Name: steady-state, pre-steady-state, and single-turnover kinetic measurement for dna glycosylase activity
Uploaded: 2013-08-19T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity at JoVE.com

Ringraziamo il Dott. Julie K. Horton per la lettura critica del manoscritto e il Dr. Rajendra Prasad per utili suggerimenti e discussioni. Porzioni di questa ricerca sono stati originariamente pubblicati nel Journal of Biological Chemistry, Sassa A et. al., &quot;sequenza di DNA effetti di contesto sulla attività Glycosylase di Human Glycosylase DNA 8-oxoguanine.&quot; J Biol Chem. 287, 36.702-36.710 (2012) 2. Questo lavoro è stato sostenuto, in tutto o in parte, dal National Institutes of Health Research Project di Grant Z01-ES050158 nel programma di ricerca intramurale, NIEHS.

1. Preparazione di enzima e substrato di DNA <ol><li> Over-express OGG1 come proteina di fusione GST-in E. coli, utilizzano il GST-tag per la purificazione, e quindi rimuovere il GST-tag per scissione con HRV-3C proteasi (Figura 1) 6. </li><li> Acquistare la sintesi chimica 5&#39;-6-carbossifluoresceina (6-FAM) oligonucleotide marcato contenente un singolo residuo di 8-oxoG e il suo complementare senza etichetta oligonucleotide filamento. Gli oligonucleotidi 34-mer contengono un 8-...

<ol>
	<li>Porello, S. L., Leyes, A. E., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-turnover+and+pre-steady-state+kinetics+of+the+reaction+of+the+adenine+glycosylase+MutY+with+mismatch-containing+DNA+substrates.">Single-turnover and pre-steady-state kinetics of the reaction of the adenine glycosylase MutY with mismatch-containing DNA substrates.</a> Biochemistry. 37, 14756-14764 (1998).</li><li>Sassa, A., Beard, W. A., Prasad, R., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequence+context+effects+on+the+glycosylase+activity+of+human+8-oxoguanine+DNA+glycosylase.">DNA sequence context effects on the glycosylase activity of human 8-oxoguanine DNA glycosylase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287, 36702-36710 (2012).</li><li>Wong, I., Lundquist, A. J., Bernards, A. S., Mosbaugh, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presteady-state+analysis+of+a+single+catalytic+turnover+by+Escherichia+coli+uracil-DNA+glycosylase+reveals+a+"pinch-pull-push"+mechanism.">Presteady-state analysis of a single catalytic turnover by Escherichia coli uracil-DNA glycosylase reveals a "pinch-pull-push" mechanism.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277, 19424-19432 (1074).</li><li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+transient-state+kinetics.">Advances in transient-state kinetics.</a> Current Opinion in Biotechnology. 9, 87-89 (1998).</li><li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+kinetic+analysis+of+mechanochemical+adenosinetriphosphatases.">Rapid kinetic analysis of mechanochemical adenosinetriphosphatases.</a> Methods in Enzymology. 134, 677-705 (1986).</li><li>Kovtun, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OGG1+initiates+age-dependent+CAG+trinucleotide+expansion+in+somatic+cells.">OGG1 initiates age-dependent CAG trinucleotide expansion in somatic cells.</a> Nature. 447, 447-452 (2007).</li><li>Hill, J. W., Hazra, T. K., Izumi, T., Mitra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+human+8-oxoguanine-DNA+glycosylase+by+AP-endonuclease:+potential+coordination+of+the+initial+steps+in+base+excision+repair.">Stimulation of human 8-oxoguanine-DNA glycosylase by AP-endonuclease: potential coordination of the initial steps in base excision repair.</a> Nucleic Acids Research. 29, 430-438 (2001).</li><li>Zharkov, D. O., Rosenquist, T. A., Gerchman, S. E., Grollman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+and+reaction+mechanism+of+murine+8-oxoguanine-DNA+glycosylase.">Substrate specificity and reaction mechanism of murine 8-oxoguanine-DNA glycosylase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275, 28607-28617 (2000).</li><li>Waters, T. R., Swann, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+the+action+of+thymine+DNA+glycosylase.">Kinetics of the action of thymine DNA glycosylase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273, 20007-20014 (1998).</li><li>Nilsen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excision+of+deaminated+cytosine+from+the+vertebrate+genome:+role+of+the+SMUG1+uracil-DNA+glycosylase.">Excision of deaminated cytosine from the vertebrate genome: role of the SMUG1 uracil-DNA glycosylase.</a> The EMBO Journal. 20, 4278-4286 (2001).</li><li>Gill, S. C., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculation+of+protein+extinction+coefficients+from+amino+acid+sequence+data.">Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data.</a> Analytical Biochemistry. 182, 319-326 (1989).</li><li>Van de Berg, ., Beard, B. J., A, W., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+structure+and+aspartate+276+influence+nucleotide+binding+to+human+DNA+polymerase+beta.+Implication+for+the+identity+of+the+rate-limiting+conformational+change.">DNA structure and aspartate 276 influence nucleotide binding to human DNA polymerase beta. Implication for the identity of the rate-limiting conformational change.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276, 3408-3416 (2001).</li><li>Krishnamurthy, N., Haraguchi, K., Greenberg, M. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+versus+repair:+NEIL1+removal+of+hydantoin+lesions+in+single-stranded,+bulge,+bubble,+and+duplex+DNA+contexts.">Mutation versus repair: NEIL1 removal of hydantoin lesions in single-stranded, bulge, bubble, and duplex DNA contexts.</a> Biochemistry. 49, 1658-1666 (2010).</li><li>Leipold, M. D., Workman, H., Muller, J. G., Burrows, C. J., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+and+removal+of+oxidized+guanines+in+duplex+DNA+by+the+base+excision+repair+enzymes+hOGG1,+yOGG1,+and+yOGG2.">Recognition and removal of oxidized guanines in duplex DNA by the base excision repair enzymes hOGG1, yOGG1, and yOGG2.</a> Biochemistry. 42, 11373-11381 (2003).</li><li>Robey-Bond, S. M., Barrantes-Reynolds, R., Bond, J. P., Wallace, S. S., Bandaru, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clostridium+acetobutylicum+8-oxoguanine+DNA+glycosylase+(Ogg)+differs+from+eukaryotic+Oggs+with+respect+to+opposite+base+discrimination.">Clostridium acetobutylicum 8-oxoguanine DNA glycosylase (Ogg) differs from eukaryotic Oggs with respect to opposite base discrimination.</a> Biochemistry. 47, 7626-7636 (2008).</li><li>Jarem, D. A., Wilson, N. R., Delaney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-dependent+DNA+damage+and+repair+in+a+trinucleotide+repeat+sequence.">Structure-dependent DNA damage and repair in a trinucleotide repeat sequence.</a> Biochemistry. 48, 6655-6663 (2009).</li><li>Livingston, A. L., Kundu, S., Henderson Pozzi, M., Anderson, W. D., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+roles+of+tyrosine+82+and+glycine+253+in+the+Escherichia+coli+adenine+glycosylase+MutY.">Insight into the roles of tyrosine 82 and glycine 253 in the Escherichia coli adenine glycosylase MutY.</a> Biochemistry. 44, 14179-14190 (2005).</li><li>Kundu, S., Brinkmeyer, M. K., Livingston, A. L., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenine+removal+activity+and+bacterial+complementation+with+the+human+MutY+homologue+(MUTYH)+and+Y165C,+G382D,+P391L+and+Q324R+variants+associated+with+colorectal+cancer.">Adenine removal activity and bacterial complementation with the human MutY homologue (MUTYH) and Y165C, G382D, P391L and Q324R variants associated with colorectal cancer.</a> DNA Repair. 8, 1400-1410 (2009).</li><li>Zharkov, D. O., Rosenquist, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+mammalian+8-oxoguanine-DNA+glycosylase+by+cadmium(II):+implications+for+cadmium+genotoxicity.">Inactivation of mammalian 8-oxoguanine-DNA glycosylase by cadmium(II): implications for cadmium genotoxicity.</a> DNA Repair. 1, 661-670 (2002).</li><li>Jarem, D. A., Wilson, N. R., Schermerhorn, K. M., Delaney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+and+persistence+of+8-oxo-7,8-dihydroguanine+within+a+hairpin+intermediate+exacerbates+a+toxic+oxidation+cycle+associated+with+trinucleotide+repeat+expansion.">Incidence and persistence of 8-oxo-7,8-dihydroguanine within a hairpin intermediate exacerbates a toxic oxidation cycle associated with trinucleotide repeat expansion.</a> DNA Repair. 10, 887-896 (2011).</li><li>Mokkapati, S. K., Wiederhold, L., Hazra, T. K., Mitra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+DNA+glycosylase+activity+of+OGG1+by+NEIL1:+functional+collaboration+between+two+human+DNA+glycosylases.">Stimulation of DNA glycosylase activity of OGG1 by NEIL1: functional collaboration between two human DNA glycosylases.</a> Biochemistry. 43, 11596-11604 (2004).</li><li>Sidorenko, V. S., Nevinsky, G. A., Zharkov, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+interaction+between+human+8-oxoguanine-DNA+glycosylase+and+AP+endonuclease.">Mechanism of interaction between human 8-oxoguanine-DNA glycosylase and AP endonuclease.</a> DNA Repair. 6, 317-328 (2007).</li></ol>

Gli approcci cinetici descritti qui delineare i metodi per definire le costanti cinetiche elementari. Se un corso di tempo di formazione del prodotto è bifasica con il primo turnover enzimatico verificano rapidamente, poi un passo dopo chimica è limitante durante le successive rotazioni catalitici. Nel caso del OGG1, primo turnover può essere misurata usando concentrazioni elevate di enzimi sia con limitatore (S &lt;E) o alto (S&gt; E) concentrazioni di DNA. Nel primo caso, la reazione è limitata ad un &#39;singolo ...

Un ambiente aerobico affretta instabilità genomica. Un grave lesione del DNA promutagena che si realizza derivanti da stress ossidativo è 7,8-diidro-8-oxoguanine (8-oxoG). Ciò è dovuto al potenziale codifica ambiguo di 8-oxoG. Umana 8-oxoguanine DNA glicosilasi (OGG1) è responsabile dell&#39;avvio base di riparazione per escissione di 8-oxoG. L&#39;attività glicosilasi di OGG1 accise della base 8-oxoG conseguente DNA prodotto con un sito apurinico (AP-site). Una debole attività liasi di OGG1 può incidere la AP-site in alcuni casi. Caratterizzazione cinetica di glycosylases DNA trova generalmente tale da presentare i corsi tempo bifasico. Dopo una fase iniziale di rapida formazione del prodotto (cioè burst), una fase di stato lineare si osserva 1-3. Questo comportamento è indicativo di un passo successivo di chimica (cioè cambiamento conformazionale o rilascio di prodotto) essendo limitante durante la porzione lineare del corso di tempo, mentre la fresast fase, spesso definito come la fase transitoria, corrisponde alla formazione del prodotto presso il sito attivo dell&#39;enzima durante il primo ciclo della reazione. Quando rilascio del prodotto è il tasso di limitare durante la fase a regime, misure di attività forniscono una misura qualitativa del DNA prodotto affinità di legame, ma non forniscono informazioni cinetica relativa eventi presso il sito attivo dell&#39;enzima (cioè chimica). Pertanto, sono necessari metodi per isolare e misurare la fase di pre-scoppio stazionario esponenziale per sondare eventi durante la prima turnover enzimatica a 4 sito attivo dell&#39;enzima. Ci sono tre approcci cinetici standard per caratterizzare il comportamento catalitico di OGG1, (1) allo stato stazionario, (2) pre-steady-state, e (3) un solo fatturato. Questi approcci differiscono l&#39;uno dall&#39;altro per la concentrazione di enzima nella miscela di reazione e l&#39;enzima di rapporto substrato utilizzato in ogni approccio. In un tipico approccio di stato stazionario,talvolta indicato come multipli cinetica fatturato, basse concentrazioni di enzima sono usati per seguire formazione del prodotto. La concentrazione del substrato supera notevolmente la concentrazione dell&#39;enzima modo che più fatturati enzimatiche non influenzano significativamente la concentrazione del substrato. In questa situazione, i corsi tempo dovrebbe essere lineare e spesso è difficile discernere se un burst avvenute nella prima turnover causa della bassa concentrazione di enzima usato in questo approccio, si noti che l&#39;ampiezza di scoppio è equivalente alla concentrazione dell&#39;enzima. Questo può essere superato utilizzando una concentrazione dell&#39;enzima superiore ed estrapolando il decorso lineare per tempo zero per rilevare se il primo turnover enzimatico verificato rapidamente. L&#39;intercetta sulle ordinate (asse y) deve essere proporzionale alla concentrazione dell&#39;enzima e fornisce una misura dell&#39;enzima attivamente impegnati con il substrato. Sebbene questo approccio può in linea di principio fornire prova dell&#39;esistenza di una fase di scoppio, una differenti approccio è necessario per misurare la cinetica della fase di scoppio. In molti casi la fase di scoppio è troppo veloce per misurare con tecniche di miscelazione e spegnimento manuali. In questa situazione, cinetico pre-stazionario e single-turnover (cioè cinetica transitoria) avvicina spesso richiedono uno strumento rapida miscelazione e tempra a seguire primi punti di tempo di una reazione 5. In un approccio pre-stazionario alte concentrazioni di enzima vengono utilizzati in modo che una quantità significativa di prodotto si forma durante la prima turnover. Poiché più fatturati vengono seguiti per osservare ciclismo catalitico (cioè la fase lineare che segue il burst), concentrazione del substrato è maggiore della concentrazione dell&#39;enzima ([enzima] &lt;[substrato]). Per isolare eventi al sito attivo dell&#39;enzima senza il ciclo catalitico, le condizioni single turnover sono utilizzati. In questo caso, il substrato è saturo di enzima (E &gt;&gt; S) in modo che tutto il substrato parteciperanno in la &#39;single fatturato&#39; e in genere mostrano un corso a tempo singolo esponenziale. Come notato sopra per gli enzimi che esibiscono una fase di scoppio, rilascio del prodotto (k off) spesso limita la velocità della fase di stato del corso tempo. Il tasso di rilascio del prodotto (. / Ora v ss, conc) può essere determinato dalla pendenza della fase di stato lineare. La concentrazione di enzima attivo (E) è necessaria per convertire la velocità di rilascio del prodotto per una costante di velocità intrinseca dove k off = v ss / [E]. È importante sottolineare che la concentrazione di enzima attivo è tipicamente inferiore alla concentrazione misurata proteina causa di impurità, enzima inattivo, enzima non legato a produttivamente substrato, e il metodo utilizzato per determinare la concentrazione di proteina. La concentrazione di enzima attivo può essere determinata dalla ampiezza scoppio quando rilascio del prodotto è lenta. Così, estrapolando un corso a tempo di stato stazionario pertempo zero fornisce una stima di enzima attivo necessari per calcolare k off (rilascio del prodotto) dal tasso di steady-state osservato. Per misurare la cinetica di scoppio, un approccio pre-stazionario è necessario seguire la formazione del prodotto durante la prima rotazione che avviene prima della fase di stato lineare. La cinetica di burst segue la formazione di enzima prodotto intermedio. Una volta che la reazione è avviata da miscelazione con substrato enzimatico, la quantità di enzima prodotto aumenta rapidamente finché la reazione raggiunge una fase di crociera. Se catalisi è molto più rapida di quella di rilascio del prodotto, l&#39;ampiezza del burst è uguale enzima attivamente impegnati e l&#39;approccio esponenziale osservata all&#39;equilibrio (k obs) corrisponde al tasso di conversione chimica del substrato a prodotto, ipotizzando che il tasso inverso chimica è trascurabile. In alcuni casi cy cataliticoaggrappano interferisce con un&#39;analisi pre-steady-state, ad esempio quando le grandezze delle tariffe per la chimica e la release del prodotto non sono significativamente differenti. In questo caso, impiegando enzima eccesso rispetto al substrato impedisce ciclismo catalitica e limiti substrato legato con enzima per un singolo turnover. Pertanto, la prima fase della reazione chimica può essere isolato e accuratamente determinato come la costante di velocità di primo ordine (k obs). Questa costante tasso dovrebbe essere simile a K obs determinata da un approccio pre-stazionario sopra descritto. Qui si descrive come questi approcci cinetici possono essere utilizzati per analizzare l&#39;attività glicosilasi di OGG1.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5'-6-FAM labeled oligonucleotides containing a single 8-oxoG</td>
 <td>Eurofins MWG Operon</td>
 <td></td>
 <td>5'-P32 radiolabeled oligonucleotides can be used as well. Polyacrylamide gel purification grade is recommended. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Unlabeled oligonucleotides (complementary strand)</td>
 <td>Eurofins MWG Operon</td>
 <td></td>
 <td>Polyacrylamide gel purification grade is recommended. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 ml BD Luer Lock disposable syringe</td>
 <td>BD Medical</td>
 <td>309628</td>
 <td>Lue Lock disposable syringe from other vendors can be used as well.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 ml BD Luer Lock disposable syringe</td>
 <td>BE Medical</td>
 <td>309604</td>
 <td>Luer Lock disposable syringe from other vendors can be used as well.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Circulating water bath</td>
 <td>Any vender</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RQF-3 Rapid Quench-Flow Instrument</td>
 <td>KinTek Corporation</td>
 <td></td>
 <td>Rapid Quench-Flow Instrument from other vendors can be used as well.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Typhoon Phosphorimager 8600</td>
 <td>GE Healthcare Life Sciences</td>
 <td></td>
 <td>Imager from other vendors can be used as well.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KaleidaGraph</td>
 <td>Synergy Software</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

steady-state, pre-steady-state, and single-turnover kinetic measurement for dna glycosylase activity

Umana 8-oxoguanine DNA glicosilasi (OGG1) accise il mutageno ossidativo lesione del DNA 8-oxo-7 ,8-dihydroguanine (8-oxoG) dal DNA. Caratterizzazione cinetica di OGG1 è intrapresa per misurare i tassi di escissione 8-oxoG e rilascio del prodotto. Quando la concentrazione è inferiore OGG1 DNA substrato, andamento nel tempo della formazione del prodotto siano bifasici, una rapida fase esponenziale (cioè burst) di formazione del prodotto è seguita da una fase di stato lineare. Il burst iniziale di formazione del prodotto corrisponde alla concentrazione di enzima agganciati bene sul substrato, e l&#39;ampiezza scoppio dipende dalla concentrazione di enzima. La costante del burst di velocità di primo ordine corrisponde alla frequenza intrinseca di escissione 8-oxoG e il tasso di stato stazionario lento misura il tasso di rilascio del prodotto (prodotto di DNA tasso costante di dissociazione, k off). Qui, descriviamo approcci allo steady-state, pre-steady-state, e single-fatturato di isolare e misurare sppassi ecific durante OGG1 ciclismo catalitico. Un oligonucleotide marcato fluorescente lesione contenente OGG1 purificati e sono utilizzati per facilitare misurazioni cinetiche precise. Poiché le concentrazioni enzimatiche basse sono utilizzate per effettuare misurazioni di stato stazionario, manuale miscelazione dei reagenti e tempra della reazione può essere eseguita per accertare il tasso di stato stazionario (k off). Ulteriormente, estrapolazione del tasso steady state ad un punto in ordinata al tempo zero indica che un burst di formazione del prodotto è verificato durante la prima turnover (cioè intercetta è positivo). La costante della fase di scoppio esponenziale di velocità di primo ordine può essere misurata usando una tecnica di miscelazione e tempra rapida che esamina la quantità di prodotto formato ad intervalli di tempo brevi (&lt;1 sec) prima della fase stazionaria e corrisponde al tasso di 8 -oxoG escissione (cioè chimica). Il passo chimica può anche essere misurata utilizzando un approccio a singolo giro d&#39;affari in cui il ciclismo catalitica èimpedito saturando DNA substrato con l&#39;enzima (E&gt; S). Questi approcci possono misurare le costanti di velocità elementari che influenzano l&#39;efficienza di rimozione di una lesione del DNA.

Analisi cinetica è costante viene eseguita utilizzando 200 nM DNA substrato e quattro differenti concentrazioni apparenti di OGG1 (15, 30, 45, e 60 nM), come determinato mediante un saggio di proteina Bradford 2. Relativi tempi di formazione del prodotto erano idonei ad una equazione lineare per determinare l&#39;intercetta, che erano 2,2, 11, 15, e 26 nM, rispettivamente, relativi a ciascuna concentrazione di proteina (Figura 2B). L&#39;Y-intercettazioni stati ulteriormente tracciate relati...

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Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

Corsi a tempo per l&#39;attività glicosilasi di 8-oxoguanine glicosilasi DNA sono bifasica esibendo una raffica di formazione del prodotto e una fase a regime lineare. Utilizzando tecniche di quench-flow, lo scoppio e le tariffe di stato stazionario possono essere misurati, che corrispondono ad escissione di 8-oxoguanine e rilascio della glicosilasi dal DNA prodotto, rispettivamente.

Allo steady-state, Pre-steady-state, e Single-fatturato di misura cinetica per il DNA Glycosylase Activity

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Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

Aspetto tecnico della sintesi automatizzata e valutazione cinetica in tempo reale di [11C]SNAP-7941

Positron emission tomography (PET) is an essential molecular imaging technique providing insights into pathways and using specific targeted radioligands ...

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

Assaggi di attività basati su NMR per determinare l'inibizione composta, i valori IC50, l'attività Artifactual e l'attività intera delle cellule

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment ...

A Femtoliter Droplet Array for Massively Parallel Protein Synthesis from Single DNA Molecules

Un array di gocciole del femtolitro per sintesi proteica massicciamente parallela da molecole di DNA singolo

Advances in spatial resolution and detection sensitivity of scientific instrumentation make it possible to apply small reactors for biological and ...

Quantitative Atomic-Site Analysis of Functional Dopants/Point Defects in Crystalline Materials by Electron-Channeling-Enhanced Microanalysis

Analisi quantitativa del sito atomico dei difetti funzionali dei droganti/punti nei materiali cristallini mediante microanalisi potenziata dal canale elettronico