Name: steady-state, pre-steady-state, and single-turnover kinetic measurement for dna glycosylase activity
Uploaded: 2013-08-19T12:00:00
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Wir danken Dr. Julie K. Horton für die kritische Durchsicht des Manuskripts und Dr. Rajendra Prasad für Anregungen und Diskussionen. Teile dieser Forschung wurden ursprünglich in The Journal of Biological Chemistry, Sassa A et veröffentlicht. al., &quot;DNA-Sequenz Context Auswirkungen auf die Aktivität von humanem Glycosylase 8-Oxoguanine DNA Glycosylase.&quot; J Biol Chem. 287, 36702-36710 (2012) 2. Diese Arbeit wurde unterstützt, im Ganzen oder in Teilen, durch National Institutes of Health Research Project Grants Z01-ES050158 im Interne Research Program, NIEHS.

1. Herstellung des Enzyms DNA-Substrat und <ol><li> Over-express OGG1 als GST-Fusionsprotein in E. coli, nutzen die GST-tag für die Reinigung, und entfernen Sie dann die GST-tag durch Spaltung mit HRV-3C Protease (Abbildung 1) 6. </li><li> Kaufen Sie das chemisch synthetisiert 5&#39;-6-Carboxy-(6-FAM) markierte Oligonukleotid mit einem einzelnen 8-oxoG Rückstand und ihre komplementäre unmarkiertem Oligonukleotidstrang. Die 34-mer-Oligonucleotide enthalten ein 8-oxoG an Position ...

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	<li>Porello, S. L., Leyes, A. E., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-turnover+and+pre-steady-state+kinetics+of+the+reaction+of+the+adenine+glycosylase+MutY+with+mismatch-containing+DNA+substrates.">Single-turnover and pre-steady-state kinetics of the reaction of the adenine glycosylase MutY with mismatch-containing DNA substrates.</a> Biochemistry. 37, 14756-14764 (1998).</li><li>Sassa, A., Beard, W. A., Prasad, R., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequence+context+effects+on+the+glycosylase+activity+of+human+8-oxoguanine+DNA+glycosylase.">DNA sequence context effects on the glycosylase activity of human 8-oxoguanine DNA glycosylase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287, 36702-36710 (2012).</li><li>Wong, I., Lundquist, A. J., Bernards, A. S., Mosbaugh, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presteady-state+analysis+of+a+single+catalytic+turnover+by+Escherichia+coli+uracil-DNA+glycosylase+reveals+a+"pinch-pull-push"+mechanism.">Presteady-state analysis of a single catalytic turnover by Escherichia coli uracil-DNA glycosylase reveals a "pinch-pull-push" mechanism.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277, 19424-19432 (1074).</li><li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+transient-state+kinetics.">Advances in transient-state kinetics.</a> Current Opinion in Biotechnology. 9, 87-89 (1998).</li><li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+kinetic+analysis+of+mechanochemical+adenosinetriphosphatases.">Rapid kinetic analysis of mechanochemical adenosinetriphosphatases.</a> Methods in Enzymology. 134, 677-705 (1986).</li><li>Kovtun, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OGG1+initiates+age-dependent+CAG+trinucleotide+expansion+in+somatic+cells.">OGG1 initiates age-dependent CAG trinucleotide expansion in somatic cells.</a> Nature. 447, 447-452 (2007).</li><li>Hill, J. W., Hazra, T. K., Izumi, T., Mitra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+human+8-oxoguanine-DNA+glycosylase+by+AP-endonuclease:+potential+coordination+of+the+initial+steps+in+base+excision+repair.">Stimulation of human 8-oxoguanine-DNA glycosylase by AP-endonuclease: potential coordination of the initial steps in base excision repair.</a> Nucleic Acids Research. 29, 430-438 (2001).</li><li>Zharkov, D. O., Rosenquist, T. A., Gerchman, S. E., Grollman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+and+reaction+mechanism+of+murine+8-oxoguanine-DNA+glycosylase.">Substrate specificity and reaction mechanism of murine 8-oxoguanine-DNA glycosylase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275, 28607-28617 (2000).</li><li>Waters, T. R., Swann, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+the+action+of+thymine+DNA+glycosylase.">Kinetics of the action of thymine DNA glycosylase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273, 20007-20014 (1998).</li><li>Nilsen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excision+of+deaminated+cytosine+from+the+vertebrate+genome:+role+of+the+SMUG1+uracil-DNA+glycosylase.">Excision of deaminated cytosine from the vertebrate genome: role of the SMUG1 uracil-DNA glycosylase.</a> The EMBO Journal. 20, 4278-4286 (2001).</li><li>Gill, S. C., von Hippel, P. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+versus+repair:+NEIL1+removal+of+hydantoin+lesions+in+single-stranded,+bulge,+bubble,+and+duplex+DNA+contexts.">Mutation versus repair: NEIL1 removal of hydantoin lesions in single-stranded, bulge, bubble, and duplex DNA contexts.</a> Biochemistry. 49, 1658-1666 (2010).</li><li>Leipold, M. D., Workman, H., Muller, J. G., Burrows, C. J., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+and+removal+of+oxidized+guanines+in+duplex+DNA+by+the+base+excision+repair+enzymes+hOGG1,+yOGG1,+and+yOGG2.">Recognition and removal of oxidized guanines in duplex DNA by the base excision repair enzymes hOGG1, yOGG1, and yOGG2.</a> Biochemistry. 42, 11373-11381 (2003).</li><li>Robey-Bond, S. M., Barrantes-Reynolds, R., Bond, J. P., Wallace, S. S., Bandaru, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clostridium+acetobutylicum+8-oxoguanine+DNA+glycosylase+(Ogg)+differs+from+eukaryotic+Oggs+with+respect+to+opposite+base+discrimination.">Clostridium acetobutylicum 8-oxoguanine DNA glycosylase (Ogg) differs from eukaryotic Oggs with respect to opposite base discrimination.</a> Biochemistry. 47, 7626-7636 (2008).</li><li>Jarem, D. A., Wilson, N. R., Delaney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-dependent+DNA+damage+and+repair+in+a+trinucleotide+repeat+sequence.">Structure-dependent DNA damage and repair in a trinucleotide repeat sequence.</a> Biochemistry. 48, 6655-6663 (2009).</li><li>Livingston, A. L., Kundu, S., Henderson Pozzi, M., Anderson, W. D., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+roles+of+tyrosine+82+and+glycine+253+in+the+Escherichia+coli+adenine+glycosylase+MutY.">Insight into the roles of tyrosine 82 and glycine 253 in the Escherichia coli adenine glycosylase MutY.</a> Biochemistry. 44, 14179-14190 (2005).</li><li>Kundu, S., Brinkmeyer, M. K., Livingston, A. L., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenine+removal+activity+and+bacterial+complementation+with+the+human+MutY+homologue+(MUTYH)+and+Y165C,+G382D,+P391L+and+Q324R+variants+associated+with+colorectal+cancer.">Adenine removal activity and bacterial complementation with the human MutY homologue (MUTYH) and Y165C, G382D, P391L and Q324R variants associated with colorectal cancer.</a> DNA Repair. 8, 1400-1410 (2009).</li><li>Zharkov, D. O., Rosenquist, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+mammalian+8-oxoguanine-DNA+glycosylase+by+cadmium(II):+implications+for+cadmium+genotoxicity.">Inactivation of mammalian 8-oxoguanine-DNA glycosylase by cadmium(II): implications for cadmium genotoxicity.</a> DNA Repair. 1, 661-670 (2002).</li><li>Jarem, D. A., Wilson, N. R., Schermerhorn, K. M., Delaney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+and+persistence+of+8-oxo-7,8-dihydroguanine+within+a+hairpin+intermediate+exacerbates+a+toxic+oxidation+cycle+associated+with+trinucleotide+repeat+expansion.">Incidence and persistence of 8-oxo-7,8-dihydroguanine within a hairpin intermediate exacerbates a toxic oxidation cycle associated with trinucleotide repeat expansion.</a> DNA Repair. 10, 887-896 (2011).</li><li>Mokkapati, S. K., Wiederhold, L., Hazra, T. K., Mitra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+DNA+glycosylase+activity+of+OGG1+by+NEIL1:+functional+collaboration+between+two+human+DNA+glycosylases.">Stimulation of DNA glycosylase activity of OGG1 by NEIL1: functional collaboration between two human DNA glycosylases.</a> Biochemistry. 43, 11596-11604 (2004).</li><li>Sidorenko, V. S., Nevinsky, G. A., Zharkov, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+interaction+between+human+8-oxoguanine-DNA+glycosylase+and+AP+endonuclease.">Mechanism of interaction between human 8-oxoguanine-DNA glycosylase and AP endonuclease.</a> DNA Repair. 6, 317-328 (2007).</li></ol>

Die kinetischen Ansätze hier beschriebenen Methoden, um einen Überblick über elementare kinetischen Konstanten definieren. Wenn ein Zeitverlauf der Produktbildung ist biphasisch mit der ersten enzymatischen Umsatz auftretenden schnell, dann ein Schritt nach Chemie geschwindigkeitsbestimmenden während anschließende katalytische Umsätze. Im Falle OGG1 kann die erste Umsatz unter Verwendung hoher Konzentrationen Enzym entweder mit Begrenzung (S &lt;E) oder hohen (S&gt; E) DNA-Konzentrationen werden. Im ersten Fall wi...

Einer aeroben Umgebung beeilt genomische Instabilität. Ein wesentlicher promutagene DNA Läsion aus oxidativem Stress ist 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8-oxoG). Dies ist aufgrund der mehrdeutigen Codierung Potential 8-oxoG. Menschliche 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) ist verantwortlich für die Initiierung Basenexzisionsreparatur von 8-oxoG. Die glycosylase Aktivität OGG1 schneidet das 8-oxoG Basis resultierende Produkt in DNA mit einer Apurin Website (AP-site). Eine schwache Lyaseaktivität von OGG1 können die AP-Website in einigen Fällen einzuschneiden. Kinetische Charakterisierung von DNA Glycosylasen allgemein fest, dass sie zweiphasige zeitliche Verläufe aufweisen. Nach einer anfänglichen schnellen Phase der Produktbildung (dh Burst) wird eine lineare stationären Phase beobachtet 1-3. Dieses Verhalten ist, das einen Schritt nach Chemie (dh Konformationsänderung oder Produkt release) ist geschwindigkeitsbestimmend während des linearen Teils der Zeitverlauf, während der Bohrerst Phase, die oft als die transiente Phase bezeichnet, entspricht die Produktbildung in der aktiven Stelle des Enzyms während des ersten Zyklus der Reaktion. Bei Produkt-Release Rate Limiting während der Steady-State-Phase ist, bieten Aktivitätsmessungen eine qualitative Messung der Produkt-DNA Bindungsaffinität, aber keine kinetische Informationen über Veranstaltungen im aktiven Zentrum des Enzyms (dh Chemie). Dementsprechend sind Methoden zu isolieren und messen die exponentielle pre-steady-state Burst-Phase benötigt, um Ereignisse während der ersten enzymatischen Umsatz an das Enzym aktive Zentrum 4 sondieren. Es gibt drei Standard kinetische Ansätze, um die katalytische Verhalten OGG1 charakterisieren, (1) Steady-State, (2) pre-steady-state, und (3) Single-Turnover. Diese Ansätze unterscheiden sich durch die Konzentration des Enzyms in dem Reaktionsgemisch und dem Enzym zu Substrat-Verhältnis in jedem Ansatz verwendet. In einem typischen Steady-State-Ansatz,manchmal als mehrere Umsatzkinetik bezeichnet werden, sind geringe Konzentrationen von Enzym zur Bildung Produkt folgen. Die Substratkonzentration übersteigt bei weitem die Enzymkonzentration so dass mehrere enzymatische Umsätze nicht wesentlich beeinträchtigen Substratkonzentration. In dieser Situation sollte Zeitverläufe linear sein, und es ist oft schwierig zu erkennen, ob ein Burst in der ersten Umsatz aufgrund der geringen Enzymkonzentration in diesem Ansatz trat; beachten Burstamplitude entspricht der Enzymkonzentration. Dies kann durch Verwendung einer höheren Enzymkonzentration und Extrapolieren der linearen Zeitverlauf auf den Zeitpunkt Null zu erfassen, ob die erste enzymatischen Umsetzung schnell aufgetreten überwunden werden. Der Achsenabschnitt auf der Ordinate (y-Achse) sollte proportional zur Enzymkonzentration und stellt ein Maß für das Enzym aktiv mit dem Substrat in Eingriff. Obwohl dieser Ansatz im Prinzip den Nachweis für die Existenz eines Burst-Phase, und ein DIF-schiedenen Ansatz erforderlich, um die Kinetik der Burst-Phase messen. In vielen Fällen ist der Burst-Phase ist zu schnell, um durch manuelles Mischen und Abschrecken Techniken messen. In dieser Situation nähert sich pre-steady-state und Single-Turnover-kinetische (dh transient kinetische) erfordern oft einen schnellen-mixing und Abschrecken Instrument zu frühen Zeitpunkten einer Reaktion 5 folgen. In einer vorher stationären Ansatz hohe Konzentrationen des Enzyms, so dass eine erhebliche Menge an Produkt in der ersten Umsatzes gebildet werden. Da mehrere Umsätze gefolgt sind katalytische Radfahren (dh die lineare Phase, die die Burst folgt) zu beobachten, ist Substratkonzentration größer als die Enzymkonzentration ([Enzym] &lt;[Substrat]). Um Ereignisse im aktiven Zentrum des Enzyms zu isolieren ohne Katalysator Radfahren, sind Single-Turnover-Bedingungen verwendet. In diesem Fall wird das Substrat mit dem Enzym gesättigt (E &gt;&gt; S), so dass alle von dem Substrat wird i teilnehmenn der &quot;einzigen Umsatz&quot; und wird typischerweise eine Single-exponentiellen Zeitverlauf. Wie oben für Enzyme, die eine Burst-Phase, Produkt-Release (k off) weisen darauf hingewiesen, begrenzt oft die Geschwindigkeit der Steady-State-Phase des zeitlichen Verlaufs. Die Rate der Freisetzung (v ss, Konz. / Zeit) aus der Steigung der linearen steady-state-Phase bestimmt werden. Die aktive Enzymkonzentration (E) benötigt wird, um die Rate der Produkt-Release einer intrinsischen Geschwindigkeitskonstante konvertieren wo k off = v ss / [E]. Wichtig ist, dass das aktive Enzym-Konzentration in der Regel niedriger als der gemessene Proteinkonzentration durch Verunreinigungen, inaktives Enzym, Enzym nicht-produktiv Substrat gebunden, und die Methode zur Protein-Konzentration bestimmen. Die aktive Enzymkonzentration kann aus dem Burstamplitude bestimmt werden, wenn Produkt-Release ist langsam. So Extrapolation eine steady-state zeitlichen Verlauf zuNull Zeit liefert eine Schätzung der aktiven Enzym benötigt, um k off (Produktversion) aus dem beobachteten steady-state zu berechnen. Um die Kinetik des Bursts messen, ist ein Pre-Steady-State-Ansatz notwendig, um Produkt-Bildung während der ersten Umsätze, die vor dem linearen stationären Phase tritt folgen. Die Burst-Kinetik folgt die Bildung von Enzym-Zwischenprodukts. Sobald die Reaktion durch Mischen von Enzym mit dem Substrat eingeleitet wird, die Menge an Enzym-Produkt schnell erhöht, bis die Reaktion einen stationären Zustand erreicht Phase. Wenn Katalyse ist viel schneller als Produkt-Release ist die Amplitude des Bursts gleich aktiv engagiert Enzym und dem beobachteten exponentiellen Annäherung an das Gleichgewicht (k obs) entspricht der Geschwindigkeit der chemischen Umwandlung von Substrat zu Produkt, vorausgesetzt, dass das Gegenteil von Chemie vernachlässigbar. In einigen Fällen katalytischen cyklammern stört mit einem pre-steady-state-Analyse, z. B. wenn die Größen der Preise für Chemie und Produkt-Release sind nicht signifikant unterschiedlich. In diesem Fall, unter Verwendung überschüssigen Enzym relativ zu dem Substrat verhindert katalytische Rad-und Grenzwerte Substrat mit dem Enzym in einem Umsatz gebunden. Dementsprechend kann die erste chemische Schritt der Reaktion isoliert und genau bestimmt als die Geschwindigkeitskonstante erster Ordnung (k obs). Diese Geschwindigkeitskonstante sollte ähnlich k obs ermittelt aus der pre-steady-state oben beschriebenen Ansatz. Hier beschreiben wir, wie diese kinetische Ansätze verwendet werden, um die Aktivität von glycosylase OGG1 analysieren.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5'-6-FAM labeled oligonucleotides containing a single 8-oxoG</td>
 <td>Eurofins MWG Operon</td>
 <td></td>
 <td>5'-P32 radiolabeled oligonucleotides can be used as well. Polyacrylamide gel purification grade is recommended. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Unlabeled oligonucleotides (complementary strand)</td>
 <td>Eurofins MWG Operon</td>
 <td></td>
 <td>Polyacrylamide gel purification grade is recommended. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 ml BD Luer Lock disposable syringe</td>
 <td>BD Medical</td>
 <td>309628</td>
 <td>Lue Lock disposable syringe from other vendors can be used as well.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 ml BD Luer Lock disposable syringe</td>
 <td>BE Medical</td>
 <td>309604</td>
 <td>Luer Lock disposable syringe from other vendors can be used as well.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Circulating water bath</td>
 <td>Any vender</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RQF-3 Rapid Quench-Flow Instrument</td>
 <td>KinTek Corporation</td>
 <td></td>
 <td>Rapid Quench-Flow Instrument from other vendors can be used as well.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Typhoon Phosphorimager 8600</td>
 <td>GE Healthcare Life Sciences</td>
 <td></td>
 <td>Imager from other vendors can be used as well.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KaleidaGraph</td>
 <td>Synergy Software</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

steady-state, pre-steady-state, and single-turnover kinetic measurement for dna glycosylase activity

Menschliche 8-Oxoguanin-DNA-Glycosylase (OGG1) schneidet das mutagene oxidative DNA Läsion 8-oxo-7 ,8-dihydroguanine (8-oxoG) von DNA. Kinetische Charakterisierung OGG1 vorgenommen wird, um die Raten von 8-oxoG Exzision und Produkt-Release zu messen. Wenn die Konzentration niedriger als OGG1 Substrat-DNA ist, sind Zeitverläufe der Produktbildung zweiphasige, eine schnelle exponentielle Phase (dh Burst) der Produktbildung durch einen linearen stationären Phase. Anfängliches Platzen der Produktbildung entspricht der Konzentration des Enzyms auf das Substrat ordnungsgemäß in Eingriff, und der Burst-Amplitude abhängig von der Konzentration des Enzyms. Die ersten Ordnung Geschwindigkeitskonstante des Bursts entspricht der intrinsischen Rate von 8-oxoG Exzision und die langsamere steady-state Inflationsrate misst die Rate der Freisetzung (Produkt DNA Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante, k off). Hier beschreiben wir Steady-State-, pre-steady-state und Single-Turnover-Ansätze zu isolieren und zu messen specific Schritte während OGG1 katalytische Radfahren. A fluoreszenzmarkierte Läsion enthaltenden Oligonukleotid und gereinigt OGG1 werden verwendet, um präzise kinetische Messungen zu erleichtern. Seit niedrig Enzymkonzentrationen verwendet werden, um steady-state Messungen, manuelles Mischen von Reagenzien und Abschrecken der Reaktion machen kann durchgeführt werden, um die steady-state (k off) zu ermitteln. Zusätzlich zeigt Extrapolation der stabilen Frequenz bis zu einem Punkt auf der Ordinate auf Null Mal, dass ein Platzen der Produktbildung in der ersten Umsatz (dh der y-Achse positiv ist) eingetreten ist. Die ersten Ordnung Geschwindigkeitskonstante der exponentiellen Burst-Phase kann unter Verwendung eines schnellen Vermischung und Abschrecken Technik, die die Menge des Produkts, in kurzen Zeitabständen (&lt;1 s) vor der stationären Phase gebildet untersucht und entspricht der Höhe von 8 werden oxoG-Exzision (dh Chemie). Die chemische Schritt kann auch unter Verwendung eines Single-Turnover-Ansatz, wo katalytische Radfahren istverhindert durch Sättigen Substrat-DNA mit dem Enzym (E&gt; S). Diese Ansätze lassen sich messen elementare Geschwindigkeitskonstanten, die die Effizienz der Entfernung von einer DNA-Läsion beeinflussen.

Die Steady-State kinetischen Analyse wurde unter Verwendung von 200 nM DNA Substrat und vier verschiedenen scheinbaren Konzentrationen OGG1 (15, 30, 45 und 60 nm), wie durch einen Bradford-Protein-Assay bestimmt 2 durchgeführt. Die Zeitverläufe der Produktbildung von einer linearen Gleichung, um die y-Achse, die 2,2 waren, 11, 15 und 26 nm, relativ zueinander Proteinkonzentration (2B) zu bestimmen, zu passen. Die y-fängt wurden weiter aufgetragen relativ zueinander tatsächlichen Proteinko...

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Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

Zeit Kurse für die glycosylase Aktivität von 8-oxoguanine DNA glycosylase sind zweiphasige ausstellenden ein Platzen der Produkt-Bildung und einer linearen steady-state-Phase. Verwendung Quench-Flow-Techniken, die platzen und die Steady-State-Raten gemessen werden können, die Exzision von 8-oxoguanine und Freisetzung des glycosylase DNA aus dem Produkt entsprechen.

Steady-State-, Pre-Steady-State-und Einzel-Umsatz Kinetic Measurement für DNA Glycosylase Aktivität

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

Research

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NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

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NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment ...