이 연구는 교육 과학 기술부 (NRF-2013R1A1A2012159 및 NRF-2013R1A1A2007561), 건국 대학교의 교육부에 의해 투자 한국 연구 재단 (NRF)과 화학 공학 및 MCubed의 부서를 통해 기초 과학 연구 프로그램에 의해 지원되었다 미시간 대학의 프로그램.

1. 전체 세포 생체 촉매의 제조 참고 : 재조합 E. pET28a- SpNox 31 pET28a- HjLAD 28 대장균 형질 세포 이하 E.라고도 대장균 SpNox 및 E. 대장균 HjLAD, 각각. <ol><li> E.의 단일 식민지의 예방 37 O C, 250 rpm에서 대장균 루리아 - 베르 타니 (LB) 카나마이신 (50 μg의 / ml)로 보충 매체의 3 ㎖에 HjLAD 및 보육 통 O에 품어 / N. </li><li> 1 문화를 희석 : / ㎖ 카나마이신 50 μg의 37 O를 C 부화 포함 신선한 LB의 200ml에 100, 250 rpm으로 외경까지 600 ~ 0.6에 도달한다. </li><li> 배양액에 0.1 mM의 이소 프로필 β-D- 티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG)를 첨가하여 HjLAD 단백질 발현을 유도하고 16 O C, 16 시간 동안 180 rpm으로 배양한다. <ol><li> 또한, 25 O C, 200 RP에서 유도을 수행만약 L 생합성 크실 로스 6 HR (하기 단계 2)를위한 m 당일 행한다. </li></ol></li><li> 유도 E. 수확 4 오 ℃에서 20 분 동안 3,200 XG에 원심 분리하여 대장균 HjLAD 세포 뜨는을 취소하고 세포 펠렛을 처리하기 위해 2 단계로 진행합니다. </li><li> E. 1.4 - 병렬로 수행은 1.1 단계 대장균 SpNox. </li></ol> 2. 생합성 커플 링 E.에 의해 L 크실 로스 대장균 HjLAD 및 E. 공동 인자의 재생에 대한 대장균 SpNox <ol><li> E.의 세포 펠렛을 재현 탁 대장균 HjLAD 및 E. 콜라이 SpNox 별도로 5.0 g 건조 세포 무게 (gDCW) / L의 세포 밀도로 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.0)이다. 참고 gDCW 600 나노 미터 (OD 600)에서 측정 된 광학 밀도 사이의 상관 관계는, 실험을 용이하게 확립 할 수있다. 에 사용되는 수식이 프로토콜은 1 gDCW / L = 0.722 * OD 600 - 다른 분석기에 따라 다를 수 있습니다 0.0965. </li><li> 5.0 gDCW / L E. 600 μl를 혼합 대장균 HjLAD, 5.0 gDCW / L E. 600 μL 콜라이 SpNox, 14 mL의 20 mM의 NAD + 100 ㎕, 2 M의 L-아라 비니 150 μL 둥근 바닥 튜브 및 50 mM 트리스 - 염산 550 μL를 첨가하여이 용액에 반응 부피를 가지고 (PH 8.0) . 주 : 두 전체 세포 생 촉매의 양의 비는 제품의 생합성을 향상시키기 위해 최적화 될 수있다. 서술 된 시스템, E.의 비로 대장균 SpNox : E. 대장균 HjLAD 1 = 1이 L 크실 로스 생합성 (그림 1B)를위한 최적의 것으로 밝혀졌다. </li><li> 30의 C O 8 시간 동안 200 rpm에서 반응 혼합물을 인큐베이션. </li><li> 4 O C에서 원심 분리 한 후 상등액을 수집 3,200 XG에 10 분 A에 대한차 아래 3 단계에 설명 된대로 L 크실 로스 생산을 정량화로 진행합니다. </li></ol> L 크실 로스 정량 3. 비색 분석 <ol><li> 기음 1.5 ML 튜브로 단계 2.4에서 수집 반응 상층 액 100 ㎕. </li><li> 1.5 % 시스테인 50 μL, 70 % 황산을 900 ㎕의 에탄올에 용해 된 0.1 % 카바 졸 50 μl를 첨가하고, 튜브를 3 회 반전시켜 부드럽게 혼합한다. </li><li> 입출력 37 C, 20 분 동안 200 rpm에서 반응 혼합물을 인큐베이션. </li><li> 분광 광도계를 사용하여 560 나노 미터 (560)에서 반응 혼합물의 흡광도를 측정한다. <ol><li> 560는 A 기록이 1 이상이면, 반응 액을 희석한다. </li></ol></li></ol> 칼슘 알긴산 비즈에서 재조합 전체 셀 촉매의 고정화 (4) <ol><li> 100 ml의 증류수에 4g의 알긴산 나트륨을 녹인다. 의를 추가하여 알긴산 용액을 제조물에 대한 비난의 알긴산은 덩어리의 형성을 방지 할 수 있습니다. 필요한 경우 혼합물을 가열한다. </li><li> 5.0 gDCW / L E.의 600 μl를 추가 대장균 HjLAD 5.0 gDCW / L E. 600 μL 콜라이 SpNox 1.2 ml의 4 %의 알긴산 단계 4.1 제조 및 기포 형성을 방지하기 위해 부드럽게 피펫 팅하여 세포와 알긴산 섞는다. </li><li> 연속 교반하면서 100 ㎖ 비이커에 (염화칼슘 2) 솔루션을 바늘을 이용하여 주사기에 알지네이트 / 세포 현탁액을 대기음 및 0.3 M 염화 칼슘에 적가 혼합물을 추가합니다. 주 : 알긴산 물방울이 완전히 잠길 수 있도록 알긴산 비드 형성을 위해 사용 CaCl2를 용액의 부피가 충분해야한다. 또한, 주사​​기 바늘과 염화칼슘 수용액의 표면 사이의 거리를 균일하게 구상 비드의 형성을 보장하기 위해 최적의 범위로 유지되어야한다. 거리의 최적 범위는 실험을 결정할 수있다아군과 바늘의 내부 직경에 따라 다르다. 예상 된 바와 같이, ~ 15 ± 5 cm의 거리가 0.6 cm (내경) 주사기 바늘에 대해 최적 인 것으로 밝혀졌다. </li><li> 가교 겔 비드를 형성 할 수 있도록 교반없이 실온에서 3 시간 - 2에 대한 염화칼슘 2 용액에 구슬을 둡니다. </li><li> 조심스럽게 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 CaCl2를 용액을 부어 구슬을 방해하지 않고 CaCl2를 용액을 경사 분리하고, 또 다른 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 CaCl2를 용액에 남아있는 비드 옮긴다. </li><li> CaCl2를 과도 캡슐화되지 않은 세포를 제거하기 위해 50 mM Tris-HCl (pH8.0)을 10 ㎖로 3 회 비드 버퍼 씻는다. 노트: 주어진 단계에서 그들을 파열 것이다 이렇게 같은 구슬을 원심 분리하지 않습니다. 5 분 - 솔루션에서 구슬을 분리하기 위해, 현탁액 3 그대로 방치한다. 비드 바닥에 침전되고 세척 완충액 경사 분리 될 수있다다른 용기에. <ol><li> 사용 된 세척 버퍼를 버리지 마십시오. 단계 4.5에서 수집 CaCl2를 사용한 용액과 사용하는 트리스 -HCl의 세척 완충액 (30 ㎖)을 풀. </li></ol></li><li> 미 고정 E. 펠렛 풀링 된 CaCl2를 트리스 - 염산 용액을 원심 분리하여 대장균 세포는 20 분 동안 3200 × g으로 46 단계에서 수집. 단계 2.1에 기재된 바와 같이 고정화 효율을 결정하기 gDCW / L의 펠릿 캡슐화되지 않은 세포의 밀도를 계산한다. </li><li> 튜브로 단계 4.6에서 세척 구슬을 전송합니다. 단계 2.2에 따라 - 3.4 세포 펠렛 대신에 세정 비드를 모두 사용하여 L 크실 로스 생합성을 평가. </li></ol> L 크실 로스 생산을위한 고정화 생체 촉매 5. 안정성 분석 <ol><li> 단계 4.8에서 비드를 수집한다 (단계 4.6에 기재된 바와 같이)를 원심 분리없이 50 mM 트리스 -HCl (pH 8.0) 완충액 10 ㎖로 두 번 세척 하였다. </li><li> 모든 사용3.4 - 단계 2.2에 기재된 바와 같이 세정 비드의 반응을 수행한다. </li><li> 생산 사이클의 원하는 수의 5.2 각 사이클에서, 반응 상층 액 제조 L 크실 로스의 양을 측정 - 반복 단계 5.1. </li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언합니다. 이 신문은 알긴산 비드에 고정화 결합 된 전체 세포 생 촉매 시스템을 생성하는 자세한 방법을보고하는 것을 목적으로한다. 과학 참신은 이전의 연구 (16)에보고되었다.

최근 기술의 발전은 생명 공학 산업에서의 시장 가치의 점진적인 상승의 결과로, 재조합 biotherapeutics의 상용화에 서지을 사용할 수있다. 하나는 이러한 발전은 확장 성 산업 시스템 (38)을 구축에 큰 약속을 보여 주었다 재조합 미생물의 대사 공학의 출현이다. 대부분의 프로세스에서와 같이, 유전자 조작 된 미생물에 의해 생산 된 재조합 생 분자의 성공적인 상업화는 시스템 (39)의</sup...

3 - 미생물을 이용한 환원 전체 세포의 생체 내 변화는 상업적 및 치료 중요한 생체 분자 하나의 화학 - 효소 합성을위한 광범위한 방법이되고있다. 7 - 그것은 절연 효소의 사용을 통해 여러 장점, 특히 비용 집약적 인 하류 정제 공정의 제거 및 연장 된 수명 (4)의 증명을 제공한다. 보조 인자가 제품의 형성에 요구되는 경로를 생 촉매를 들어, 전체 - 셀 시스템은 저렴 전자공 공동 5,8,9 기질의 첨가를 통해 원위치 팩터 재생에 제공 할 가능성이있다. 13 - 그러나, 이러한 능력은 희귀하거나 고가 공동 기판 (10)의 화학량 론적 농도를 반응에 필요로 감소된다. 함께 전체 세포의 가난한 재사용으로,이 확장 가능하고 연속의 produ의 설립을 방해ction 시스템. 이러한 보조 인자 - 의존 생물 전환을위한 전체 전지 시스템의 전략적 변형은 상기 한계를 극복해야한다. 특히, 협력 작업 전체 세포 생체 촉매의 조합은 상당히 품은 효소 (14)의 생산성 및 안정성을 향상시키는 것으로 나타났다. 종종 상업적 제품의 대량 생산을 가능하게하는 중요한 요인은 공동 고정화 미생물 생 촉매 (15)에 의해 더 최적화 될 수있다. 우리는 최근 L 크실 로스 생산 (16)에 대한 보조 인자 재생 및 생 촉매의 고정화를 모두 할 수있는 간단하고 재사용 가능한 전체 세포 생 촉매 시스템을 개발했다. 이 연구에서,이 시스템은 개선 된 생물 전환 수율 및 생체 촉매의 재사용을 위해 두 가지 전략을 적용하는 실험 절차를 설명하기위한 예로서 사용되었다. L 크실 로스는 CIA 요원에 속하는생물학적으로 유용한 분자의 SS는 희소 당을 이름. 희귀 설탕은 자연에서 매우 드물게 발생 고유 단당류 또는 당 유도체, 그러나 생리 활성 분자 (17, 18)의 인식 요소로 중요한 역할을한다. 그들은 감미료, 기능성 식품의 잠재적 인 치료제 (19)에 이르기까지 다양한 응용 프로그램이 있습니다. L 크실 로스 여러 α-글루코의 전위 억제제로서 사용될 수 있으며, 또한 간염이나 간경변 17, 20의 지표로서 사용될 수있다. 전체 셀 시스템 L 크실 로스에 자일리톨 고효율 변환 판토 이전에보고되었다 (21, 22)는, 알칼리 게 네스 SP ananatis. 701B 23 바실러스 창백 Y25 24,25 대장균 26. E.에서 대장균은, 그러나, 높은 인해 하나 이상의 초기 자일리톨 농도 전위 억제 효과가 낮은 (&lt;67 mM)을 자일리톨의 농도 (26)를 통해서만 이루어졌다자일리톨-4-탈수소 효소 활성 21,26에서 00 밀리미터. 크실 로스 및 자일리톨 간의 열역학적 평형 강력 자일리톨 25, 27의 형성을 선호하는 것으로 나타났다. 또한, 크실 로스 수율 시츄 팩터 재생 시스템에서의 부재에 제공되어야하는 고가의 보조 인자의 양에 의해 제한된다. 함께, 이러한 요인 L 크실 로스 생합성 지속 시스템에 확장 가능성을 제한한다. 이러한 한계를 극복하고 L 크실 로스 생물 전환 수율을 향상시키기 위해, 보조 인자의 재생 전략은 결합 된 전체 세포 생 촉매 시스템을 확립함으로써 제를 사용 하였다. 구체적으로, L- 아라 비니 -4- 탈수소 Hypocrea의 jecorina 행 (EC 1.1.1.12) (HjLAD) 진균의 L-아라비 이화 경로의 효소, L-크실 로스 (28, 29)에 L-아라 비니의 전환을 촉진하기 위해 선택된 . 많은 생합성 효소와 같은 주요 limitatioHjLAD의 N은 상기 전환을 수행하기 위해 고가의 니코틴 아미드 아데닌 디 뉴클레오티드의 보조 인자 (NAD +, NADH의 산화 된 형태)의 화학량 론적 양을 필요로한다는 것이다. 연쇄상 구균 화농 (SpNox)에서 발견 된 NADH 산화 효소는 높은 보조 인자 - 재생 활동 (30, 31)를 표시하는 것으로 나타났다. SpNox, E.의이 속성을 활용 L 크실 로스의 제조 HjLAD를 발현하는 대장균 세포와 결합 된 E. NAD +의 재생에 SpNox 발현 대장균 세포는도 1a에 도시 된 커플 링 반응에 의해 도시 된 L 크실 로스 생산을 촉진한다. 최적의 조건 150 mM의 L-아라 비니의 초기 농도를 사용에서 최대 L 크실 로스 수익률은 훨씬 더 효율적으로 문헌에보고 된 것보다이 시스템을, 96 %에 달했다. 전 세포 고정화 전략은 상기 결합 biocatalyt의 재사용을 향상시키기 위해 다음의 이용했다IC 시스템. 전체 세포 고정화 일반적으로 사용되는 방법은 고체 매트릭스, 고분자 네트워크 (32)의 가교 / 함정 수사 및 캡슐에 연결 흡착 / 공유를 포함한다. 이러한 방법 중, 세포 고정화에 가장 적합한 방법은 칼슘 알기 네이트 비드에 캡슐화된다. 그들의 가벼운 겔화 특성, 불활성 수성 매트릭스와 높은 다공성 캡슐화 된 생물학적 (33)의 생리 학적 특성과 기능을 보존하는 데 도움이. 따라서, 결합 된 생 촉매 시스템은 E. 모두 포함 HjLAD 또는 SpNox 은닉 대장균 세포는 7 일주기 이후에 첫 번째 사이클의 전환 수율 65 %를 유지 국지적 고정화 생체 촉매 시스템이 잘 작동 안정성을 입증 L 크실 로스 생산의 다수의 사이클을 사용하는 칼슘, 알기 네이트 비드에 (도 2) 고정화 연속 재사용 자유 전지 시스템은 거의 그 촉매 활성을 잃고있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="801">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">LB broth&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L3022-6X1KG</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP906-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Isopropyl &#946;-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I6758-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Tris base</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">B-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">N7004-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">L-Arabinitol</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A3506-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">L-Cysteine</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">168149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Sulfuric acid</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">320501-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Carbazole</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C5132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Ethanol&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP2818-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Sodium alginate</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">W201502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">223506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Excella E24 shaker incubator</td>
			<td style="width:200px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td style="width:200px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Centrifuge 5810R</td>
			<td style="width:200px;">Eppendrof</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Beakers</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Syringe</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Needle</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Pioneer Analytical and Precision Weighing Balance</td>
			<td style="width:200px;">Ohaus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immobilization of multi-biocatalysts in alginate beads for cofactor regeneration and improved reusability

우리는 최근 개선 된 생산 수율 및 지속적인 합성을위한 보조 인자 재생 및 생 촉매 고정화의 능력으로, 간단한 재사용과 결합 된 전체 세포 생 촉매 시스템을 개발했다. 이것과는 E. 설명이 이루어진 상기 시스템의 발전을위한 실험 절차 기능적으로 보완 효소를 발현 대장균 균주. 함께,이 두 효소는 생물 반응의 제품 수율 향상을위한 고가의 보조 인자의 재생을 중재하기 위해 공동으로 작동 가능하게 작동 할 수 있습니다. 또한, 칼슘, 알긴산 비드의 전체 세포의 밀봉하여 결합하는 생 촉매 시스템의 고정 된 형태를 합성하는 방법이보고되어있다. 예를 들어, 우리는 E. 결합하여 L-아라 비니에서 L 크실 로스의 개선을 제시 생합성 효소 L-아라 비니 NADH 탈수소 효소 혹은 산화 효소를 발현하는 대장균 세포. 최적의 조건에서 (150)의 초기 농도를 사용하여밀리미터 L-아라 비니는 최대 L 크실 로스 수율은 문헌에보고 된 것보다 높은 96 %에 도달. 자유 전지 시스템은 거의 완전하게 촉매 활성을 상실하는 동안 결합​​ 전체 세포 생 촉매의 고정 된 형태는 연속적으로 재사용 7 사이클 이후 첫 번째 사이클에서 얻어진 수율은 65 %로 유지하는 우수한 작동 안정성을 보여 주었다. 따라서, 여기에보고 된 방법은 L 크실 로스의 산업 생산뿐만 아니라, 일반적으로 보조 인자의 사용을 요구하는 다른 부가가치 화합물을 향상시킬 수있는 두 가지 전략을 제공한다.

보조 인자의 재생을 가능하게하기 위해, L 크실 로스 합성 E. 함유 결합 전체 세포 생 촉매 시스템 행했다 대장균 HjLAD 및 E. 대장균 SpNox 세포. 다양한 파라미터의 최적화에 따라,이 시스템의 재사용 칼슘 알기 네이트 비드에 (도 2)를 고정함으로써 개선되었다. <stron...

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Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability

예를 들어 L-크실 로스를 생산하여 보조 인자 재생 및 재사용을위한 개선 된 공동 고정화 전체 세포 생체 촉매에 대한 프로토콜이다 선보였다. 보조인 재생 기능적 상보 효소 발현이 대장균 균주를 결합함으로써 달성된다; 전체 세포 생 촉매 고정화 칼슘 알기 네이트 비드에 세포 캡슐화함으로써 달성된다.

공동 인자 재생 및 개선 재사용에 대한 알긴산 구슬의 다중 생체 촉매의 고정화

We have recently developed a simple, reusable and coupled whole-cell biocatalytic system with the capability of cofactor regeneration and biocatalyst ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

17.2K 조회수.  Konkuk University.  예를 들어 L-크실 로스를 생산하여 보조 인자 재생 및 재사용을위한 개선 된 공동 고정화 전체 세포 생체 촉매에 대한 프로토콜이다 선보였다. 보조인 재생 기능적 상보 효소 발현이 대장균 균주를 결합함으로써 달성된다; 전체 세포 생 촉매 고정화 칼슘 알기 네이트 비드에 세포 캡슐화함으로써 달성된다. 

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Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first separated into polar and non-polar fractions by a liquid-liquid phase extraction, and partially purified to facilitate downstream analysis. Both aqueous (polar metabolites) and organic (non-polar metabolites) phases of the initial extraction are processed to survey a broad range of metabolites. Metabolites are separated by different liquid chromatography methods based upon their partition properties. In this method, we present microflow ultra-performance (UP)LC methods, but the protocol is scalable to higher flows and lower pressures. Introduction into the mass spectrometer can be through either general or compound optimized source conditions. Detection of a broad range of ions is carried out in full scan mode in both positive and negative mode over a broad m/z range using high resolution on a recently calibrated instrument. Label-free differential analysis is carried out on bioinformatics platforms. Applications of this approach include metabolic pathway screening, biomarker discovery, and drug development.

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Untargeted metabolomics provides a hypothesis generating snapshot of a metabolic profile. This protocol will demonstrate the extraction and analysis of metabolites from cells, serum, or tissue. A range of metabolites are surveyed using liquid-liquid phase extraction, microflow ultraperformance liquid chromatography/high-resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS) coupled to differential analysis software.

Ultraperformance 액체 크로마토 그래피 고해상도 질량 분석 (UPLC-HRMS)를 사용하여 생물 소스에서 타겟이 불분명 한 대사

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

연구

화학

Improved In-gel Reductive &#946;-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of biological samples. Similar approaches, that would allow in-depth analysis of the glycans carried by glycoproteins resolved by SDS-PAGE, require special considerations in order to maximize recovery and sensitivity when using mass spectrometry (MS) as the detection method. A major hurdle to be overcome in achieving high-quality data is the removal of gel-derived contaminants that interfere with MS analysis. The sample workflow presented here is robust, efficient, and eliminates the need for in-line HPLC clean-up prior to MS. Gel pieces containing target proteins are washed in acetonitrile, water, and ethyl acetate to remove contaminants, including polymeric acrylamide fragments. O-linked glycans are released from target proteins by in-gel reductive &#946;-elimination and recovered through robust, simple clean-up procedures. An advantage of this workflow is that it improves sensitivity for detecting and characterizing sulfated glycans. These procedures produce an efficient separation of sulfated permethylated glycans from non-sulfated (sialylated and neutral) permethylated glycans by a rapid phase-partition prior to MS analysis, and thereby enhance glycomic and sulfoglycomic analyses of glycoproteins resolved by SDS-PAGE.

In order to comprehensively explore the diversity of O-linked glycans, a new procedure for in-gel reductive &#946;-elimination, combined with permethylation and a rapid phase-partition method, is applied to the analysis of O-linked glycans directly released from glycoproteins resolved by SDS-PAGE and amenable to subsequent glycomic analysis by mass spectrometry.

질량 분석에 의해 - 겔 개선 환원 적 β-제거 포괄적 인 O가 연결된과에 대한 설포 글라 이코믹스

Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of ...

Microbubble Fabrication of Concave-porosity PDMS Beads

Microbubble fabrication (by use of a fine emulsion) provides a means of increasing the surface-area-to-volume (SAV) ratio of polymer materials, which is particularly useful for separations applications. Porous polydimethylsiloxane (PDMS) beads can be produced by heat-curing such an emulsion, allowing the interface between the aqueous and aliphatic phases to mold the morphology of the polymer. In the procedures described here, both polymer and crosslinker (triethoxysilane) are sonicated together in a cold-bath sonicator. Following a period of cross-linking, emulsions are added dropwise to a hot surfactant solution, allowing the aqueous phase of the emulsion to separate, and forming porous polymer beads. We demonstrate that this method can be tuned, and the SAV ratio optimized, by adjusting the electrolyte content of the aqueous phase in the emulsion. Beads produced in this way are imaged with scanning electron microscopy, and representative SAV ratios are determined using Brunauer&#8211;Emmett&#8211;Teller (BET) analysis. Considerable variability with the electrolyte identity is observed, but the general trend is consistent: there is a maximum in SAV obtained at a specific concentration, after which porosity decreases markedly.

Procedures used to generate microstructured concave-porosity polydimethylsiloxane beads are presented. Effects of electrolyte concentration and identity within the aqueous phase are particularly emphasized.

오목 다공성 PDMS 비즈의 마이크로 버블 제작

Microbubble fabrication (by use of a fine emulsion) provides a means of increasing the surface-area-to-volume (SAV) ratio of polymer materials, which is ...

Improved Heterojunction Quality in Cu2O-based Solar Cells Through the Optimization of Atmospheric Pressure Spatial Atomic Layer Deposited Zn1-xMgxO

Atmospheric pressure spatial atomic layer deposition (AP-SALD) was used to deposit n-type ZnO and Zn1-xMgxO thin films onto p-type thermally oxidized Cu2O substrates outside vacuum at low temperature. The performance of photovoltaic devices featuring atmospherically fabricated ZnO/Cu2O heterojunction was dependent on the conditions of AP-SALD film deposition, namely, the substrate temperature and deposition time, as well as on the Cu2O substrate exposure to oxidizing agents prior to and during the ZnO deposition. Superficial Cu2O to CuO oxidation was identified as a limiting factor to heterojunction quality due to recombination at the ZnO/Cu2O interface. Optimization of AP-SALD conditions as well as keeping Cu2O away from air and moisture in order to minimize Cu2O surface oxidation led to improved device performance. A three-fold increase in the open-circuit voltage (up to 0.65 V) and a two-fold increase in the short-circuit current density produced solar cells with a record 2.2% power conversion efficiency (PCE). This PCE is the highest reported for a Zn1-xMgxO/Cu2O heterojunction formed outside vacuum, which highlights atmospheric pressure spatial ALD as a promising technique for inexpensive and scalable fabrication of Cu2O-based photovoltaics.

Improved Heterojunction Quality in Cu2O-based Solar Cells Through the Optimization of Atmospheric Pressure Spatial Atomic Layer Deposited Zn1-xMgxO

Here we present a protocol for synthesizing Zn1-xMgxO/Cu2O heterojunctions in open-air at low temperature via atmospheric pressure spatial atomic layer deposition (AP-SALD) of Zn1-xMgxO on cuprous oxide. Such high quality conformal metal oxides can be grown on a variety of substrates including plastics by this cheap and scalable method.

구리에서 개선 된 이종 접합 품질<sub&gt; 2</sub&gt; 입금 대기 압력 공간 원자 층의 최적화를 통해 태양 전지를 O 기반<br /&gt; 아연<sub&gt; 1-X</sub&gt; 마그네슘<sub&gt; X</sub&gt; O

Atmospheric pressure spatial atomic layer deposition (AP-SALD) was used to deposit n-type ZnO and Zn1-xMgxO thin films onto p-type thermally oxidized Cu2O ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

This protocol details the important steps required for the bioconjugation of a cysteine containing protein to a maleimide, including reagent purification, reaction conditions, bioconjugate purification and bioconjugate characterization.

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Surface Functionalization of Metal-Organic Frameworks for Improved Moisture Resistance

Metal-organic frameworks (MOFs) are a class of porous inorganic materials with promising properties in gas storage and separation, catalysis and sensing. However, the main issue limiting their applicability is their poor stability in humid conditions. The common methods to overcome this problem involve the formation of strong metal-linker bonds by using highly charged metals, which is limited to a number of structures, the introduction of alkylic groups to the framework by post-synthetic modification (PSM) or chemical vapour deposition (CVD) to enhance overall hydrophobicity of the framework. These last two usually provoke a drastic reduction of the porosity of the material. These strategies do not permit to exploit the properties of the MOF already available and it is imperative to find new methods to enhance the stability of MOFs in water while keeping their properties intact. Herein, we report a novel method to enhance the water stability of MOF crystals featuring Cu2(O2C)4&#160;paddle-wheel units, such as HKUST (where HKUST stands for Hong Kong University of Science &#38; Technology), with the catechols functionalized with alkyl and fluoro-alkyl chains. By taking advantage of the unsaturated metal sites and the catalytic catecholase-like activity of CuII ions, we are able to create robust hydrophobic coatings through the oxidation and subsequent polymerization of the catechol units on the surface of the crystals under anaerobic and water-free conditions without disrupting the underlying structure of the framework. This approach not only affords the material with improved water stability but also provides control over the function of the protective coating, which enables the development of functional coatings for the adsorption and separations of volatile organic compounds. We are confident that this approach could also be extended to other unstable MOFs featuring open metal sites.

Robust functional catechol coatings were produced in one step by direct reaction of the material known as HKUST with synthetic catechols under anaerobic conditions. The formation of homogeneous coatings surrounding the entire crystal is ascribed to the biomimetic catalytic activity of Cu(II) dimers on the external surface of the crystals.

향상 된 수 분 저항 금속-유기 프레임 워크의 표면 기능화

Metal-organic frameworks (MOFs) are a class of porous inorganic materials with promising properties in gas storage and separation, catalysis and sensing. ...

Bio-inspired Polydopamine Surface Modification of Nanodiamonds and Its Reduction of Silver Nanoparticles

Surface functionalization of nanodiamonds (NDs) is still challenging due to the diversity of functional groups on the ND surfaces. Here, we demonstrate a simple protocol for the multifunctional surface modification of NDs by using mussel-inspired polydopamine (PDA) coating. In addition, the functional layer of PDA on NDs could serve as a reducing agent to synthesize and stabilize metal nanoparticles. Dopamine (DA) can self-polymerize and spontaneously form PDA layers on ND surfaces if the NDs and dopamine are simply mixed together. The thickness of a PDA layer is controlled by varying the concentration of DA. A typical result shows that a thickness of ~5 to ~15 nm of the PDA layer can be reached by adding 50 to 100 &#181;g/mL of DA to 100 nm ND suspensions. Furthermore, the PDA-NDs are used as a substrate to reduce metal ions, such as Ag[(NH3)2]+, to silver nanoparticles (AgNPs). The sizes of the AgNPs rely on the initial concentrations of Ag[(NH3)2]+. Along with an increase in the concentration of Ag[(NH3)2]+, the number of NPs increases, as well as the diameters of the NPs. In summary, this study not only presents a facile method for modifying the surfaces of NDs with PDA, but also demonstrates the enhanced functionality of NDs by anchoring various species of interest (such as AgNPs) for advanced applications.

A facile protocol is presented to functionalize the surfaces of nanodiamonds with polydopamine.

Nanodiamonds 및은 나노 입자의 그것의 감소의 바이오 영감 Polydopamine 표면 수정

Surface functionalization of nanodiamonds (NDs) is still challenging due to the diversity of functional groups on the ND surfaces. Here, we demonstrate a ...

Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

We demonstrate a simple method to prepare poly(pentafluorophenyl acrylate) (poly(PFPA)) grafted silica beads for antibody immobilization and subsequent immunoprecipitation (IP) application. The poly(PFPA) grafted surface is prepared via a simple two-step process. In the first step, 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) is deposited as a linker molecule onto the silica surface. In the second step, poly(PFPA) homopolymer, synthesized via the reversible addition and fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization, is grafted to the linker molecule through the exchange reaction between the pentafluorophenyl (PFP) units on the polymer and the amine groups on APTMS. The deposition of APTMS and poly(PFPA) on the silica particles are confirmed by X-ray photoelectron spectroscopy (XPS), as well as monitored by the particle size change measured via dynamic light scattering (DLS). To improve the surface hydrophilicity of the beads, partial substitution of poly(PFPA) with amine-functionalized poly(ethylene glycol) (amino-PEG) is also performed. The PEG-substituted poly(PFPA) grafted silica beads are then immobilized with antibodies for IP application. For demonstration, an antibody against protein kinase RNA-activated (PKR) is employed, and IP efficiency is determined by Western blotting. The analysis results show that the antibody immobilized beads can indeed be used to enrich PKR while non-specific protein interactions are minimal.

Preparation of Polypentafluorophenyl acrylate Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

A protocol for the preparation of poly(pentafluorophenyl acrylate) (poly(PFPA)) grafted silica beads is presented. The poly(PFPA) functionalized surface is then immobilized with antibodies and used successfully for the protein separation through immunoprecipitation.

단백질 정화에 대 한 Poly(pentafluorophenyl acrylate) 기능성 SiO2 구슬의 준비

We demonstrate a simple method to prepare poly(pentafluorophenyl acrylate) (poly(PFPA)) grafted silica beads for antibody immobilization and subsequent ...

Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. Yet maleimide-based conjugates display limited stability in vivo because the succinimidyl thioether linkage can undergo a retro-Michael reaction. This, of course, can lead to the release of the radioactive payload or its exchange with thiol-bearing biomolecules in circulation. Both of these processes can produce elevated activity concentrations in healthy organs as well as decreased activity concentrations in target tissues, resulting in reduced imaging contrast and lower therapeutic ratios. In 2018, we reported the creation of a modular, stable, and easily accessible phenyloxadiazolyl methyl sulfone reagent &#8212; dubbed &#8216;PODS&#8217; &#8212; as a platform for thiol-based bioconjugations. We have clearly demonstrated that PODS-based site-selective bioconjugations reproducibly and robustly create homogenous, well-defined, highly immunoreactive, and highly stable radioimmunoconjugates. Furthermore, preclinical experiments in murine models of colorectal cancer have shown that these site-selectively labeled radioimmunoconjugates exhibit far superior in vivo performance compared to radiolabeled antibodies synthesized via maleimide-based conjugations. In this protocol, we will describe the four-step synthesis of PODS, the creation of a bifunctional PODS-bearing variant of the ubiquitous chelator DOTA (PODS-DOTA), and the conjugation of PODS-DOTA to the HER2-targeting antibody trastuzumab.

In this protocol, we will describe the synthesis of PODS, a phenyoxadiazolyl methyl sulfone-based reagent for the site-selective attachment of cargos to the thiols of biomolecules, particularly antibodies. In addition, we will describe the synthesis and characterization of a PODS-bearing bifunctional chelator and its conjugation to a model antibody.

합성 및 Bioconjugation의 Thiol 반응 시 약 사이트에 선택적으로의 창조에 대 한 수정 Immunoconjugates

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. ...

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

Positron emission tomography (PET) is an essential molecular imaging technique providing insights into pathways and using specific targeted radioligands for in vivo investigations. Within this protocol, a robust and reliable remote-controlled radiosynthesis of [11C]SNAP-7941, an antagonist to the melanin-concentrating hormone receptor 1, is described. The radiosynthesis starts with cyclotron produced [11C]CO2 that is subsequently further reacted via a gas-phase transition to [11C]CH3OTf. Then, this reactive intermediate is introduced to the precursor solution and forms the respective radiotracer. Chemical as well as the radiochemical purity are determined by means of RP-HPLC, routinely implemented in the radiopharmaceutical quality control process. Additionally, the molar activity is calculated as it is a necessity for the following real-time kinetic investigations. Furthermore, [11C]SNAP-7941 is applied to MDCKII-WT and MDCKII-hMDR1 cells for evaluating the impact of P-glycoprotein (P-gp) expression on cell accumulation. For this reason, the P-gp expressing cell line (MDCKII-hMDR1) is either used without or with blocking prior to experiments by means of the P-gp substrate (&#177;)-verapamil and the results are compared to the ones observed for the wildtype cells. The overall experimental approach demonstrates the importance of a precise time-management that is essential for every preclinical and clinical study using PET tracers radiolabelled with short-lived nuclides, such as carbon-11 (half-life: 20 min).

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

Here, we represent a protocol for the fully automated radiolabelling of [11C]SNAP-7941 and the analysis of the real-time kinetics of this PET-tracer on P-gp expressing and non-expressing cells.

[11C]SNAP-7941의 자동 합성및 실시간 역학 평가의 기술적 측면

Positron emission tomography (PET) is an essential molecular imaging technique providing insights into pathways and using specific targeted radioligands ...

공동 인자 재생 및 개선 재사용에 대한 알긴산 구슬의 다중 생체 촉매의 고정화

요약

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Ultraperformance 액체 크로마토 그래피 고해상도 질량 분석 (UPLC-HRMS)를 사용하여 생물 소스에서 타겟이 불분명 한 대사

질량 분석에 의해 - 겔 개선 환원 적 β-제거 포괄적 인 O가 연결된과에 대한 설포 글라 이코믹스

오목 다공성 PDMS 비즈의 마이크로 버블 제작

구리에서 개선 된 이종 접합 품질

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

향상 된 수 분 저항 금속-유기 프레임 워크의 표면 기능화

Nanodiamonds 및은 나노 입자의 그것의 감소의 바이오 영감 Polydopamine 표면 수정

단백질 정화에 대 한 Poly(pentafluorophenyl acrylate) 기능성 SiO₂ 구슬의 준비

합성 및 Bioconjugation의 Thiol 반응 시 약 사이트에 선택적으로의 창조에 대 한 수정 Immunoconjugates

[11C]SNAP-7941의 자동 합성및 실시간 역학 평가의 기술적 측면