Name: immobilization of multi-biocatalysts in alginate beads for cofactor regeneration and improved reusability
Uploaded: 2016-04-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability at JoVE.com

Dit onderzoek werd gesteund door Basic Science Research Program door de National Research Foundation Korea (NRF), gefinancierd door het Ministerie van Onderwijs, Wetenschap en Technologie (NRF-2013R1A1A2012159 en NRF-2013R1A1A2007561), Konkuk University, en het Department of Chemical Engineering en mCubed Program aan de Universiteit van Michigan.

1. Whole-cell Biokatalysatoren Voorbereiding LET OP: De recombinante E. coli cellen die pET28a- SpNox 31 of pET28a- HjLAD 28 zijn hierna E. SpNox coli en E. coli HjLAD respectievelijk. <ol><li> Inoculeer een enkele kolonie van E. coli HjLAD in 3 ml Luria-Bertani (LB) medium aangevuld met kanamycine (50 ug / ml) en geïncubeerd in een incubator shaker O / N bij 37 ° C, 250 rpm. </li>...

Recente technologische ontwikkelingen hebben een sterke stijging in de commercialisering van recombinant biotherapeutica ingeschakeld, wat resulteert in een geleidelijke stijging van hun marktwaarde in de biotechnologie-industrie. Eén zo&#39;n vooruitgang is de komst van metabolic engineering in recombinante micro-organismen, die een grote belofte bij het ​​vaststellen schaalbare industriële systemen 38 is getoond. Zoals bij de meeste processen succesvolle commercialisering van recombinant biomoleculen ...

Reductieve hele cellen biotransformatie middels micro-organismen is uitgegroeid tot een wijdverspreide werkwijze voor de chemo-enzymatische synthese van commercieel en therapeutisch belangrijke biomoleculen 1-3. Het biedt verschillende voordelen boven het gebruik van geïsoleerde enzymen, met name de eliminatie van dure stroomafwaartse zuiveringsprocessen en de demonstratie van een langere levensduur 4-7. Voor biokatalytische paden indien cofactoren nodig voor productvorming, whole-cell-systemen is in situ cofactorregeneratiesysteem te voorzien via de toevoeging van goedkope elektronendonerende cosubstraten 5,8,9. Dit is echter verminderd vermogen voor reacties die een stoichiometrische concentratie van zeldzame en dure cosubstraten 10 vereisen - 13. Samen met een slechte hergebruik van hele cellen, belemmert dit de oprichting van een schaalbare en continue productie systeem. Strategische modificaties volle-celsystemen deze cofactor-afhankelijke biotransformaties moeten de bovengenoemde beperkingen te overwinnen. Specifiek zijn de combinatie van whole-cell biokatalysatoren die samen te werken aangetoond aanzienlijke verbetering van de productiviteit en stabiliteit van de enzymen 14 herbergde. Deze factoren, die vaak kritiek voor het mogelijk maken grootschalige productie van commercieel levensvatbare producten zijn, kunnen verder worden geoptimaliseerd door co-immobiliseren biokatalytische microben 15. We hebben onlangs een eenvoudige en herbruikbare whole-cell biokatalytische systeem dat zowel cofactorregeneratiesysteem en biokatalysator immobilisatie maakt de L-xylulose productie 16. In deze studie werd dit systeem gebruikt als een voorbeeld voor de experimentele procedures van toepassing van deze twee strategieën voor verbeterde productieopbrengst biotransformatie en biokatalysator herbruikbaarheid illustreren. L-xylulose behoort tot een class van biologisch bruikbare moleculen genaamd zeldzame suikers. Zeldzame suikers zijn uniek monosachariden of suiker derivaten die zeer zelden in de natuur voorkomen, maar een cruciale rol spelen als een erkenning elementen in biologisch actieve moleculen 17,18. Ze hebben een verscheidenheid aan toepassingen, variërend van zoetstoffen, functionele voedingsmiddelen potentiële therapeutische 19. L-xylulose kunnen worden gebruikt als een mogelijke remmer van verschillende α-glucosidases, en kunnen ook worden gebruikt als een indicator van hepatitis of levercirrose 17,20. Hoge omzettingsefficiëntie van xylitol L-xylulose geheel-celsystemen werd voorheen in Pantoea ananatis 21,22, Alcaligenes sp. 701B 23, Bacillus pallidus Y25 24,25 en Escherichia coli 26. In E. coli, maar het werd uitsluitend gebruik van lage (&lt;67 mM) concentraties xylitol 26 vanwege mogelijke remmende effecten van een eerste xylitol concentratie hoger dan 100 mM xylitol on-4-dehydrogenase activiteit 21,26. Thermodynamisch evenwicht tussen xylulose en xylitol is blijkt sterk begunstigen de vorming van xylitol 25,27. Bovendien wordt xylulose opbrengst beperkt door de hoeveelheid dure cofactoren die bij afwezigheid van een in situ cofactorregeneratiesysteem te leveren hebben. Samen vormen deze factoren beperken de mogelijkheden voor schaalvergroting in duurzame systemen voor de L-xylulose biosynthese. Om deze beperkingen te overwinnen en het verbeteren van de L-xylulose biotransformatie opbrengst, werd de strategie van cofactorregeneratiesysteem eerste in dienst van de oprichting van een gekoppelde whole-cell biokatalytische systeem. Specifiek, L-arabinitol 4-dehydrogenase (EC 1.1.1.12) van Hypocrea jecorina (HjLAD), een enzym in de L-arabinose afbraakproduct van schimmels, werd geselecteerd om de omzetting van L-arabinitol katalyseren in L-xylulose 28,29 . Net als veel biosynthetische enzymen, een belangrijke BEPERKIn van HjLAD is dat het een stoichiometrische hoeveelheid van het dure nicotinamide adenine dinucleotide-cofactor (NAD +, de geoxideerde vorm van NADH) deze omzetting uit te voeren. NADH oxidase in Streptococcus pyogenes (SpNox) is aangetoond dat hoge cofactor-activiteit regeneratie 30,31 weergegeven. Door gebruik te maken van deze eigenschap van SpNox, E. coli-cellen die HjLAD voor de productie van L-xylulose gekoppeld met E. coli-cellen die SpNox voor de regeneratie van NAD + op de L-xylulose productie beschreven door gekoppelde reactie figuur 1A stimuleren. Onder optimale omstandigheden en met een aanvankelijke concentratie van 150 mM L-arabinitol, de maximale L-xylulose opbrengst bedroeg 96%, waardoor dit systeem veel efficiënter dan die gerapporteerd in de literatuur. De strategie van whole-cell immobilisatie werd gebruikt naast de verdere versterking van de herbruikbaarheid van de gekoppelde biocatalytic-systeem. Algemeen gebruikte werkwijzen voor whole-cell immobilisatie omvatten adsorptie / covalente koppeling aan vaste matrices, verknoping / invangen en inkapselen in polymere netwerken 32. Onder deze benaderingen, de meest geschikte methode voor mobiele inkapseling immobilisering in calciumalginaat parels. Hun milde geleringseigenschappen, inerte waterige matrix en hoge porositeit bijdragen aan het behoud van de fysiologische eigenschappen en functionaliteit van de ingekapselde biologicals 33. Daarom is de combinatie biokatalysator systeem dat zowel E. coli cellen die HjLAD of SpNox geïmmobiliseerd in calciumalginaat parels meerdere cycli van L-xylulose productiewijzen (figuur 2) .De geïmmobiliseerde biokatalysator systeem aangetoond operationeel stabiel handhaven 65% van het omzettingsrendement van de eerste cyclus na 7 cycli opeenvolgende hergebruik, terwijl de vrije celsysteem de katalytische activiteit bijna volledig verloren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="801">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">LB broth&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L3022-6X1KG</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP906-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Isopropyl &#946;-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I6758-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Tris base</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">B-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">N7004-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">L-Arabinitol</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A3506-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">L-Cysteine</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">168149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Sulfuric acid</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">320501-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Carbazole</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C5132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Ethanol&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP2818-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Sodium alginate</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">W201502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">223506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Excella E24 shaker incubator</td>
			<td style="width:200px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td style="width:200px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Centrifuge 5810R</td>
			<td style="width:200px;">Eppendrof</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Beakers</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Syringe</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Needle</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Pioneer Analytical and Precision Weighing Balance</td>
			<td style="width:200px;">Ohaus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immobilization of multi-biocatalysts in alginate beads for cofactor regeneration and improved reusability

We hebben onlangs een eenvoudige, herbruikbaar en gekoppeld whole-cell biokatalytische systeem de mogelijkheid cofactorregeneratiesysteem en biokatalysator immobilisatie verbeterde productieopbrengst en aanhoudende synthese. Beschreven is hierbij de experimentele procedure voor de ontwikkeling van een dergelijk systeem bestaat uit twee E. coli-stammen die functioneel complementair zijn enzymen uit te drukken. Samen kunnen deze twee enzymen functioneren coöperatief aan de regeneratie van kostbare co-factoren bemiddelen betere productopbrengst van de bioreaction. Bovendien wordt de werkwijze voor het synthetiseren van een geïmmobiliseerde vorm van het gekoppelde biokatalytische systeem inkapselen van gehele cellen in calciumalginaat parels gerapporteerd. Als voorbeeld geven we de verbeterde biosynthese van L-xylulose van L-arabinitol door koppeling E. coli-cellen die de enzymen L-arabinitol dehydrogenase en NADH oxidase. Onder optimale omstandigheden en met een beginconcentratie van 150mM L-arabinitol, de maximale L-xylulose opbrengst bedroeg 96%, wat hoger is dan die in de literatuur. De geïmmobiliseerde vorm van de gekoppelde whole-cell biokatalysatoren aangetoond operationeel stabiel handhaven 65% van de opbrengst verkregen bij de eerste cyclus na 7 cycli van opeenvolgende hergebruik, terwijl de vrije celsysteem de katalytische activiteit bijna volledig verloren. Daarom is de hier vermelde werkwijzen levert twee strategieën die kunnen bijdragen aan de industriële productie van L-xylulose, alsmede andere verbindingen met toegevoegde waarde waarbij het gebruik van co-factoren in het algemeen.

Om cofactor regeneratie mogelijk te maken, werd L-xylulose synthese in een gekoppelde whole-cell biokatalytische systeem dat E. uitgevoerd HjLAD coli en E. SpNox coli cellen. Na de optimalisering van verschillende parameters, de herbruikbaarheid van het systeem verbeterd door immobiliseren in calciumalginaat parels (figuur 2). ...

Watch this Scientific Journal Video about Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability at JoVE.com

Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability

Weergegeven is het protocol voor co-immobiliserende hele cellen biokatalysatoren voor cofactorregeneratiesysteem en betere herbruikbaarheid, via de productie van L-xylulose als voorbeeld. De cofactor regeneratie wordt bereikt door het koppelen van twee Escherichia coli-stammen die functionele complementariteit enzymen; de hele cellen biokatalysator immobilisatie wordt bereikt door celinkapselende in calciumalginaat parels.

Immobilisatie van Multi-biokatalysatoren in Alginaat Kralen voor cofactorregeneratiesysteem en verbeterde Herbruikbaarheid

We have recently developed a simple, reusable and coupled whole-cell biocatalytic system with the capability of cofactor regeneration and biocatalyst ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Improved In-gel Reductive &#946;-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

Improved In-gel Reductive ÃƒÅ½Ã‚Â²-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

Verbeterde In-gel Reductive β-eliminatie voor Comprehensive O-gebonden en Sulfo-glycomics door massaspectrometrie

Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of ...

Microbubble Fabrication of Concave-porosity PDMS Beads

Microbellen Fabrication van Concave-porositeit PDMS Beads

Microbubble fabrication (by use of a fine emulsion) provides a means of increasing the surface-area-to-volume (SAV) ratio of polymer materials, which is ...

Improved Heterojunction Quality in Cu2O-based Solar Cells Through the Optimization of Atmospheric Pressure Spatial Atomic Layer Deposited Zn1-xMgxO

Improved Heterojunction Quality in Cu2O-based Solar Cells Through the Optimization of Atmospheric Pressure Spatial Atomic Layer Deposited Zn1-xMgxO

Verbeterde Heterojunction Kwaliteit in Cu<sub&gt; 2</sub&gt; O-gebaseerde zonnecellen door het optimaliseren van de atmosferische druk Ruimtelijke Atomic Layer Afgezet<br /&gt; Zn<sub&gt; 1-x</sub&gt; Mg<sub&gt; x</sub&gt; O

Atmospheric pressure spatial atomic layer deposition (AP-SALD) was used to deposit n-type ZnO and Zn1-xMgxO thin films onto p-type thermally oxidized Cu2O ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Eiwitsynthese Bioconjugaten<em&gt; via</em&gt; Cysteïne-maleïmide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Surface Functionalization of Metal-Organic Frameworks for Improved Moisture Resistance

Oppervlakte Functionalization van metaal-organische kaders voor verbeterde vochtbestendigheid

Metal-organic frameworks (MOFs) are a class of porous inorganic materials with promising properties in gas storage and separation, catalysis and sensing. ...

Bio-inspired Polydopamine Surface Modification of Nanodiamonds and Its Reduction of Silver Nanoparticles

Bio-inspired Polydopamine oppervlak wijziging van Nanodiamonds en de vermindering van zilveren nanodeeltjes

Surface functionalization of nanodiamonds (NDs) is still challenging due to the diversity of functional groups on the ND surfaces. Here, we demonstrate a ...

Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

Preparation of Polypentafluorophenyl acrylate Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

Voorbereiding van Poly(pentafluorophenyl acrylate) matiemaatschappij SiO2 parels eiwitreiniging

We demonstrate a simple method to prepare poly(pentafluorophenyl acrylate) (poly(PFPA)) grafted silica beads for antibody immobilization and subsequent ...

Trimethylamine Detection in Animal-Derived Medicine by Headspace GC-MS

An Improved Technique for Trimethylamine Detection in Animal-Derived Medicine by Headspace Gas Chromatography-Tandem Quadrupole Mass Spectrometry

An Improved Technique for Trimethylamine Detection in Animal-Derived Medicine by Headspace Gas Chromatography-Tandem Quadrupole Mass Spectrometry (Video) | JoVE 

Animal-derived medicines have distinctive characteristics and significant curative effects, but most of them have an obvious fishy odor, resulting in the ...

Porphyrin-Modified Beads in Flow Cytometry

Porphyrin-Modified Beads for Use as Compensation Controls in Flow Cytometry

Porphyrin-Modified Beads for Use as Compensation Controls in Flow Cytometry (Video) | JoVE 

Porfyrine-gemodificeerde kralen voor gebruik als compensatiecontroles in flowcytometrie

Flow cytometry can rapidly characterize and quantify diverse cell populations based on fluorescence measurements. The cells are first stained with one or ...

Combining Amine-Functionalized Polystyrene Beads with TCPP Solution

Combining Amine-Functionalized Polystyrene Beads with TCPP Solution (Video) | JoVE 

Amine-gefunctionaliseerde polystyreenkralen combineren met TCPP-oplossing