Name: ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development
Uploaded: 2013-04-03T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами от NINDS (NS066071) и NIAAA. (P50AA017823) в ОЭС. Авторы выражают благодарность д-р Роберт Куинн и персонала в отделе лабораторных животных ресурсов для ухода за животными. Мы благодарим Джадсон Belmont технической поддержки, Николь Belletier для помощи в летние Бакалавриат научный сотрудник (SURF). Мы также благодарим д-р Дэвид Кэмерон комментарии и изменения на более раннюю версию рукописи.

1. Ex внутриутробно Electroporations с зеленого флуоресцентного белка выражения плазмиды <ol><li> Плазмида растворы для инъекций ДНК готовятся с CAG-EGFP ДНК 27 разбавляется до конечной рабочей концентрации 0,33 мг / мл в DDH 2 O. Qiagen Endo-Free Maxi-Preps используется для очистки плазмид из трансформ...

Мы улучшили и оценка экспериментальной модели - все эксплантов полушарие - для изучения раннего развития коры (E13-E15). Модель оказалась полезной для анализа миграции и дифференциации возбуждающих нейронов линии, что составляет слой 6 коры головного мозга 25,37. Принцип преимуществам?...

Млекопитающих мозговой коры форм на основе согласованных пролиферации, миграции и дифференцировки последовательно генерируются нейронов. Каждый нейрон родился в вентрикулярной зоне (VZ) и мигрирует из VZ в промежуточной зоны (ИЗ), образуя кортикальной пластинки (CP) 1. Как они проходят через различные корковых областей, мигрирующие нейроны отображать несколько режимов миграции 2,3, что зависит от внеклеточной среды и других клеточных элементов (например, радиальной глии) в развивающиеся ткани. Корковых нейронов затем арестовать миграции в верхней части формирования кортикальной пластинки в совпадающие процессы нейронов арест миграции и дендритогенез 4. Кортикальные развития, начатый между эмбриональными дней 11-13 (E11-13) с 5 по созданию первичного слоя плексиформные 6 или preplate (PP), слой пионером нейронов, которые перекрывает VZ. Перспективныйслой 6 корковых нейронов (т.е. первый корковых нейронов родился в VZ), то ориентировать свои somata в стереотипные модели и сливаются в различных слоя в пределах PP 7. Эти события разделили preplate в поверхностном предельные (будущий корковый слой 1) и глубоководной зоны, последняя состоит из плите клетки (переходные коркового слоя 7). Этот процесс, называемый preplate расщепления, является основополагающим событием в будущем рост коры головного мозга 8. Многие генетические мутации были идентифицированы, которые нарушают различные аспекты развития коры 9. Развития коры также может быть негативное влияние воздействия попадании токсинов, таких как кокаин, алкоголь 10 и 11. Потому что корковые пороки развития, возникающие в процессе развития, скорее всего, вклад в неврологических расстройств (например, аутизм, шизофрения), эмпирические исследования возмущения развития коры присущиют важное. В связи с этим большое значение для создания подходы к изучению развития коры, которые позволяют быстрое анализы генетических или токсин эффекты, но которые также сохранение возможных взаимодействий между дифференциации нейронов, другие типы клеток и внеклеточного матрикса (ECM) в этот ранний период развития мозга 12 . Slice эксплантов 13 из которых условии, что такая система и была широко используется для анализа развития коры нейрон 14-16. Тем не менее, часть анализов могут страдать от недостатка, что миграцию нейронов и ламинирования может быть ненормальной 17 возможно, связано с повреждением менингеальных клетки, которые окружают развивающегося мозга и якорь радиальной глии эшафот. Как волокон радиальной глии являются важным субстратом для корковых нейронов миграции 18 нарушения базальной пластинки, нарезая может локально нарушить радиальной глии архитектуры и привести к изменению корковых миграции. Кроме того SLIКНИ поверхности эксплантов предоставляет региона мертвых клеток, которые могут изменить нормальный состав ECM в этих областях. Более поздние подходы были сосредоточены на анализе клеток, расположенных в глубине среза, которые окружены соответствующей здорового типов клеток и ECM. Тем не менее, в некоторых случаях эти новые подходы могут требовать, чтобы оригинал толстый культурный срез быть крио-секционного или парафин-секционного после фиксации, так что относительно нормальный интерьер кусочек становятся доступными для анализа 19-21. Оба оригинальных vibratome секционирования для подготовки живых ломтиками для культуры, а также последующее cryosectioning основных срезы для анализа требуют ухода и усилий для этих анализов, чтобы работать. Для обеспечения простого, взаимодополняющий подход для исследования ранней развития коры, мы изменили существующие подходы кусочек от 13 до содействия исследованиям раннего развития коры. Мы разработали WHоле полушарии эксплантов модель похожа на существующие модели E14 целом полушарии, участвующих встряхивания культур на 65 оборотов в минуту и позволил органотипических рост в течение 16-18 ч 22,23. В нашем подходе целый эксплантов полушарии расположены на полупроницаемую мембрану 13 с в атмосфере высокой культуры кислорода 21,24 расширить органотипических корковых роста в течение 48 часов. Этот подход также позволяет последовательно электропорации развития корковых нейронов. Эмбрионы удаляют из матки и электропорации введения плазмидной ДНК и конечного мозга, затем расчленены. Каждое полушарие изолирован и помещен медиальной стороне вниз по коллагена покрытием фильтра. Эксплантов затем культивировали в течение 48 часов, период, который охватывает preplate расщепление 8. Во время периода культивирования, L6 нейроны развиваются из предшественников нейронов, чтобы дифференцировать 25, правильно расположены в кортикальной пластинки. В этот период развиваетсянейрон окружен соответствующей ECM и типы клеток, которые противостоят соответствующие клетки в живом организме. Эта система уже доказала ценным в расшифровке клеточных событий, которые лежат в основе этанола токсичность 26, слой 6 формирования и preplate расщепления 7,25.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name </td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 + GlutaMAX</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10565</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G5 Supplement 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17503-012</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Serum-Free Suppl. 50X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1504-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen / Strep Liquid 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 500 ml</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14025</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture insert collagen coated</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3492</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine skin gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9382</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7906</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX 830 Electroporator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer electrodes 10mm</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450166</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Billups Rothenberg</td>
			<td>MIC-101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (5 uL)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87930</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-04</td>
			<td>Specify 1" and style 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors Tough Cut 9 cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>14058-09</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development

Кортикальные развития предполагает сложное взаимодействие между нейронами и не-нейрональных элементов, включая клетки-предшественники, кровеносных сосудов, мозговых оболочек и связанных с ними внеклеточного матрикса. Потому что они предоставляют подходящую органотипических окружающей среды, корковой эксплантов срез часто используются, чтобы исследовать те взаимодействия, которые контролируют дифференцировку нейронов и развития. Хотя полезно, модель срез эксплантов могут страдать от недостатка том числе аберрантных сотовой ламинирования и миграции. Здесь мы приводим все системы мозгового полушария эксплантов для изучения раннего развития коры, которое легче подготовить, чем кортикальные ломтиками и показывает последовательное органотипических миграции и ламинирование. В этой модели система раннего ламинирования и миграции проходят нормально в течение двух дней в пробирке, включая период preplate расщеплению, в ходе которой предполагаемый кортикальный слой шесть форм. Затем мы разработали бывшего электропорации внутриутробно (EUEP)Подход, который достигает ~ 80% успеха в планировании GFP выражение для развивающихся нейронов в спинном медиальная кора. Вся модель эксплантов полушарие делает раннего развития коры доступными для электропорации, фармакологическое вмешательство и живой подходы изображений. Этот метод позволяет избежать выживание операции требуется внутриутробно электропорации (IUEP) подходов при одновременном повышении и трансфекции и площадные таргетинга консистенции. Этот метод будет способствовать экспериментальных исследований нейронов пролиферации, миграции и дифференциации.

Эмбриональных грызунов кора обладает поперечного градиента нейрогенного всему периоду развития, такие, что боковые коры головного мозга составляет приблизительно 1 день более зрелым, чем спинной медиальная кора головного мозга 28. Большая часть нейронов слоя 6, таким образом, ген...

Watch this Scientific Journal Video about Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development at JoVE.com

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Этот протокол описывает улучшенную процедуру эксплантов, что включает в себя<em&gt; Экс внутриутробно</em&gt; Электропорации, рассечение и культуры целых полушарий головного мозга из эмбриональных мыши. Подготовка облегчает фармакологических исследований и анализов функции гена в начале развития коры.

Экс внутриутробно электропорации и всего Экспланты полушарии: Простой экспериментальный метод исследования раннего развития коры

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

Внутриутробное Электропорация последующей первичной нейронов культуры для изучения функции генов в Подмножество корковых нейронов

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Мышь В утробе матери Электропорация: Пространственно-временные Контролируемые трансфекции генов

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Визуализация и генетических манипуляций дендритов и шипы в мышь коры головного мозга и гиппокамп использования<em&gt; Внутриутробное</em&gt; Электропорация

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Генерация Тематически трансгенных крыс<em&gt; В утробе матери</em&gt; Электропорацию и<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Биолюминесценция Скрининг

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

Изоляция цереброспинальной жидкости из грызунов эмбрионов для использования с расчлененный коры головного мозга Экспланты

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

Класс-селективный Электропорация корковых интернейронов

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Новые стратегии, сочетающей массив CGH, всего exome последовательности и в утробе матери электропорации грызунов для выявления причинных генов для пороки развития головного мозга

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

В Utero Электропорация подходы к изучению возбудимости нейрональных субпопуляциях и Connectivity одноклеточные

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Электрофизиологический метод записи цельного клеточного напряжения<em&gt; Drosophila</em&gt; Фоторецепторы

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

Высоким разрешением конфокальная томография Blood - brain барьер: Визуализация, 3D-реконструкции и количественной оценки Трансцитоз

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...