 녹색 염료는 주입 추적과 DNA 솔루션에 ...

우리는 개선하고 실험 모델을 평가 한 - 전체 반구의 explants - 초기 대뇌 피질의 개발 연구를 (E13-E15). 모델은 대뇌 피질 25,37의 레이어 6 구성 흥분성의 신경 세포의 계보 (Lineage)의 이전과 차별화의 분석에 유용 입증되었습니다. 시스템의 주요 장점은 준비 간단하고, 뇌 발달의 초기, 중요한 기간 동안의 electroporation, 약리 조작 및 이미징을위한 뉴런 3) 실험 접속) 2) DIV에 대한 organotypic 성장, ...

연속 생성 뉴런의 공동 확산, 이전과 차별화를 통해 포유류의 대뇌 피질 양식. 각 신경 세포는 심실 구역 (VZ)에서 태어나 대뇌 피질 판 (CP) 1을 형성 중간 영역 (IZ)로 VZ에서 마이그레이션합니다.합니다 그들은 다른 대뇌 피질의 도메인을 통과으로, 마이그레이션 뉴런은 개발 조직 내의 세포 환경 및 기타 휴대 요소 (예 : 반경 glia)에 따라 마이그레이션 2,3의 여러 모드를 표시합니다. 대뇌 피질의 뉴런는 neuronal 마이그레이션 체포와 dendritogenesis (4)의 일치 과정에있는 성형 대뇌 피질 판의 상단에있는 마이그레이션을 체포. 대뇌 피질의 개발은 배아 일 원시 plexiform 계층 6 preplate (PP), 그 overlies VZ 선구자 뉴런의 층의 설립을 통해 11-13 (E11-13) 5 사이에 시작됩니다. 예기되는그런 다음 레이어 6 대뇌 피질의 뉴런 (VZ에서 태어난 즉, 첫 번째 대뇌 피질의 뉴런) 방향이 틀에 박힌 패턴의 somata와 PP 7 ~ 뚜렷한 층으로 뭉쳤다. 이러한 이벤트는 얕은 한계 (미래 대뇌 피질의 레이어 1)과 깊은 구역, subplate 세포 (과도 대뇌 피질의 레이어 7)로 구성 후자에 preplate를 나누었습니다. 이 과정은, preplate 분할이라고한다, 대뇌 피질 (8)의 미래 성장의 기초 행사입니다. 많은 유전자 변이는 대뇌 피질의 발달 9의 다양한 측면을 방해하는 확인되었습니다. 대뇌 피질의 개발은 또한 부정적인 등 코카인 10 술 11 등의 섭취 독소에 노출에 의해 영향을 수 있습니다. 개발하는 동안 발생하는 대뇌 피질의 기형은 신경 장애 (예 : 자폐증, 정신 분열증)에 가능성이 참여자 때문에, 대뇌 피질의 발달에 섭동의 경험적 조사는 고유 아르중요한 그겁니다. 그것은 유전이나 독소 효과의 빠른 assays을 허용뿐만 아니라 두뇌 개발 12이 초기 기간 동안 차별화 뉴런, 다른 세포 유형과 세포 외 기질 (ECM) 사이의 가능한 상호 작용을 보존 그 대뇌 피질의 개발을 공부하는 방법을 설정하는 데 상당한 중요성을 따라서입니다 . 슬라이스 explants 13 이러한 시스템을 제공하고 광범위하게 분석 대뇌 피질의 신경 세포 개발에 14-16로 사용되었습니다. 그러나, 슬라이스 assays는 neuronal 마이그레이션 및 적층이 가능 개발 뇌와 앵커 반경 glial 비계를 둘러싼 수막 세포에 손상으로 인해 17 이상이 될 수있는 단점으로 고생 할 수 있습니다. 레이디 얼 glial 섬유가 썰기하여 기저 얇은 판의 대뇌 피질의 신경 세포 이주 18 혼란의 중요한 기판 있으므로 로컬 반경 glial 아키텍처를 중단시키고 변경된 대뇌 피질의 마이그레이션 될 수 있습니다. 또한 SLI에게의explants의 ced 표면이 분야에서 ECM의 일반적인 구성을 변경할 수 있습니다 죽은 세포의 영역을 제공합니다. 최근 접근법은 적절한 건강 셀 유형 및 ECM으로 둘러싸여있는 통에 깊숙히 자리 세포에 자신의 분석을 집중하고 있습니다. 그러나 경우에 이러한 새로운 접근법은 슬라이스의 비교적 정상적인 내부는 분석 19-21에 사용할 수 있습니다 있도록 원래의 두꺼운 교양 슬라이스 고정 후 cryo-sectioned 또는 파라핀-sectioned 할 것을 요구 할 수 있습니다. 문화뿐만 아니라 분석을위한 고정 슬라이스의 후속 cryosectioning의 라이브 조각을 준비하는 sectioning 원래 vibratome 모두는 이러한 assays에 대한 관심과 노력이 작동해야합니다. 초기 대뇌 피질의 개발 연구 간단한 보완 접근 방식을 제공하기 위해, 우리는 초기 대뇌 피질의 개발 연구를 촉진하기 위해 기존 슬라이스 방식이 13으로 바뀌 었습니다. 우리는 대체를 개발65분 당 회전하고 16-18 시간 22,23에 대한 허용 organotypic 성장에 떨고 문화를 포함하여 기존 E14 전체 반구의 모델과 비슷한 OLE 반구의 explant 모델입니다. 우리의 접근 방식에 전체 반구의 explants은 48 시간에 organotypic 대뇌 피질의 성장을 확장하는 높은 산소 문화 분위기 21,24에서와 반 투과성 막 13에 표시됩니다. 이 방법은 또한 대뇌 피질의 뉴런을 개발 일관된 electroporation 할 수 있습니다. 태아는 자궁에서 제거 플라스미드 DNA를 소개 electroporated과 telencephalon 그 다음 해부되어 있습니다. 각 반구의 고립과 콜라겐 코팅 필터 안쪽면을 아래로 배치됩니다. explant 그런 다음 48 시간, preplate 분할 8 포함 기간 동안 배양하고 있습니다. 문화 기간 동안 L6 뉴런은 대뇌 피질 판에서 올바른 위치에 차별화 된 뉴런 25 일에 구체에서 개발할 수 있습니다. 이 기간 개발 전반에 걸쳐신경 세포는 생체의 해당 셀을 직면 것이다 적절한 ECM과 세포 유형으로 둘러싸여 있습니다. 이 시스템은 이미 에탄올 독성 26 층 6 형성과 preplate 분할 7,25를 기초 세포 사건을 해독에서 중요한 입증했다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name </td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 + GlutaMAX</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10565</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G5 Supplement 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17503-012</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Serum-Free Suppl. 50X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1504-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen / Strep Liquid 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 500 ml</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14025</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture insert collagen coated</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3492</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine skin gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9382</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7906</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX 830 Electroporator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer electrodes 10mm</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450166</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Billups Rothenberg</td>
			<td>MIC-101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (5 uL)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87930</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-04</td>
			<td>Specify 1" and style 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors Tough Cut 9 cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>14058-09</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development

대뇌 피질의 개발은 뉴런과 전구체 세포, 혈관, meninges 및 관련 세포 외 기질 등의 비 neuronal 요소들 간의 복잡한 상호 작용을 포함한다. 그들은 적절한 organotypic 환경을 제공하기 때문에, 대뇌 피질의 슬라이스 explants는 종종 neuronal 차별화 및 개발을 제어 이러한 상호 작용을 조사하는 데 사용됩니다. 이익이지만, 슬라이스 explant 모델은 비정상 세포 적층 및 마이그레이션 등의 단점으로 고생 할 수 있습니다. 여기 대뇌 피질의 조각과 쇼 일관 organotypic 마이그레이션 및 적층보다 준비하는 것이 더 쉽습니다 초기 대뇌 피질의 개발 연구 전체 대뇌 반구의 explant 시스템을보고합니다. 이 모델 시스템에서 초기 적층 및 마이그레이션 패턴, preplate 분할의 기간을 포함하여, 체외에서 2 일 동안 일반적으로 미래의 대뇌 피질 층 중 여섯 양식을 진행합니다. 우리는 전 자궁의 electroporation (EUEP)를 개발등쪽 내측 피질에서 개발 뉴런에 GFP 표현을 타겟팅 ~ 80 %의 성공을 달성 접근. 전체 반구의 explant 모델은 electroporation, 약리 개입 및 라이브 영상 방식의 접근이 초기 대뇌 피질의 개발을합니다. 이 방법은 transfection 및 면적 타겟 일관성을 모두 개선하면서 자궁 electroporation (IUEP) 접근 방식에서 요구 생존 수술을 방지합니다. 이 방법은 neuronal 확산, 이전과 차별화의 실험 연구를 촉진합니다.

배아 쥐 대뇌 피질의 발달 기간에 걸쳐 가로 neurogenetic 기울기를 전시 등 그 옆 네크로는 등쪽 내측 네크로 28 약 1 하루가 발전되어 있습니다. 레이어 6 뉴런의 일괄 따라서 측면 피질에 E12에 (또한 필드 40 5이라고도 함)과 E13의 등쪽 내측 피질 (또한 필드 1 5이라고도 함)에 (S-단계의 마지막을 전시 IE) 생성됩니다. Preplate 분류 레이어 6 신경 세포 생성 후 약 1 일 시작하...

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Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

이 프로토콜은 관련 개선 explant 절차를 설명합니다<em&gt; 예 자궁</em&gt; 배아 마우스에서 전체 대뇌의 electroporation, 해부 및 문화. 준비 초기 대뇌 피질의 개발 기간 동안 유전자 기능의 약리 연구와 assays을 용이하게한다.

예 자궁 Electroporation 및 전체 반구의 Explants : 초기 두피 개발 연구 간단한 실험 방법

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

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utero에서 Electroporation은 두피 뉴런의 하위 집합의 유전자 기능을 학습에 대한 기본의 연결을 문화 뒤에

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연구

신경과학

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사용하는 마우스 대뇌 피질과 해마의 시각화 및 Dendrites와 쪽이의 유전자 조작<em&gt; utero에서</em&gt; Electroporation

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