Name: ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development
Uploaded: 2013-04-03T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet tilskudd fra NINDS (NS066071) og Niaa. (P50AA017823) til ECO. Forfatterne takker Dr. Robert Quinn og ansatte ved Institutt for forsøksdyravdelinger Ressurser for dyr omsorg. Vi takker Judson Belmont for teknisk støtte, Nicole Belletier for bistand som en sommer Undergraduate Research Fellow (SURF). Vi vil også takke Dr. David Cameron for kommentarer og endringer på en tidligere versjon av manuskriptet.

1. Tidligere utero Electroporations med grønt fluorescerende protein ekspresjonsplasmid <ol><li> Plasmid DNA injeksjonsoppløsninger er forberedt med CAG-eGFP DNA 27 fortynnet til den endelige arbeidskonsentrasjon på 0,33 mg / ml i DDH 2 O. Qiagen Endo-Free Maxi-preps brukes til å rense plasmid fra transformerte bakterier. Rask grønt fargestoff ved ~ 0,02% (w / v final) tilsettes til DNA-løsningen som en injeksjon tracer. </li><li> For å forberede den kirurgiske området, spyl benk...

Vi har forbedret og evaluert en eksperimentell modell - hele halvkule explants - for studiet av tidlig kortikal utvikling (E13-E15). Modellen har vist seg nyttig for analyse av migrering og differensiering av den eksitatoriske nervecellen avstamning som utgjør sjikt 6 av hjernebarken 25,37. Prinsippet fordelene med systemet er 1) organotypic vekst for 2 DIV, 2) enkelhet forberedelse, og 3) eksperimentell tilgang til nervecellene for elektroporering, farmakologisk manipulasjon og avbildning i denne tidlige, k...

De pattedyr hjernebarken former gjennom felles proliferasjon, migrasjon og differensiering av suksessivt generert nevroner. Hvert nevron er født i ventrikulær sone (VZ) og vandrer fra den VZ i overgangssone (IZ), danner kortikale plate (CP) 1. Når de passerer gjennom ulike kortikale domener, de trekkende nevroner vise flere moduser av migrasjon 2,3 som er avhengige av det ekstracellulære miljøet og andre cellulære elementer (f.eks radial gliaceller) innen utvikling vev. Kortikale nevroner deretter arrestere migrasjon øverst formingspartiet kortikale plate i sammenfallende prosesser av neuronal migrasjon arrest og dendritogenesis 4. Kortikal utvikling initieres mellom embryonale dager 11-13 (E11-13) 5 gjennom etablering av den opprinnelige plexiform lag 6 eller preplate (PP), et lag av pioneer nevroner som ligger over VZ. Prospektivlag 6 kortikale nevroner (dvs. de første kortikale nevroner født i VZ) og deretter orientere sin somata i et stereotypt mønster og vokser sammen til en distinkt lag i PP 7. Disse hendelsene delt preplate inn en overfladisk marginal (fremtidig kortikale lag 1) og en dyp sone, sistnevnte består av subplate celler (forbigående kortikale lag 7). Denne prosessen, kalt preplate splitting, er en grunnleggende hendelse i den fremtidige veksten av hjernebarken 8. Mange genetiske mutasjoner har blitt identifisert som forstyrrer ulike aspekter ved kortikal utvikling 9. Kortikal utvikling kan også bli negativt påvirket av eksponering for inntatte giftstoffer som kokain 10 og alkohol 11. Fordi kortikale misdannelser som oppstår under utviklingen er sannsynlig bidragsytere til nevrologiske lidelser (f.eks autisme, schizofreni), empiriske undersøkelser av forstyrrelser til hjernebarken er iboendely viktig. Det er derfor av stor betydning å etablere metoder for å studere kortikal utvikling som tillater raske analyser av genetiske eller toksin effekter, men som også bevare de mulige interaksjoner mellom differensierende nevroner, andre celletyper og ekstracellulære matrix (ECM) under denne tidlige perioden av hjernens utvikling 12 . Slice explants 13 har gitt et slikt system, og har vært mye brukt til analysen kortikale nevroner utvikling 14-16. Imidlertid kan slice analyser lider ulempe at neuronal migrasjon og laminering kan være unormal 17 muligens på grunn av skader på meningeal celler som omgir hjerne i utvikling og feste radial glial stillaset. Som radial glial fiber er en viktig substrat for cortical neuron migrasjon 18 forstyrrelse av basal lamina ved å skjære kan lokalt forstyrre radial glial arkitektur og føre til endret cortical migrasjon. I tillegg SLICED flater eksplanter gir en region av døde celler som kan endre normal sammensetning av ECM i disse områdene. Nyere tilnærminger har fokusert sin analyse på celler lokalisert dypt i sektoren som er omgitt av egnede sunne celletyper og ECM. Imidlertid, i noen tilfeller disse nyere tilnærmingene kan kreve at den opprinnelige tykk cultured skive være Cryo-seksjonert eller parafin-delt etter fiksering slik at forholdsvis normal indre av stykket er gjort tilgjengelig for analyse 19-21. Både den opprinnelige vibratome seksjonering å forberede live skiver for kultur samt påfølgende cryosectioning av faste skiver for analyse krever omsorg og innsats for disse analysene for å fungere. Å gi en enkel, utfyllende tilnærming for studier av tidlig kortikal utvikling, har vi endret en eksisterende slice tilnærminger 13 til rette for studier av tidlig kortikal utvikling. Vi har utviklet en whole halvkule eksplantering modell lik en eksisterende E14 hele halvkule modell som er involvert risting kulturer på 65 omdreininger i minuttet og tillatt organotypic vekst for 16-18 hr 22,23. I vår tilnærming, er hele halvkule eksplanter plassert på semi-permeabel membran 13 med i en høy oksygen kultur atmosfære 21,24 å utvide organotypic kortikal vekst i 48 timer. Denne tilnærmingen gjør det også for konsekvent electroporation for å utvikle kortikale nevroner. Embryoene fjernes fra livmoren og electroporated å introdusere plasmid DNA og telencephalon deretter dissekert. Hver halvkule er isolert og plassert medial side ned på en kollagen-belagt filter. Den eksplantasjon blir deretter dyrket i et tidsrom på 48 timer, en periode som omfatter preplate splitting 8. Under kulturperiode, L6 neurons utvikles fra forløper til differensiert 25 nevron, fullstendig plassert innenfor kortikale plate. Gjennom denne perioden utviklernevron er omgitt av den aktuelle ECM og celletyper som ville konfrontere tilsvarende celle in vivo. Dette systemet har allerede vist verdifulle i å tyde den cellulære hendelser som ligger til grunn etanol toksisitet 26, 6 lag dannelse og preplate 7,25 splitting.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name </td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 + GlutaMAX</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10565</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G5 Supplement 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17503-012</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Serum-Free Suppl. 50X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1504-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen / Strep Liquid 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 500 ml</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14025</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture insert collagen coated</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3492</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine skin gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9382</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7906</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX 830 Electroporator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer electrodes 10mm</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450166</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Billups Rothenberg</td>
			<td>MIC-101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (5 uL)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87930</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-04</td>
			<td>Specify 1" and style 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors Tough Cut 9 cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>14058-09</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development

Kortikal utvikling involverer komplekse interaksjoner mellom nevroner og ikke-nevronale elementer inkludert forløper celler, blodårer, hjernehinnene og tilhørende ekstracellulære matrix. Fordi de gir et egnet organotypic miljø, er kortikale slice explants ofte brukt til å undersøke disse interaksjoner som styrer neuronal differensiering og utvikling. Selv gunstig, kan stykket eksplantering modellen lider ulemper inkludert avvikende mobilnettet laminering og migrasjon. Her rapporterer vi en hel cerebral halvkule eksplantering system for studier av tidlig kortikal utvikling som er enklere å tilberede enn kortikale skiver og viser konsekvent organotypic migrasjon og laminering. I denne modellen system, tidlig laminering og migrasjonsmønstrene fortsette som normalt i en periode på to dager in vitro, inkludert perioden preplate splitting, der prospektiv kortikale lag seks former. Vi utviklet en ex utero electroporation (EUEP)tilnærming som oppnår ~ 80% suksess i målretting GFP uttrykket til nevroner utvikling i rygg medial cortex. Hele halvkule eksplantering modellen gjør tidlig kortikal utvikling tilgjengelig for electroporation, farmakologisk intervensjon og sanntidsavbildning tilnærminger. Denne metoden unngår overlevelse kirurgi kreves av i utero electroporation (IUEP) tilnærminger samtidig forbedre både transfeksjon og areal målretting konsistens. Denne metoden vil lette eksperimentelle studier av neuronal proliferasjon, migrasjon og differensiering.

Embryonale gnager cortex viser en tverrgående neurogenetic gradient gjennom hele utviklingsperioden, er slik at lateral neocortex ca 1 dag mer moden enn dorsal medial neocortex 28. Hoveddelen av laget 6 nevroner dermed generert (dvs. oppviser sin endelige S-fase) på E12 i lateral cortex (også kalt Field 40 5) og ved E13 i dorsal medial cortex (også kalt Felt 1 5). Preplate splitting begynner ca 1 dag etter lag 6 neuron generasjon og dermed startes i den laterale cortex på E...

Watch this Scientific Journal Video about Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development at JoVE.com

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Denne protokollen beskriver en forbedret eksplantering prosedyre som innebærer<em&gt; Ex utero</em&gt; Electroporation, disseksjon og kultur hele cerebral halvkuler fra embryonale mus. Utarbeidelse forenkler farmakologiske studier og analyser av gen-funksjon under tidlig kortikal utvikling.

Ex utero Electroporation og Whole halvkule explants: A Simple Experimental Method for studier av tidlig kortikal utvikling

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualisering og genetisk manipulering av dendritter og pigger i Mus hjernebarken og hippocampus hjelp<em&gt; I fosterlivet</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Generering av Topically Transgene Rats etter<em&gt; I utero</em&gt; Electroporation og<em&gt; In vivo</em&gt; Bioluminesens Screening

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

Isolering av spinalvæske fra Rodent embryo for bruk med dissekert Cerebral Kortikale explants

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

Subtype-selektiv Electroporation av Cortical interneuroner

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

En ny strategi kombinerer matrise-CGH, hel-exome sekvensering og In Utero Electroporation i Red for å identifisere forårsaker gener for hjerne misdannelser

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

I Utero Electroporation Tilnærminger til Studer Excitability av neuronal subpopulasjoner og Single-celle Tilkobling

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Elektrofysiologisk metode for helcelle spenningsklemmeopptak fra<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotoreseptorer

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

Høyoppløselig AC Confocal avbildning av blod - hjerne barrieren: bildebehandling, 3D rekonstruksjon og kvantifisering av Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...