Name: immobilization of multi-biocatalysts in alginate beads for cofactor regeneration and improved reusability
Uploaded: 2016-04-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability at JoVE.com

Denna forskning stöds av Basic Science Research Program genom National Research Foundation of Korea (NRF) som finansieras av ministeriet för utbildning, vetenskap och teknik (NRF-2013R1A1A2012159 och NRF-2013R1A1A2007561), Konkuk universitet och Institutionen för kemiteknik och MCubed program vid University of Michigan.

1. Hela-cell Biokatalysatorer Förberedelse OBS: Den rekombinanta E. coli-celler som hyser pET28a- SpNox 31 eller pET28a- HjLAD 28 är följande kallad E. coli SpNox och E. coli HjLAD, respektive. <ol><li> Ympa en enda koloni av E. coli HjLAD i 3 ml Luria-Bertani (LB) medium med tillsats av kanamycin (50 | ig / ml) och inkubera i en inkubator-skakapparat O / N vid 37 ° C, 250 rpm. <...

Nya tekniska framsteg har gjort det möjligt ett uppsving i kommersialiseringen av rekombinanta proteinläkemedel, vilket resulterar i en gradvis ökning av marknadsvärdet inom bioteknikindustrin. En sådan utveckling är uppkomsten av metabolisk teknik i rekombinanta mikroorganismer, som har visat en mycket lovande i upprättandet skalindustrisystem 38. Som med de flesta processer är framgångsrik kommersialisering av rekombinanta biomolekyler som produceras av genetiskt modifierade mikrober starkt beroend...

Reduktiv helcells-biotransformation med hjälp av mikroorganismer har blivit en utbredd metod för kemo-enzymatisk syntes av kommersiellt och terapeutiskt viktiga biomolekyler 1 - 3. Den presenterar flera fördelar jämfört med användning av isolerade enzymer, särskilt avskaffandet av kostnadsintensiva nedströms reningsprocesser och demonstration av en förlängd livslängd 4-7. För biokatalytiska vägar där det krävs kofaktörer för produktbildning, hela-cellsystem har potential att ge in situ kofaktor förnyelse via tillsats av billiga elektrondone samsubstrat 5,8,9. Emellertid är denna kapacitet minskas för reaktioner som kräver en stökiometrisk koncentration av sällsynta eller dyra samsubstrat 10 - 13. Tillsammans med dålig återanvändning av hela celler, hindrar detta inrättandet av en skalbar och kontinuerlig produInsatser systemet. Strategiska modifieringar av hel-cellsystem för dessa kofaktor beroende biotransformationer krävs för att övervinna ovannämnda begränsningar. Specifikt har kombinationen av hela celler biokatalysatorer som arbetar kooperativt visat sig signifikant öka produktiviteten och stabiliteten av de hyste enzymerna 14. Dessa faktorer, som ofta kritisk för att möjliggöra storskalig produktion av kommersiellt gångbara produkter, kan optimeras ytterligare genom samtidig immobilisering biokatalytiska mikrober 15. Vi har nyligen utvecklat en enkel och återanvändbar hel-cell biokatalytisk system som tillåter både kofaktor förnyelse och biokatalysator immobilisering för L-xylulos produktion 16. I denna studie var detta system som används som ett exempel för att illustrera de experimentella förfarandena för att tillämpa dessa två strategier för förbättrad biotransformation produktionsutbyte och biokatalysator återanvändbarhet. L-xylulos tillhör en class av biologiskt användbara molekyler som heter sällsynta sockerarter. Sällsynta sockerarter är unika monosackarider eller sockerderivat som förekommer mycket sällan i naturen, men spelar viktiga roller som igenkänningselement i bioaktiva molekyler 17,18. De har en mängd olika tillämpningar som sträcker sig från sötningsmedel, funktionella livsmedel för potentiella terapeutiska medel 19. L-xylulos kan användas som en potentiell inhibitor av flera a-glukosidaser, och kan också användas som en indikator på hepatit eller levercirros 17,20. Hög omvandlingseffektivitet av xylitol till L-xylulos i hel-cellsystem har tidigare rapporterats i Pantoea ananatis 21,22, Alcaligenes sp. 701B 23, Bacillus pallidus Y25 24,25 och Escherichia coli 26. I E. coli, men det var endast uppnås med hjälp av låga (&lt;67 mm) xylitolkoncentrationerna 26 på grund av potentiella inhibitoriska effekterna av en initial xylitol koncentration högre än 100 mM om xylitol-4-dehydrogenas aktivitet 21,26. Termodynamisk jämvikt mellan xylulos och xylitol har visat sig starkt gynna bildandet av xylitol 25,27. Dessutom är xylulos avkastning begränsas av mängden av dyra kofaktorer som måste levereras i frånvaro av en in situ kofaktor regenereringssystem. Tillsammans utgör dessa faktorer begränsar risken för skalning i hållbara system för L-xylulos biosyntesen. För att övervinna dessa begränsningar och förbättra L-xylulos biotransformation avkastning, var strategin att kofaktor regenere anställd först genom att upprätta en kopplad helcells-biokatalytisk systemet. Specifikt, L-arabinitol 4-dehydrogenas (EC 1.1.1.12) från svampdynor jecorina (HjLAD), ett enzym i L-arabinos katabolism av svampar, valdes för att katalysera omvandlingen av L-arabinitol till L-xylulos 28,29 . Liksom många biosyntetiska enzymer, en stor limitation HjLAD är att det kräver en stökiometrisk mängd av den dyra nikotinamidadenindinukleotid cofaktor (NAD +, den oxiderade formen av NADH) för att genomföra denna omvandling. NADPH-oxidas hittades i Streptococcus pyogenes (SpNox) har visat att visa hög kofaktor-regenereringsaktivitet 30,31. Med utnyttjande av detta attribut av SpNox, E. coli-celler som uttrycker HjLAD för produktion av L-xylulos kopplades med E. coli-celler som uttrycker SpNox för regenerering av NAD + för att öka L-xylulos produktion avbildas av den kopplade reaktionen som visas i figur 1A. Under optimala förhållanden och med användning av en initial koncentration av 150 mM L-arabinitol, nådde den maximala L-xylulos utbyte 96%, vilket gör detta system mycket mer effektiv än de som rapporteras i litteraturen. Strategin med helcells-immobilisering användes nästa för att ytterligare förbättra återanvändbarheten för den kopplade biocatalytIC-systemet. Vanligen använda metoder för helcells-immobilisering inkluderar adsorption / kovalent länkning till fasta matriser, tvärbindning / infångning och inkapsling i polymera nätverk 32. Bland dessa metoder är den lämpligaste metoden för cell immobilisering inkapsling i kalcium alginatpärlor. Deras milda gelningsegenskaper, inert vattenmatris och hög porositet hjälpa till att bevara de fysiologiska egenskaper och funktioner hos de inkapslade biologiska 33. Därför den kopplade biokatalysatorn system innehållande både E. coli-celler som hyser HjLAD eller SpNox immobiliserades i kalciumalginat pärlor för att möjliggöra flera cykler av L-xylulos (figur 2) .Den immobiliserade biokatalysator-system visade god driftstabilitet, bibehålla 65% av omvandlingsutbytet av den första cykeln efter 7 cykler av successiv återanvändning, medan den fria cellsystemet nästan helt förlorat sin katalytiska aktivitet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="801">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">LB broth&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L3022-6X1KG</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP906-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Isopropyl &#946;-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I6758-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Tris base</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">B-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">N7004-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">L-Arabinitol</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A3506-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">L-Cysteine</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">168149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Sulfuric acid</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">320501-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Carbazole</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C5132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Ethanol&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP2818-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Sodium alginate</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">W201502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">223506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Excella E24 shaker incubator</td>
			<td style="width:200px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td style="width:200px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Centrifuge 5810R</td>
			<td style="width:200px;">Eppendrof</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Beakers</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Syringe</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Needle</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Pioneer Analytical and Precision Weighing Balance</td>
			<td style="width:200px;">Ohaus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immobilization of multi-biocatalysts in alginate beads for cofactor regeneration and improved reusability

Vi har nyligen utvecklat en enkel, återanvändbar och kopplade helcells-biokatalytisk system med förmågan att kofaktor förnyelse och biokatalysator immobilisering för förbättrad produktionsutbyte och ihållande syntes. Beskrivs härmed är den experimentella proceduren för utvecklingen av ett sådant system som består av två E. coli-stammar som uttrycker funktionellt kompletterande enzymer. Tillsammans kan dessa två enzymer fungera kooperativt att mediera regenerering av dyra kofaktörer för att förbättra produktutbyte av den Bioreaktionsteknik. Dessutom är metoden för syntetisering av en immobiliserad form av det kopplade biokatalytisk systemet genom inkapsling av hela celler i kalcium alginatpärlor rapporterats. Som ett exempel presenterar vi den förbättrade biosyntesen av L-xylulos från L-arabinitol genom koppling E. coli-celler som uttrycker enzymerna L-arabinitoldehydrogenas eller NADPH-oxidas. Under optimala förhållanden och med användning av en initial koncentration av 150mM L-arabinitol, nådde den maximala L-xylulos utbyte 96%, vilket är högre än de som rapporterats i litteraturen. Den immobiliserade formen av de kopplade helcells-biokatalysatorer visade god driftstabilitet, bibehålla 65% av avkastningen som erhålls i den första cykeln efter 7 cykler av successiv återanvändning, medan den fria cellsystemet nästan helt förlorat den katalytiska aktiviteten. Därför metoder rapporterade här ger två strategier som kan bidra till att förbättra den industriella produktionen av L-xylulos, liksom andra mervärdes föreningar kräver användning av kofaktorer i allmänhet.

Att möjliggöra kofaktor regenerering, var L-xylulos syntes utförs i en kopplad helcells-biokatalytisk system innehållande E. coli HjLAD och E. coli SpNox celler. Efter optimering av olika parametrar, var återanvändbarhet av detta system förbättras genom att immobilisera det på kalcium alginatpärlor (Figur 2). L-xylulos Produktion med C...

Watch this Scientific Journal Video about Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability at JoVE.com

Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability (Video) | JoVE

Presenteras är protokollet för co-immobilisera hela celler biokatalysatorer för kofaktor förnyelse och förbättrad återanvändbarhet, med hjälp av produktionen av L-xylulos som ett exempel. Kofaktorn regenere uppnås genom att koppla två Escherichia coli-stammar som uttrycker funktionellt kompletterande enzymer; helcell-biokatalysator immobilisering åstadkommes genom cellinkapsling på kalcium alginatpärlor.

Immobilisering av Multi-biokatalysatorer i alginatpärlor för Cofactor Regeneration och förbättrad Återanvändning

We have recently developed a simple, reusable and coupled whole-cell biocatalytic system with the capability of cofactor regeneration and biocatalyst ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability

Improved In-gel Reductive &#946;-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

Improved In-gel Reductive ÃŽÂ²-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry (Video) | JoVE

Förbättrade I-gel Reduktiva β-Eliminering för omfattande O-kopplade och sulfo-glycomics med masspektrometri

Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of ...

Microbubble Fabrication of Concave-porosity PDMS Beads

Microbubble Fabrication of Concave-porosity PDMS Beads (Video) | JoVE

Mikrobubbel Tillverkning av konkav-porositet PDMS Pärlor

Microbubble fabrication (by use of a fine emulsion) provides a means of increasing the surface-area-to-volume (SAV) ratio of polymer materials, which is ...

Improved Heterojunction Quality in Cu2O-based Solar Cells Through the Optimization of Atmospheric Pressure Spatial Atomic Layer Deposited Zn1-xMgxO

Improved Heterojunction Quality in Cu2O-based Solar Cells Through the Optimization of Atmospheric Pressure Spatial Atomic Layer Deposited Zn1-xMgxO (Video) | JoVE

Förbättrad hetero Kvalitet i Cu<sub&gt; 2</sub&gt; O-baserade solceller genom optimering av Atmosfärstryck Spatial Atomic skikt avsatt<br /&gt; Zn<sub&gt; 1-x</sub&gt; Mg<sub&gt; x</sub&gt; O

Atmospheric pressure spatial atomic layer deposition (AP-SALD) was used to deposit n-type ZnO and Zn1-xMgxO thin films onto p-type thermally oxidized Cu2O ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry (Video) | JoVE

Syntesen av protein biokonjugat<em&gt; via</em&gt; Cystein-maleimid Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Surface Functionalization of Metal-Organic Frameworks for Improved Moisture Resistance

Surface Functionalization of Metal-Organic Frameworks for Improved Moisture Resistance (Video) | JoVE

Ytan funktionalisering av belägga med metall-organiska ramar för förbättrad fuktbeständighet

Metal-organic frameworks (MOFs) are a class of porous inorganic materials with promising properties in gas storage and separation, catalysis and sensing. ...

Bio-inspired Polydopamine Surface Modification of Nanodiamonds and Its Reduction of Silver Nanoparticles

Bio-inspired Polydopamine Surface Modification of Nanodiamonds and Its Reduction of Silver Nanoparticles (Video) | JoVE

Bio-inspirerade Polydopamine yta ändring av Nanodiamonds och dess förminskning av Silvernanopartiklar

Surface functionalization of nanodiamonds (NDs) is still challenging due to the diversity of functional groups on the ND surfaces. Here, we demonstrate a ...

Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

Preparation of Polypentafluorophenyl acrylate Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification (Video) | JoVE

Beredning av Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 pärlor för Protein rening

We demonstrate a simple method to prepare poly(pentafluorophenyl acrylate) (poly(PFPA)) grafted silica beads for antibody immobilization and subsequent ...

An Intestine/Liver Microphysiological System for Drug Pharmacokinetic and Toxicological Assessment

An Intestine/Liver Microphysiological System for Drug Pharmacokinetic and Toxicological Assessment (Video) | JoVE

En tarm/lever Microphysiological System för Drug Farmakokinetiska och Toxikologiska Bedömning

The recently introduced microphysiological systems (MPS) cultivating human organoids are expected to perform better than animals in the preclinical tests ...

Trimethylamine Detection in Animal-Derived Medicine by Headspace GC-MS

An Improved Technique for Trimethylamine Detection in Animal-Derived Medicine by Headspace Gas Chromatography-Tandem Quadrupole Mass Spectrometry

An Improved Technique for Trimethylamine Detection in Animal-Derived Medicine by Headspace Gas Chromatography-Tandem Quadrupole Mass Spectrometry (Video) | JoVE 

Animal-derived medicines have distinctive characteristics and significant curative effects, but most of them have an obvious fishy odor, resulting in the ...

Porphyrin-Modified Beads in Flow Cytometry

Porphyrin-Modified Beads for Use as Compensation Controls in Flow Cytometry

Porphyrin-Modified Beads for Use as Compensation Controls in Flow Cytometry (Video) | JoVE 

Porfyrinmodifierade pärlor för användning som kompensationskontroller i flödescytometri

Flow cytometry can rapidly characterize and quantify diverse cell populations based on fluorescence measurements. The cells are first stained with one or ...