Name: steady-state, pre-steady-state, and single-turnover kinetic measurement for dna glycosylase activity
Uploaded: 2013-08-19T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity at JoVE.com

אנו מודים לד&quot;ר ג&#39;ולי ק הורטון לקריאה ביקורתית של כתב היד וRajendra פראסאד ד&quot;ר להצעות ודיונים מועילים. חלקים ממחקר זה פורסמו במקור בכתב העת לכימיה ביולוגית, סאסא ואחרים. אל., &quot;השפעות רצף ה-DNA הקשר על פעילות Glycosylase של Glycosylase-DNA של 8 Oxoguanine האנושי&quot;. J Biol Chem. 287, 36,702-36,710 (2012) 2. עבודה זו נתמכה, במלואו או בחלקו, על ידי המכונים הלאומי לבריאות מחקר פרויקט גרנט Z01-ES050158 בתכנית המחקר העירוני, NIEHS.

1. הכנה של אנזים ומצע DNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעל מפורש OGG1 כחלבון GST-היתוך בE. coli, לנצל GST, התגית לטיהור, ולאחר מכן להסיר את GST-תג על ידי מחשוף עם HRV-3C פרוטאז (איור 1) 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש מסונתז כימי oligonucleotide שכות?...

<ol>
	<li>Porello, S. L., Leyes, A. E., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-turnover+and+pre-steady-state+kinetics+of+the+reaction+of+the+adenine+glycosylase+MutY+with+mismatch-containing+DNA+substrates.">Single-turnover and pre-steady-state kinetics of the reaction of the adenine glycosylase MutY with mismatch-containing DNA substrates.</a> Biochemistry. 37, 14756-14764 (1998).</li><li>Sassa, A., Beard, W. A., Prasad, R., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequence+context+effects+on+the+glycosylase+activity+of+human+8-oxoguanine+DNA+glycosylase.">DNA sequence context effects on the glycosylase activity of human 8-oxoguanine DNA glycosylase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287, 36702-36710 (2012).</li><li>Wong, I., Lundquist, A. J., Bernards, A. S., Mosbaugh, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presteady-state+analysis+of+a+single+catalytic+turnover+by+Escherichia+coli+uracil-DNA+glycosylase+reveals+a+"pinch-pull-push"+mechanism.">Presteady-state analysis of a single catalytic turnover by Escherichia coli uracil-DNA glycosylase reveals a "pinch-pull-push" mechanism.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277, 19424-19432 (1074).</li><li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+transient-state+kinetics.">Advances in transient-state kinetics.</a> Current Opinion in Biotechnology. 9, 87-89 (1998).</li><li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+kinetic+analysis+of+mechanochemical+adenosinetriphosphatases.">Rapid kinetic analysis of mechanochemical adenosinetriphosphatases.</a> Methods in Enzymology. 134, 677-705 (1986).</li><li>Kovtun, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OGG1+initiates+age-dependent+CAG+trinucleotide+expansion+in+somatic+cells.">OGG1 initiates age-dependent CAG trinucleotide expansion in somatic cells.</a> Nature. 447, 447-452 (2007).</li><li>Hill, J. W., Hazra, T. K., Izumi, T., Mitra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+human+8-oxoguanine-DNA+glycosylase+by+AP-endonuclease:+potential+coordination+of+the+initial+steps+in+base+excision+repair.">Stimulation of human 8-oxoguanine-DNA glycosylase by AP-endonuclease: potential coordination of the initial steps in base excision repair.</a> Nucleic Acids Research. 29, 430-438 (2001).</li><li>Zharkov, D. O., Rosenquist, T. A., Gerchman, S. E., Grollman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+and+reaction+mechanism+of+murine+8-oxoguanine-DNA+glycosylase.">Substrate specificity and reaction mechanism of murine 8-oxoguanine-DNA glycosylase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275, 28607-28617 (2000).</li><li>Waters, T. R., Swann, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+the+action+of+thymine+DNA+glycosylase.">Kinetics of the action of thymine DNA glycosylase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273, 20007-20014 (1998).</li><li>Nilsen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excision+of+deaminated+cytosine+from+the+vertebrate+genome:+role+of+the+SMUG1+uracil-DNA+glycosylase.">Excision of deaminated cytosine from the vertebrate genome: role of the SMUG1 uracil-DNA glycosylase.</a> The EMBO Journal. 20, 4278-4286 (2001).</li><li>Gill, S. C., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculation+of+protein+extinction+coefficients+from+amino+acid+sequence+data.">Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data.</a> Analytical Biochemistry. 182, 319-326 (1989).</li><li>Van de Berg, ., Beard, B. J., A, W., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+structure+and+aspartate+276+influence+nucleotide+binding+to+human+DNA+polymerase+beta.+Implication+for+the+identity+of+the+rate-limiting+conformational+change.">DNA structure and aspartate 276 influence nucleotide binding to human DNA polymerase beta. Implication for the identity of the rate-limiting conformational change.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276, 3408-3416 (2001).</li><li>Krishnamurthy, N., Haraguchi, K., Greenberg, M. M., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+removal+of+formamidopyrimidines+by+8-oxoguanine+glycosylases.">Efficient removal of formamidopyrimidines by 8-oxoguanine glycosylases.</a> Biochemistry. 47, 1043-1050 (2008).</li><li>Leipold, M. D., Muller, J. G., Burrows, C. J., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+hydantoin+products+of+8-oxoguanine+oxidation+by+the+Escherichia+coli+DNA+repair+enzyme,+FPG.">Removal of hydantoin products of 8-oxoguanine oxidation by the Escherichia coli DNA repair enzyme, FPG.</a> Biochemistry. 39, 14984-14992 (2000).</li><li>Zhao, X., Krishnamurthy, N., Burrows, C. J., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+versus+repair:+NEIL1+removal+of+hydantoin+lesions+in+single-stranded,+bulge,+bubble,+and+duplex+DNA+contexts.">Mutation versus repair: NEIL1 removal of hydantoin lesions in single-stranded, bulge, bubble, and duplex DNA contexts.</a> Biochemistry. 49, 1658-1666 (2010).</li><li>Leipold, M. D., Workman, H., Muller, J. G., Burrows, C. J., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+and+removal+of+oxidized+guanines+in+duplex+DNA+by+the+base+excision+repair+enzymes+hOGG1,+yOGG1,+and+yOGG2.">Recognition and removal of oxidized guanines in duplex DNA by the base excision repair enzymes hOGG1, yOGG1, and yOGG2.</a> Biochemistry. 42, 11373-11381 (2003).</li><li>Robey-Bond, S. M., Barrantes-Reynolds, R., Bond, J. P., Wallace, S. S., Bandaru, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clostridium+acetobutylicum+8-oxoguanine+DNA+glycosylase+(Ogg)+differs+from+eukaryotic+Oggs+with+respect+to+opposite+base+discrimination.">Clostridium acetobutylicum 8-oxoguanine DNA glycosylase (Ogg) differs from eukaryotic Oggs with respect to opposite base discrimination.</a> Biochemistry. 47, 7626-7636 (2008).</li><li>Jarem, D. A., Wilson, N. R., Delaney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-dependent+DNA+damage+and+repair+in+a+trinucleotide+repeat+sequence.">Structure-dependent DNA damage and repair in a trinucleotide repeat sequence.</a> Biochemistry. 48, 6655-6663 (2009).</li><li>Livingston, A. L., Kundu, S., Henderson Pozzi, M., Anderson, W. D., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+roles+of+tyrosine+82+and+glycine+253+in+the+Escherichia+coli+adenine+glycosylase+MutY.">Insight into the roles of tyrosine 82 and glycine 253 in the Escherichia coli adenine glycosylase MutY.</a> Biochemistry. 44, 14179-14190 (2005).</li><li>Kundu, S., Brinkmeyer, M. K., Livingston, A. L., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenine+removal+activity+and+bacterial+complementation+with+the+human+MutY+homologue+(MUTYH)+and+Y165C,+G382D,+P391L+and+Q324R+variants+associated+with+colorectal+cancer.">Adenine removal activity and bacterial complementation with the human MutY homologue (MUTYH) and Y165C, G382D, P391L and Q324R variants associated with colorectal cancer.</a> DNA Repair. 8, 1400-1410 (2009).</li><li>Zharkov, D. O., Rosenquist, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+mammalian+8-oxoguanine-DNA+glycosylase+by+cadmium(II):+implications+for+cadmium+genotoxicity.">Inactivation of mammalian 8-oxoguanine-DNA glycosylase by cadmium(II): implications for cadmium genotoxicity.</a> DNA Repair. 1, 661-670 (2002).</li><li>Jarem, D. A., Wilson, N. R., Schermerhorn, K. M., Delaney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+and+persistence+of+8-oxo-7,8-dihydroguanine+within+a+hairpin+intermediate+exacerbates+a+toxic+oxidation+cycle+associated+with+trinucleotide+repeat+expansion.">Incidence and persistence of 8-oxo-7,8-dihydroguanine within a hairpin intermediate exacerbates a toxic oxidation cycle associated with trinucleotide repeat expansion.</a> DNA Repair. 10, 887-896 (2011).</li><li>Mokkapati, S. K., Wiederhold, L., Hazra, T. K., Mitra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+DNA+glycosylase+activity+of+OGG1+by+NEIL1:+functional+collaboration+between+two+human+DNA+glycosylases.">Stimulation of DNA glycosylase activity of OGG1 by NEIL1: functional collaboration between two human DNA glycosylases.</a> Biochemistry. 43, 11596-11604 (2004).</li><li>Sidorenko, V. S., Nevinsky, G. A., Zharkov, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+interaction+between+human+8-oxoguanine-DNA+glycosylase+and+AP+endonuclease.">Mechanism of interaction between human 8-oxoguanine-DNA glycosylase and AP endonuclease.</a> DNA Repair. 6, 317-328 (2007).</li></ol>

את הקינטית הגישות מתוארות כאן מתארים שיטות להגדרת קבועים קינטיים יסודיים. אם מהלך זמן של היווצרות המוצר הוא biphasic עם המחזור הראשון האנזימטית מתרחש במהירות, ולאחר מכן צעד אחרי הכימיה הוא שיעור הגבלה במהלך מחזורים קטליטיים שלאחר מכן. במקרה של OGG1, ניתן למדוד את המחזור הר...

סביבה אירובית ממהרת חוסר יציבות גנומית. נגע DNA promutagenic גדול כתוצאה מלחץ חמצוני הוא 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8-oxoG). זאת בשל פוטנציאל הקידוד המעורפל של 8-oxoG. אדם 8-DNA oxoguanine glycosylase (OGG1) הוא אחראי לייזום תיקון כריתת בסיס של 8-oxoG. פעילות glycosylase של OGG1 בולה בסיס 8-oxoG וכתוצאה מכך ה-DNA של המוצר עם אתר apurinic (AP באתר). פעילות lyase חלשה של OGG1 יכולה לחתוך את AP באתר במקרים מסוימים. אפיון הקינטית של glycosylases DNA בדרך כלל מגלה שהם מפגינים קורסי זמן biphasic. לאחר שלב ראשוני של היווצרות מהירה של מוצר (כלומר פרץ), שלב מצב יציב ליניארי הוא ציין 1-3. התנהגות זו מעידה על צעד בעקבות כימיה (שינוי קונפורמציה כלומר או שחרור מוצר) ששיעור הגבלה במהלך החלק ליניארית של הזמן כמובן, ואילו ספחתרח שלב, המכונה לעתים קרובות את השלב החולף, מתאים להיווצרות מוצר באתר הפעיל אנזים במהלך המחזור של התגובה הראשונה. כאשר שחרור המוצר הוא שיעור הגבלה בשלב המצב יציב, מדידות פעילות לספק מידה איכותית של זיקה המחייבת DNA של מוצר, אך אינו מספקות מידע בנוגע לאירועים בהקינטית אנזים האתר הפעיל (כלומר כימיה). בהתאם לכך, שיטות לבודד ולמדוד את שלב פרץ מראש מצב יציב מעריכי יש צורך לחקור אירועים במהלך המחזור האנזימטית הראשון בשעה 4 האתר הפעיל של האנזים. קיימות שלוש גישות סטנדרטיות להקינטית מאפיינות את ההתנהגות הקטליטית של OGG1, (1) מצב יציב, (2) מראש מצב יציב, וכן (3) חד המחזור. גישות אלה שונות זו מזו על ידי הריכוז של אנזים בתערובת התגובה ואת האנזים ליחס מצע מנוצל בכל גישה. בגישת מצב יציב טיפוסי,מכונה קינטיקה תחלופה מרובות לפעמים, ריכוזים נמוכים של אנזים המשמשים למעקב היווצרות מוצר. ריכוז המצע עולה בהרבה על ריכוז האנזים כך שאיבודים אנזימטיות מרובים אינם משפיעים על ריכוז מצע באופן משמעותי. במצב זה, קורסי זמן צריכים להיות ליניארי, ולעתים קרובות קשה להבחין אם פרץ התרחש במהלך המחזור הראשון בשל ריכוז האנזים הנמוך בשימוש בגישה זו; לב שהמשרעת פרץ היא שווה ערך לריכוז האנזים. זו ניתן להתגבר על ידי שימוש בריכוז גבוה יותר והשערת אנזים כמובן הזמן ליניארי לאפס זמן כדי לזהות אם המחזור האנזימטית הראשון התרחש במהירות. ליירט בordinate (ציר y) צריך להיות פרופורציונלי לריכוז האנזים ומספק מידה מסוימת של האנזים מעורב באופן פעיל עם מצע. למרות שגישה זו יכולה באופן עקרוני לספק ראיות לקיומו של שלב פרץ, אונטערשיידגישה שונה שממפה נדרש למדוד את הקינטיקה של שלב פרץ. במקרים רבים שלב פרץ הוא מהיר מדי למדידה על ידי טכניקות ערבוב ומרווה ידניות. במצב זה, הקינטית מראש מצב יציב וחד מחזור (כלומר הקינטית חולף) מתקרב לעתים קרובות דורש מכשיר ערבוב מהיר ומרווה לעקוב אחרי נקודות זמן מוקדמות של תגובה 5. בגישה מראש מצב יציב ריכוזים גבוהים של אנזים נמצאים בשימוש, כך שכמות משמעותית של מוצר נוצר במהלך המחזור הראשון. מאז מחזורים מרובים ואחרי רכיבה על אופניים כדי לבחון קטליטי (כלומר השלב ליניארי שאחרי פרץ), ריכוז מצע גדול מריכוז האנזים ([אנזים] &lt;[מצע]). לבודד אירועים באתר הפעיל של האנזים ללא רכיבה על אופניים קטליטי, תנאים יחיד מחזור מנוצלים. במקרה זה, מצע רווי באנזים (E &gt;&gt; S) כך שכל המצע ישתתףn &#39;התחלופה היחידה &quot;, ובדרך כלל תפגין כמובן זמן יחיד מעריכים. כפי שצוין לעיל לאנזימים כי תערוכת שלב פרץ, שחרור מוצר (k כבוי) לעתים קרובות מגביל את השיעור של השלב היציב של מהלך הזמן. קצב השחרור של מוצר (. / שעת V ss, קונצרט כלשהו) ניתן לקבוע מן המדרון של שלב המצב יציב ליניארי. ריכוז האנזים הפעיל (ה) יש צורך להמיר את קצב שחרור מוצר לקצב פנימי מתמיד כאשר k = v את ss / [E]. חשוב לציין, ריכוז האנזים הפעיל הוא בדרך כלל נמוך יותר מהריכוז שנמדד החלבון בשל זיהומים, האנזים פעיל, אנזים שאינם פרודוקטיבית חייב מצע, ואת השיטה המשמשת לקביעת ריכוז חלבון. ריכוז האנזים הפעיל ניתן לקבוע ממשרעת פרץ, כאשר שחרורו של המוצר הוא איטי. לפיכך, חיוץ כמובן זמן מצב יציב לזמן אפס מספק אומדן של האנזים הפעיל הדרושים כדי לחשב את K (שחרור מוצר) מהשיעור שנצפה המצב יציב. כדי למדוד את הקינטיקה של פרץ, גישה מראש מצב יציב היא צורך לעקוב אחר היווצרות המוצר במהלך המחזור הראשון המתרחש לפני שלב המצב יציב ליניארי. קינטיקה הפרץ כדלקמן היווצרות אנזימים מוצר ביניים. ברגע שהתגובה היא שיזמה אנזים ערבוב עם מצע, את כמות אנזים התוצר מגבירה במהירות עד שהתגובה מגיעה שלב מצב יציב. אם קטליזה היא הרבה יותר מהיר מאשר שחרור מוצר, את המשרעת של פרץ שווה לאנזים מעורב באופן פעיל וגישת מעריכי שנצפו לשיווי משקל (K obs) מתאימה לשיעור ההמרה כימית של מצע למוצר, בהנחת שהשיעור ההפוך של כימיה היא זניחה. בכמה מקרים CY קטליטינאחזים מפריע לניתוח מראש מצב יציב, כגון כאשר הבהירויות של שיעורי כימיה ושחרור המוצר אינן שונות באופן משמעותי. במקרה זה, העסקת קרוב משפחה אנזים עודף לרכיבה על אופניים מונעת מצע הקטליטי ומצע מגבלות כרוכות באנזים למחזור אחד. בהתאם לכך, הצעד הכימי הראשון של התגובה יכול להיות מבודד ונקבע במדויק כקבוע קצב מהסדר ראשון (k תצפיות). שיעור זה קבוע צריך להיות דומה לK obs נקבע מהגישה מראש המצב יציב שתוארה לעיל. כאן אנו מתארים כיצד ניתן להשתמש בגישות אלה הקינטית לנתח את פעילות glycosylase של OGG1.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5'-6-FAM labeled oligonucleotides containing a single 8-oxoG</td>
 <td>Eurofins MWG Operon</td>
 <td></td>
 <td>5'-P32 radiolabeled oligonucleotides can be used as well. Polyacrylamide gel purification grade is recommended. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Unlabeled oligonucleotides (complementary strand)</td>
 <td>Eurofins MWG Operon</td>
 <td></td>
 <td>Polyacrylamide gel purification grade is recommended. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 ml BD Luer Lock disposable syringe</td>
 <td>BD Medical</td>
 <td>309628</td>
 <td>Lue Lock disposable syringe from other vendors can be used as well.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 ml BD Luer Lock disposable syringe</td>
 <td>BE Medical</td>
 <td>309604</td>
 <td>Luer Lock disposable syringe from other vendors can be used as well.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Circulating water bath</td>
 <td>Any vender</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RQF-3 Rapid Quench-Flow Instrument</td>
 <td>KinTek Corporation</td>
 <td></td>
 <td>Rapid Quench-Flow Instrument from other vendors can be used as well.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Typhoon Phosphorimager 8600</td>
 <td>GE Healthcare Life Sciences</td>
 <td></td>
 <td>Imager from other vendors can be used as well.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KaleidaGraph</td>
 <td>Synergy Software</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

steady-state, pre-steady-state, and single-turnover kinetic measurement for dna glycosylase activity

אדם 8-DNA oxoguanine glycosylase (OGG1) בולה נגע DNA חמצוני מוטגניות 8-אוקסו 7 ,8-dihydroguanine (8-oxoG) מ-DNA. אפיון הקינטית של OGG1 נעשה כדי למדוד את שיעורי הכריתה 8-oxoG ושחרור מוצר. כאשר ריכוז OGG1 הוא נמוך יותר מאשר ה-DNA המצע, קורסים בזמן של היווצרות המוצר הם biphasic; שלב מעריכי מהיר (כלומר פרץ) של היווצרות מוצר ואחריו שלב מצב יציב ליניארי. פרץ הראשוני של היווצרות המוצר מתאים לריכוז של אנזים עוסק כראוי על המצע, ואת המשרעת פרץ תלויה בריכוזו של אנזים. השיעור ראשון הסדר הקבוע של פרץ מתאים לקצב הפנימי של כריתת 8-oxoG וקצב איטי יותר מצב יציב מודד את קצב שחרור מוצר (מוצר ה-DNA שיעור קבוע דיסוציאציה, K כבוי). כאן, אנו מתארים מצב יציב, מראש מצב יציב, ואחת גישות מחזור לבודד ולמדוד SPצעדי ecific במהלך רכיבה על אופניים OGG1 קטליטיים. Oligonucleotide המכיל נגע שכותרת ניאון וOGG1 מטוהרים משמשים כדי להקל על מדידות מדויקות הקינטית. מאז ריכוזי אנזים נמוכים משמשים לביצוע מדידות מצב יציב, הוראות ערבוב של חומרים כימיים ומרווה של התגובה ניתן לבצע כדי לברר את שיעור המצב יציב (k כבוי). בנוסף, ניפוח של שיעור המצב יציב לנקודה על ordinate בזמן אפס מציין כי פרץ של היווצרות מוצר התרחש במהלך המחזור הראשון (כלומר חיתוך-y הוא חיובי). ניתן למדידה בשיעור הקבוע מהסדר הראשון של שלב פרץ מעריכי בטכניקת ערבוב ומרווה מהירה הבוחנת את כמות המוצר שנוצר במרווחי זמן קצרים (&lt;1 שניות) לפני שלב המצב יציב ומתאים לשיעור של 8 oxoG-כריתה (כלומר כימיה). הצעד הכימי גם ניתן למדוד באמצעות גישה יחידה שבו רכיבה על אופניים מחזור הקטליטי הואלמנוע על ידי דנ&quot;א מצע להרוות עם אנזים (E&gt; S). גישות אלו יכולות למדוד את קבועי קצב יסודיים המשפיעים על היעילות של הסרת נגע ה-DNA.

ניתוח הקינטית מצב יציב בוצע על ידי שימוש במצע DNA ננומטר 200 וארבעה ריכוזים שונים של OGG1 לכאורה (15, 30, 45, ו -60 ננומטר), כפי שנקבע על ידי רדפורד assay חלבון 2. את הקורסים בזמן של היווצרות מוצר שיתאימו למשוואה ליניארית כדי לקבוע 26 ננומטר, בהתאמה, ביחס לכל ריכוז חלבון (איו?...

Watch this Scientific Journal Video about Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity at JoVE.com

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

קורסי זמן לפעילות glycosylase של glycosylase-DNA של 8 oxoguanine הם biphasic מפגין פרץ של היווצרות מוצר ושלב מצב יציב ליניארי. תוך שימוש בטכניקות להרוות-זרימה, פרץ וניתן למדוד את שיעורי המצב יציב, אשר תואמות לכריתה של 8-oxoguanine ושחרורו של glycosylase מ-DNA של המוצר, בהתאמה.

מדידת מצב יציב, טרום מצב יציב, וחד מחזור קינטי לפעילות ה-DNA Glycosylase

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8217;-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

HPLC המדידה של ה- DNA חמצון ביומרקר, 8-אוקסו-7,8-Dihydro-2&#39;-deoxyguanosine, בתאים בתרבית ורקמות בעלי החיים

Oxidative stress is associated with many physiological and pathological processes, as well as xenobiotic metabolism, leading to the oxidation of ...

Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation

הכנת מצעים נציץ והסיליקון לDNA אוריגמי ניתוח וניסויים

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of ...

Ethylene Polymerizations Using Parallel Pressure Reactors and a Kinetic Analysis of Chain Transfer Polymerization

Polymerizations אתילן באמצעות כורי לחץ מקבילים וניתוח קינטי של העברת פלמור שרשרת

We demonstrate a method for high-throughput catalyst screening using a parallel pressure reactor starting from the initial synthesis of a nickel ...

Fabrication and Testing of Photonic Thermometers

ייצור ובדיקה של מדי חום פוטוני

In recent years, a push for developing novel silicon photonic devices for telecommunications has generated a vast knowledge base that is now being ...

Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

המדידה בו זמנית HDAC1 ופעילות HDAC6 הלה תאים באמצעות UHPLC-MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since ...

Disentangling High Strength Copolymer Aramid Fibers to Enable the Determination of Their Mechanical Properties

Disentangling חוזק גבוה קופולימר ארמיד סיבים כדי לאפשר קביעת תכונות מכניות שלהם

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to ...

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

היבט טכני של סינתזה אוטומטי הערכה בזמן אמת קינטי של [11ג] הצמד-7941

Positron emission tomography (PET) is an essential molecular imaging technique providing insights into pathways and using specific targeted radioligands ...

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR-מבוסס על פעילות מבוססת על קביעת עיכוב מורכבים, IC50 ערכים, פעילות פרועובדתית, ואת הפעילות התא כולו של נוקלאוטילסייד הריבוליטיות

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment ...