Name: ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development
Uploaded: 2013-04-03T12:00:00
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Este trabajo recibió el apoyo de subvenciones (NINDS NS066071) y el NIAAA. (P50AA017823) a ECO. Los autores agradecen al Dr. Robert Quinn y el personal del Departamento de Recursos Animales de laboratorio para el cuidado de los animales. Damos las gracias a Judson Belmont para el apoyo técnico, Nicole Belletier de asistencia como miembro de Verano de Investigación de Pregrado (SURF). También agradecemos al Dr. David Cameron y edita los comentarios sobre una versión anterior del manuscrito.

1. Electroporaciones Ex utero con Expression proteína verde fluorescente plásmido <ol><li> Plásmido de ADN soluciones de inyección se preparan con CAG-eGFP ADN 27 diluido a la concentración de trabajo final de 0,33 mg / ml en ddH 2 O. Qiagen Endo-gratis-Maxi Preps se utilizan para purificar el plásmido a partir de bacterias transformadas. Colorante verde rápido en ~ 0,02% (w / v final) se añade a la solución de ADN como un trazador de inyección. </li><li> Para preparar el área...

Hemos mejorado y evaluó un modelo experimental - explantes enteros hemisferio - para el estudio del desarrollo cortical temprano (E13-E15). El modelo ha demostrado ser útil para el análisis de la migración y la diferenciación del linaje neurona excitatoria que constituye la capa 6 de la corteza cerebral 25,37. Las principales ventajas del sistema son: 1) el crecimiento organotípico para DIV 2, 2) la sencillez de la preparación, y 3) el acceso experimental a las neuronas para la electroporación, la man...

Las formas de la corteza cerebral de mamíferos a través de la proliferación concertada migración y diferenciación de las neuronas generadas sucesivamente. Cada neurona nace en la zona ventricular (VZ) y migra desde el VZ en la zona intermedia (IZ), formando la placa cortical (CP) 1. A medida que pasan a través de diferentes dominios corticales, las neuronas que migran mostrar múltiples modos de migración 2,3 que dependen del ambiente extracelular y otros elementos celulares (por ejemplo, la glía radial) dentro del tejido en desarrollo. Las neuronas corticales entonces detener la migración en la parte superior de la placa de conformación cortical en los procesos coincidentes de detención migración neuronal y 4 dendritogenesis. Desarrollo cortical se inicia entre días embrionarias 11-13 (E11-13) 5 mediante el establecimiento de la capa plexiforme primordial 6 o la presiembra (PP), una capa de neuronas pioneras que recubre el VZ. FuturoCapa 6 neuronas corticales (es decir, las neuronas corticales primero nacido en el VZ) y luego orientar su Somata en un patrón estereotipado y se unen en una capa distinta en el PP 7. Estos eventos dividir la presiembra en un superficial marginal (futura capa cortical 1) y una zona profunda, el segundo compuesto de células subplaca (capa cortical transitoria 7). Este proceso, denominado fraccionamiento presiembra, es un acontecimiento fundamental en el crecimiento futuro de la corteza cerebral 8. Muchas mutaciones genéticas se han identificado que interrumpir diversos aspectos del desarrollo cortical 9. Desarrollo cortical también pueden sufrir efectos negativos por la exposición a las toxinas ingeridas como la cocaína y el alcohol 10 11. Debido a las malformaciones corticales que surgen durante el desarrollo probablemente contribuyen a los trastornos neurológicos (por ejemplo, el autismo, la esquizofrenia), las investigaciones empíricas de las perturbaciones del desarrollo cortical son inherentesmente importante. Por tanto, es de gran importancia para establecer enfoques para estudiar el desarrollo cortical que permiten ensayos rápidos de los efectos genéticos o toxina, pero que también preservar las posibles interacciones entre las neuronas diferenciadoras, otros tipos de células y la matriz extracelular (ECM) durante este período temprano del desarrollo del cerebro 12 . Explantes rebanada 13 han proporcionado un sistema y han sido ampliamente utilizados para el desarrollo del ensayo neurona cortical 14-16. Sin embargo, los ensayos de rebanada puede adolecen del inconveniente de que la migración neuronal y la laminación puede ser anormal 17 posiblemente debido al daño a las células de las meninges que rodean el cerebro en desarrollo y el anclaje radial glial andamiaje. Como las fibras gliales radiales son un importante sustrato para la migración cortical neuronal 18 disrupción de la membrana basal por corte local puede alterar la arquitectura glial radial y causar la migración cortical alterada. Además el sliced superficies de explantes proporciona una región de células muertas que pueden alterar la composición normal de la ECM en estas áreas. Los enfoques más recientes se han centrado su análisis en células localizadas profundamente en el sector que están rodeados de apropiados tipos de células sanas y ECM. Sin embargo, en algunos casos, estos nuevos enfoques pueden exigir que el original rebanada gruesa cultivadas ser crio-seccionado o seccionado en parafina después de la fijación de manera que el interior relativamente normal de la rebanada está disponible para el análisis 19-21. Tanto el vibratome original de seccionamiento para preparar las rodajas en vivo para el cultivo, así como la posterior de las rebanadas cryosectioning fijos para el análisis requieren un cuidado y esfuerzo para estos ensayos a trabajar. Proporcionar un enfoque simple y complementaria para los estudios del desarrollo cortical temprano, hemos modificado una rebanada enfoques existentes 13 para facilitar los estudios del desarrollo cortical temprano. Hemos desarrollado un whhemisferio ole explante similar a un modelo existente E14 hemisferio que participan cultivos con agitación a 65 revoluciones por minuto y el crecimiento organotípico permitido para 16-18 horas 22,23 modelo. En nuestro enfoque, los explantes enteros hemisferio se colocan en la membrana semipermeable 13 con en una atmósfera de oxígeno alta cultura 21,24 para extender el crecimiento cortical organotípicos durante 48 horas. Este enfoque también permite la electroporación coherente de desarrollo de las neuronas corticales. Los embriones se extrae del útero y electroporación para introducir ADN plásmido y el telencéfalo es diseccionado a continuación. Cada hemisferio se aísla y se colocan lado medial hacia abajo sobre un filtro revestido con colágeno. El explante se cultivan entonces durante un período de 48 horas, un periodo que abarca dividir la presiembra 8. Durante el período de cultivo, L6 neuronas se desarrollan a partir de precursor a diferenciarse neurona 25, en posición correcta dentro de la placa cortical. A lo largo de este período, el desarrolloneurona está rodeado por el ECM apropiada y tipos de células que se enfrentaría la celda correspondiente en vivo. Este sistema ya ha demostrado su valía en el desciframiento de los eventos celulares que subyacen a la toxicidad del etanol 26, capa 6 y formación presiembra división 7,25.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name </td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 + GlutaMAX</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10565</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G5 Supplement 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17503-012</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Serum-Free Suppl. 50X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1504-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen / Strep Liquid 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 500 ml</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14025</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture insert collagen coated</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3492</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine skin gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9382</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7906</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX 830 Electroporator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer electrodes 10mm</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450166</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Billups Rothenberg</td>
			<td>MIC-101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (5 uL)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87930</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-04</td>
			<td>Specify 1" and style 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors Tough Cut 9 cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>14058-09</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development

Desarrollo cortical implica interacciones complejas entre las neuronas y no neuronales elementos incluyendo células precursoras, los vasos sanguíneos, las meninges y la matriz extracelular asociada. Debido a que proporcionan un entorno adecuado organotípico, los explantes corticales rebanada se utilizan a menudo para investigar las interacciones que controlan la diferenciación neuronal y el desarrollo. Aunque es beneficioso, el modelo de explante rebanada puede sufrir de inconvenientes que incluyen la laminación celular aberrante y la migración. Aquí mostramos un todo sistema cerebral explante hemisferio para estudios de desarrollo temprano cortical que es más fácil de preparar que las rebanadas corticales y programas de migración coherente organotípico y laminación. En este modelo de sistema, laminación principios y patrones de migración continuará normalmente durante un período de dos días in vitro, incluido el período de dividir la presiembra, durante el cual la capa cortical prospectivo seis formas. Desarrollamos entonces un ex electroporación in utero (EUEP)enfoque que logra el éxito ~ 80% en la selección de buenas prácticas agrarias expresión en las neuronas en desarrollo en la corteza medial dorsal. El modelo de explante hemisferio entero hace que el desarrollo temprano cortical accesible para la electroporación, la intervención farmacológica y enfoques en vivo de imágenes. Este método evita la cirugía supervivencia requeridos en el útero de la electroporación (IUEP) enfoques al tiempo que mejora tanto la transfección y la consistencia de área de focalización. Este método facilitará los estudios experimentales de la proliferación neuronal migración y diferenciación.

La corteza de embriones de roedores exhibe un gradiente transversal neurogenético durante todo el período de desarrollo, de manera que neocórtex lateral es de aproximadamente 1 día más maduro que dorsal medial neocórtex 28. El grueso de la capa 6 neuronas se generan en (es decir, exhiben su final de la fase S) en E12 en la corteza lateral (también llamado campo 40 5) y en E13 en la corteza medial dorsal (también llamado campo 1 5). Dividir la presiembra se inicia aproxim...

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Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Este protocolo describe un procedimiento de explante mejorada que implica<em&gt; Ex utero</em&gt; Electroporación, la disección y la cultura de la totalidad de los hemisferios cerebrales del ratón embrionario. La preparación facilita los estudios farmacológicos y ensayos de la función de genes durante el desarrollo cortical temprano.

Ex utero electroporación y explantes enteros hemisferio: un método simple Experimental de Estudios del Desarrollo Cortical Temprana

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

En el útero de electroporación seguido por cultivos neuronales primarias para estudiar la función génica en el subconjunto de neuronas corticales

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Investigación

Neurociencias

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

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In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

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La visualización y la manipulación genética de las dendritas y espinas en la corteza cerebral y el hipocampo del ratón usando<em&gt; En el útero</em&gt; La electroporación

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

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Generación de ratas transgénicas por vía tópica<em&gt; En el útero</em&gt; La electroporación y<em&gt; En vivo</em&gt; Detección bioluminiscencia

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Aislamiento de líquido cefalorraquídeo de embriones de roedores para su uso con disecados explantes cortical cerebral

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-Subtipo selectivo electroporación de interneuronas corticales

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