Name: ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development
Uploaded: 2013-04-03T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development at JoVE.com

Detta arbete stöddes bidrag från NINDS (NS066071) och NIAAA. (P50AA017823) ECO. Författarna tackar Dr Robert Quinn och personalen på avdelningen av försöksdjur resurser för djurvård. Vi tackar Judson Belmont för teknisk support, Nicole Belletier för hjälp som en sommar Grundutbildning Research Fellow (SURF). Vi tackar också Dr David Cameron för kommentarer och ändringar på en tidigare version av manuskriptet.

1. Ex utero-elektroporeringar med grönt fluorescerande protein expressionsplasmid <ol><li> Plasmid DNA injektionslösningar bereds med CAG-EGFP-DNA 27 späddes till den slutliga bearbetning koncentrationen 0,33 mg / ml i DDH 2 O. Qiagen Endo-Free Maxi-Preps används för att rena plasmiden från transformerade bakterier. Snabb grönt färgämne på ~ 0,02% (vikt / volym slutlig) sättes till DNA-lösningen som en injektion spårämne. </li><li> För att förbereda operationsområdet, sp...

Vi har förbättrat och utvärderat en experimentell modell - hela halvklotet explantaten - för att studera tidiga kortikal utveckling (E13-E15). Modellen har visat sig användbar för analys av migration och differentiering av den excitatoriska neuron härstamning som utgör lagret 6 av hjärnbarken 25,37. De principiella fördelarna med systemet är 1) organotypisk tillväxt för 2 DIV 2) enkelhet i framställning, och 3) experimentell tillgång till neuroner för elektroporering, farmakologisk manipulatio...

De däggdjur hjärnbarken former genom samordnade tillväxt, migration och differentiering av successivt genererade neuroner. Varje neuron är född i den ventrikulära zonen (VZ) och migrerar från VZ in den mellanliggande zonen (IZ), som bildar den kortikala plattan (CP) 1. När de passerar genom olika kortikala områden, de migrerande nervceller uppvisar flera former av migration 2,3 som är beroende av den extracellulära miljön och andra cellulära element (t.ex. radial Glia) inom utveckling vävnaden. Kortikala neuroner arrestera sedan migration på toppen av formande kortikala plattan i de sammanfallande processer för neuronal migrering och gripande dendritogenesis 4. Kortikal utveckling initieras mellan embryonala dagar 11-13 (E11-13) 5 genom etablering av ursprungliga plexiform lagret 6 eller preplate (PP), ett lager av pionjär nervceller som ligger över VZ. Blivandelager 6 kortikala neuroner (dvs. de första kortikala neuron födda i VZ) sedan inrikta sin somata i en stereotyp mönster och smälter samman till ett distinkt skikt i PP 7. Dessa händelser dela preplate i en ytlig marginell (framtida kortikal lager 1) och en djup zon, den senare består av plattmontering celler (övergående kortikal lager 7). Denna process, som kallas preplate delning, är en grundläggande händelse i framtida tillväxt av hjärnbarken 8. Många genetiska mutationer har identifierats som stör olika aspekter av kortikal utveckling 9. Kortikal utveckling kan också påverkas negativt av exponering för intagna toxiner som kokain 10 och alkohol 11. Eftersom kortikala missbildningar som uppstår under utvecklingen är sannolikt bidrar till neurologiska sjukdomar (t.ex. autism, schizofreni), empiriska undersökningar av störningar till kortikalt utveckling är inneboendely viktigt. Det är därför av stor betydelse för att fastställa metoder för att studera kortikal utveckling som tillåter snabba analyser av genetiska eller toxin effekter men som också bevarar de möjliga interaktioner mellan differentiering nervceller, andra celltyper och extracellulär matrix (ECM) under denna tidiga period av hjärnans utveckling 12 . Slice explantat 13 har tillhandahållit ett sådant system och har ofta använts för att analysera kortikal neuron utveckling 14-16. Emellertid kan slice analyser har den nackdelen att den neuronala migration och laminering kan vara onormal 17 möjligen på grund av skador på de meningeala celler som omger den växande hjärnan och förankra radiella gliaceller ställningen. Som radiella gliaceller fibrer är en viktig substrat för kortikal neuron migration 18 avbrott i basala lamina genom skärning kan lokalt störa radiell glia arkitektur och leda till förändrad kortikal migration. Dessutom SLICED ytor explantat tillhandahåller ett område av döda celler som kan ändra den normala sammansättningen av ECM i dessa områden. Nyare försök har fokuserat sin analys på celler belägna djupt i segment som är omgivna av lämpliga friska celltyper och ECM. I vissa fall kan dessa nyare metoder kan kräva att den ursprungliga tjocka odlade skiva vara kryo-delad eller paraffin-delad efter fixering så att den relativt normal inre skivan görs tillgänglig för analys 19-21. Både den ursprungliga vibratome sektionering att förbereda levande segment för kultur samt den efterföljande cryosectioning fasta skivor för analys kräver vård och ansträngning för dessa analyser ska fungera. För att ge en enkel, kompletterande strategi för studier av tidig kortikal utveckling har vi ändrat en befintlig skiva närmar 13 för att underlätta studier av tidig kortikal utveckling. Vi har utvecklat en whOle halvklotet explantat modell som liknar en befintlig E14 hela hemisfären modell som involverade skakar kulturer vid 65 varv per minut och får organotypisk tillväxt för 16-18 timmar 22,23. I vår metod, är hela hemisfären explantat placerades på semipermeabelt membran 13 med i en hög syre-kultur atmosfär 21,24 att sträcka organotypisk kortikal tillväxt under 48 timmar. Detta tillvägagångssätt möjliggör också konsekvent elektroporering utveckla kortikalneuroner. Embryona avlägsnas från livmodern och elektroporerades att introducera plasmid-DNA och telencefalon därefter dissekeras. Varje hemisfär isoleras och placeras mediala sidan nedåt på en kollagen-belagda filtret. Explantatet odlas sedan under en period av 48 timmar, en period som omfattar preplate uppdelning 8. Under kultur perioden L6 neuroner utvecklas från prekursor till differentierade neuron 25, rätt positionerad i kortikala plattan. Under hela denna period utvecklingsländernaneuron omges av lämplig ECM och celltyper som skulle möta motsvarande cell in vivo. Detta system har redan visat sig värdefulla i att dechiffrera de cellulära händelser som ligger till grund för etanol toxicitet 26, skikt 6 bildning och preplate dela 7,25.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name </td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 + GlutaMAX</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10565</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G5 Supplement 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17503-012</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Serum-Free Suppl. 50X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1504-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen / Strep Liquid 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 500 ml</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14025</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture insert collagen coated</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3492</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine skin gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9382</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7906</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX 830 Electroporator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer electrodes 10mm</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450166</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Billups Rothenberg</td>
			<td>MIC-101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (5 uL)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87930</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-04</td>
			<td>Specify 1" and style 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors Tough Cut 9 cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>14058-09</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development

Kortikal utveckling handlar komplexa interaktioner mellan nervceller och icke-neuronala element inklusive prekursorceller, blodkärl, hjärnhinnor och tillhörande extracellulär matrix. Eftersom de ger en lämplig organotypisk miljö, kortikala skiva explantaten ofta används för att undersöka interaktioner som styr neuronal differentiering och utveckling. Även välgörande, kan skivan explantat modell lider nackdelar inklusive avvikande cellulära laminering och migration. Här rapporterar vi ett helt cerebral-system halvklotet explantat för studier av tidig kortikal utveckling som är lättare att förbereda än kortikala skivor och visar konsekvent organotypisk migration och laminering. I detta modellsystem, tidig laminering och migrationsmönster fortsätta normalt för en period av två dagar in vitro, inräknat preplate delning, under vilken blivande kortikal lager sex former. Vi utvecklade då en ex utero elektroporering (EUEP)strategi som uppnår ~ 80% framgång i att rikta GFP uttryck för nervceller utvecklas i den dorsala mediala cortex. Hela halvklotet explantat modellen gör tidig kortikal utveckling tillgänglig för elektroporering, farmakologisk behandling och levande metoder avbildning. Denna metod undviker överlevnad kirurgi krävs av i livmodern elektroporering (IUEP) tillvägagångssätt och samtidigt förbättra både transfektion och areal inriktning konsistens. Denna metod kommer att underlätta experimentella studier av neuronala tillväxt, migration och differentiering.

Den embryonala gnagare cortex uppvisar en tvärgående neurogenetiska lutning under hela utvecklingsarbetet perioden, är sådan att laterala neocortex cirka 1 dag mognare än dorsal mediala neocortex 28. Huvuddelen av skiktet 6 neuroner således genereras (dvs. uppvisar sin slutliga S-fas) på E12 i laterala cortex (även kallad fält 40 5) och vid E13 i den dorsala mediala kortex (även kallad fält 1 5). Preplate delning börjar ca 1 dag efter lager 6 neuron generation och d?...

Watch this Scientific Journal Video about Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development at JoVE.com

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Detta protokoll beskriver en förbättrad explantat förfarande som innebär<em&gt; Ex utero</em&gt; Elektroporering, dissekering och kultur av hela hjärnhalvorna från embryonala mus. Beredningen underlättar farmakologiska studier och analyser av gen funktion under tidig kortikal utveckling.

Ex utero Elektroporation och Hela Explantat Hemisphere: En enkel Experimentell metod för studier av tidig kortikal utveckling

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

I livmodern elektroporation följt av primär Neuronala Kultur för att studera geners funktion i Delmängd av kortikal Neuroner

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Mus I livmodern Elektroporation: Kontrollerad Spatiotemporal Gene Transfektion

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualisering och Genetic Manipulation av dendriter och ryggar i mus hjärnbarken och hippocampus med användning av<em&gt; I utero</em&gt; Elektroporering

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Generering av Lokalt Transgena råttor genom<em&gt; I livmodern</em&gt; Elektroporering och<em&gt; In vivo</em&gt; Bioluminescence Screening

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

Isolering av cerebrospinalvätska från Gnagare Embryon för användning med Dissekerade cerebrala kortikala Explantat

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

Subtypselektiva Elektroporering av kortikal Interneuroner

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

En ny strategi kombinera Array-CGH, hela-exome sekvensering och In Utero elektroporation hos gnagare att identifiera orsakande gener för hjärnan missbildningar

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

I livmodern elektroporering Approaches att studera retbarhet av neuronala Subpopulationer och encelliga Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Elektrofysiologisk metod för helcells spänningskläminspelningar från<em&gt; Drosophila</em&gt; Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

Högupplösta Confocal avbildning av den Blood - brain barriären: bildbehandling, 3D rekonstruktion och kvantifiering av transcytos

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...