Name: promoter capture hi-c: high-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions
Uploaded: 2018-06-28T13:30:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions at JoVE.com

ونحن نشكر ماليشيفا فاليرييا لقراءة نقدية من المخطوطات ومساعدة الخبراء في الشكل 1. تم دعم هذا العمل بمجلس البحوث الطبية، والمملكة المتحدة (MR/L007150/1) والمملكة المتحدة التكنولوجيا الأحيائية ومجلس بحوث العلوم البيولوجية، المملكة المتحدة (BB/J004480/1).

ليس لها علاقة بالكشف عن المؤلف.

تصميم نمطي من المروج التقاط مرحبا-ج
مروج التقاط مرحبا-ج يهدف إلى إثراء المكتبات مرحبا-C للتفاعلات التي تشمل المروجين على وجه التحديد. وتشمل هذه التفاعلات مجموعة فرعية فقط من ربط منتجات موجودة في مكتبة مرحبا-ج.
يمكن بسهولة تعديل التقاط مرحبا-C لإثراء المكتبات مرحبا-C لأي منطقة الجينوم أو المناطق ذات الاهتمام بتغيير نظام التقاط. التقاط مناطق يمكن أن تكون أجزاء الجينوم المستمر44،45،46،48، القدرة التي تم تحديدها في شارتر-ج (35من 'عكس التقاط مرحبا-ج')، أو الدناز مواقع شديدة الحساسية49 . يمكن ضبط حجم نظام التقاط اعتماداً على نطاق تجريبي. على سبيل المثال، درايدن وآخرون. استهداف 519 الطعم الشظايا في ثلاثة الصحارى الجينات المرتبطة ب سرطان الثدي44. نظام التقاط من مارتن وآخرون. أهداف كلا الجزأين الجينوم المستمر ('"القبض على المنطقة"': 211 مناطق الجينوم في المجموع؛ و 2,131 تقييد الشظايا) وتحديد المروجين (المروجين الجين 3,857)45.
مكتبات سوريسيليكت متوفرة في نطاقات مختلفة الحجم: 1 كيلو بايت إلى 499 كيلو بايت (5,190 – 4,806)، 500 كيلو بايت إلى 2.9 ميغابايت (5,190 – 4,816)، و 3 ميغابايت إلى 5.9 ميغابايت (5,190 – 4,831). كما كل التقاط الفردية البيوتين-الجيش الملكي النيبالي هو 120 النيوكليوتيدات طويلة، التقاط هذه الأنظمة استيعاب أقصى قدر 4,158، و 24,166 و 49,166 الفردية التقاط تحقيقات، على التوالي. وهذا يتوافق مع 2,079 و 12,083 و 24,583 تقييد المستهدفة الشظايا، على التوالي (لاحظ أن الأرقام لتقييد الشظايا هي الحدود السفلية على أساس الافتراض بأنه يمكن تصميم اثنين التقاط الفردية المسابير لكل قيد جزء – في الواقع بسبب تكرار تسلسل هذا لن يكون الحال بالنسبة لكل تقييد تجزئة (انظر أيضا الشكل 1 باء، جيم)، أسفر عن عدد أكبر من شظايا تقييد استهدافها لعدد ثابت من المجسات التقاط المتاحة ).
البروتوكول هو موضح هنا يستند على استخدام إنزيم التقييد مع موقع اعتراف بي بي 6 للكشف عن تفاعلات طويلة المدى. استخدام إنزيم التقييد مع موقع اعتراف بي بي 4 للقرار أكبر من التفاعلات الدانية أكثر هو أيضا ممكن40،49.
قيودا من شارتر-ج
واحد الحد المتأصلة لكل كروموسوم تكيف التقاط فحوصات أن القرار يتحدد بإنزيم التقييد المستخدمة لإنشاء مكتبة. التفاعلات التي تحدث بين عناصر الحمض النووي الموجود في جزء القيد نفسه غير مرئية لفحوصات 'ج-نوع'. علاوة على ذلك، في شارتر-ج، في بعض الحالات أكثر من موقع بدء النسخ يمكن أن يكون موجوداً على جزء تقييد المحتوية على مروج نفسه، وإيواء المتحقق في بعض الحالات كلا علامات هيستون النشطة والقمعية، مما يجعل من الصعب تحديد الذي التنظيمية عناصر التوسط في التفاعلات، والتنبؤ بإخراج التفاعلات مروج التنظيمية. استخدام إنزيمات التقييد مع 4 مواقع الاعتراف بي بي يخفف من هذه المسألة ولكن يأتي على حساب إلى حد كبير زيادة تعقد مكتبة مرحبا-ج (مرحبا-ج المكتبات التي تم إنشاؤها مع bp 4 الاعتراف بموقع تقييد الإنزيمات 100 مرة على الأقل أكثر تعقيداً من مرحبا-ج المكتبات التي تم إنشاؤها مع الاعتراف بي بي 6 موقع تقييد الإنزيمات)، والتكاليف المتعلقة بتسلسل الجيل القادم.
قيد آخر أن البروتوكول شارتر-C الحالي يتطلب ملايين خلايا كبداية المواد، النافية لتحليل التفاعلات المروج في أنواع الخلايا النادرة. نسخة معدلة من شارتر-C لتمكين التحقيق جهات المروج في السكان خلية مع 10,000 إلى 100,000 الخلايا (على سبيل المثال الخلايا أثناء النمو الجنيني المبكر أو الخلايا الجذعية المكونة للدم) سيكون ذلك إضافة قيمة إلى الاستيلاء على ج صندوق الأدوات.
وأخيراً، مثل جميع الأساليب التي تعتمد على تثبيت فورمالدهايد، شارتر-ج السجلات فقط التفاعلات 'المجمدة' عند نقطة وقت التثبيت. وهكذا، لدراسة حركية وديناميات التفاعل المروج، أساليب مثل القرار فائقة خلية حية مجهرية مطلوبة جنبا إلى جنب مع جيم شارتر
أساليب تشريح المنظمة كروموسوم المكاني بدقة عالية
ويحظر الشاسعة تعقيد التفاعل الصبغية المكتبات تحديد منتجات التفاعل بين اثنين من شظايا قيود محددة مع دلالة إحصائية موثوق بها. وقد استخدمت التقاط تسلسل للتحايل على هذه المشكلة، إثراء مرحبا-ج33،34،،من4044 أو مكتبات51 50،ج 3 لتفاعلات معينة. والميزة الرئيسية لاستخدام مكتبات مكتبات ما يزيد على 3 ج ج مرحبا لخطوة تخصيب اليورانيوم أن يشمل مرحبا-ج، على عكس ج 3، خطوة تخصيب اليورانيوم لمنتجات ربط حقيقي. نتيجة لذلك، النسبة المئوية لقراءة صحيحة في مكتبات شارتر-C حوالي 10 إضعاف أعلى مما في التقاط-C يقرأ المكتبات50، التي تتضمن حوالي 5 – 8% صالحة بعد تصفية HiCUP. وقد مقارنة سالين et al. مباشرة ج القبض على هيكاب، الذي مثل شارتر ج يستخدم مكتبات C مرحبا لإثراء الالتقاط، خلافا لالتقاط-C الذي يستخدم مكتبات ج 3. واتساقا مع النتائج التي توصلنا إليها، وجدوا أن المكتبات التقاط-C هي تتألف أساسا من الشظايا الواصلة الأمم المتحدة40. وبالإضافة إلى ذلك، قد مكتبات هيكاب تعقيد أعلى من التقاط-C مكتبات40.
البديل من التقاط-ج، دعا جيل التقاط-ج52 (نغ التقاط-ج) يستخدم اليغو واحد كل نهاية جزء التقييد، كما حددت سابقا في شارتر-ج33،34، بدلاً من التداخل المسابر المستخدمة في النص الأصلي بروتوكول التقاط-ج50. هذا يؤدي إلى زيادة النسبة المئوية لصالح ما يلي مقارنة لالتقاط-ج متواضعة، لكن نغ التقاط-ج توظف جولتين متسلسلة من القبض على تخصيب اليورانيوم، ودورات عدد كبير نسبيا من بكر (دورات 20 إلى 24 في المجموع، مقارنة 11 دورات عادة شارتر-c)، الذي النتائج حتما في ارتفاع إعداد تسلسل تكرارات وانخفاض المكتبة تعقد. في تجارب للمحاكمة خلال الاستفادة المثلى من شارتر-ج، وجدنا أن النسبة المئوية لفريدة من نوعها (أي، لا تتكرر) قراءة أزواج كان فقط حوالي 15% عندما كنا 19 بكر دورات (13 دورات ما قبل التقاط + 6 دورات ما بعد التقاط؛ البيانات لا تظهر)، ومع ذلك عادة غلة الأمثل لعدد أقل من دورات بكر، 75 – 90% أزواج قراءة فريدة من نوعها. وهكذا، خفض عدد دورات بكر إلى حد كبير يزيد من كمية البيانات تسلسل الزاخر بالمعلومات.
يجمع أسلوب الأخيرة رقاقة مع مرحبا-ج إلى التركيز على التفاعلات الصبغية وساطة من بروتين محددة من الفائدة (هيتشيب53). الحيوانات الأليفة شيا54، الذي يستند إلى أساس منطقي مماثلة، بالمقارنة مع البيانات هيتشيب تحتوي على عدد أكبر من ما يلي تسلسل الزاخر بالمعلومات، مما يسمح للتفاعل العالي الثقة استدعاء53. أنها سوف تكون مثيرة جداً للاهتمام لمقارنة مباشرة هيتشيب المقابلة ومجموعات البيانات التقاط مرحبا-ج مرة تصبح متوفرة (على سبيل المثال هيتشيب استخدام جسم مضاد ضد Smc1a الوحدة كوسين53 مع التقاط مرحبا جيم لجميع Smc1a ملزمة التقييد الشظايا) جنبا إلى جنب. هو أحد الفرق الأصيل بين هذين النهجين أن التقاط مرحبا-ج لا تعتمد على إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين، وذلك هو قادر على استجواب التفاعلات صبغية بغض النظر عن شغل البروتين. وهذا يمكن مقارنة لمنظمة الجينوم ثلاثية الأبعاد في وجود أو عدم وجود عامل محدد ملزم، كما استخدمت لتحديد PRC1 كمنظم رئيسي للماوس ESC الجينوم المكانية العمارة7.
ج شارتر وجواس
الرابطة على نطاق الجينوم (جوس) وقد كشفت الدراسات أن أكثر من 95% من الأمراض المرتبطة بتسلسل المتغيرات تقع في مناطق غير ترميز الجينوم، في كثير من الأحيان مسافات كبيرة للجينات ترميز البروتين55. غالباً ما تكون المتغيرات جوس وجدت بالقرب من الدناز أنا مواقع شديدة الحساسية، ومن السمات مميزة لتسلسل مع النشاط التنظيمي المحتملة. شارتر-C و C مرحبا التقاط قد استخدمت على نطاق واسع لربط المروجين لمواضع الخطر جوس ضالعة في سرطان الثدي44،48من سرطان القولون والمستقيم وأمراض المناعة الذاتية35،،من4546. دراسة شارتر سي 17 الخلية المكونة للدم البشري المختلفة عشر وجدت أنواع بطانات المرتبطة بأمراض المناعة الذاتية قد أثري في المتحقق في الخلايا اللمفاوية، بينما كان تسلسل المتغيرات المرتبطة بسمات محددة الصفائح الدموية وخلايا الدم الحمراء في الأغلب في الضامة واريثروبلاستس، على التوالي35،56. وهكذا، المروج محددة نوع الأنسجة إينتيراكتوميس كشف عنها شارتر سي قد تساعد على فهم الوظيفة غير الترميز المرتبطة بالمرض تسلسل المتغيرات وتحديد جينات المرض محتملة جديدة للتدخل العلاجي.
خصائص مناطق التفاعل المروج
ربط عدة أسطر من الأدلة إينتيراكتوميس المروج للتحكم في التعبير الجيني. أولاً، أظهرت العديد من الدراسات شارتر-ج أن مناطق الجينوم التفاعل مع المروجين للجينات (عالية) أعرب هي أثري في العلامات المرتبطة بالنشاط محسن، مثل أسيتيليشن H3K27 و p300 ملزم33،34 , 37-وجدنا علاقة متبادلة إيجابية بين مستوى التعبير الجيني والعدد من القدرة على التفاعل، مما يوحي بأن الآثار المضافة تؤدي القدرة على التعبير الجيني زيادة المستويات34،35. ثانيا، تحدث بشكل طبيعي التعبير يتم إثراء الصفات الكمية المكاني (اقتلس) في المتحقق المتصلة بالجينات نفس التعبير الذي يتأثر اقتلس35. ثالثا، بإدماج الرحلة57 وبيانات شارتر-ج، وجد كيرنز et al. أن رحلة مراسل الجينات رسم الخرائط المتحقق في بتوليدا الماوس تظهر مراسل أقوى التعبير الجيني من الجينات مراسل في مواقع التكامل في المناطق غير مروج التفاعل 58، مما يشير إلى أن تمتلك المتحقق النسخي نشاط تنظيمي. وتوحي هذه النتائج معا، أن إينتيراكتوميس المروج التي كشف عنها شارتر-C في الماوس ومختلف أنواع الخلايا البشرية وتشمل الوحدات التنظيمية الرئيسية للتحكم في التعبير الجيني.
تجدر الإشارة إلى أن القدرة على تمثل فقط نسبة ضئيلة (~ 20 ٪) من جميع المتحقق كشف عنها شارتر-ج33،34. يمكن أن يكون المتحقق الأدوار الهيكلية أو طوبولوجي بدلاً من مباشرة المهام التنظيمية النسخي. ومع ذلك، هناك أيضا أدلة أن شارتر-C قد كشف عناصر الحمض النووي مع الوظيفة التنظيمية التي لا تأوي علامات محسن الكلاسيكية. وفي خط خلية اللمفاوية بشرية، وجد المروج BRD7 للتفاعل مع منطقة تخلو من علامات محسن التي اتضح أن تمتلك النشاط محسن في فحوصات الجينات مراسل33. العناصر التنظيمية ذات خصائص مماثلة قد تكون أكثر وفرة من يقدر حاليا. على سبيل المثال، علامات شاشة المستندة إلى كريسبر للحمض النووي العناصر المحددة غير موسومة التنظيمية العناصر التنظيمية (آريس) التحكم في التعبير الجيني ولكنها خالية من محسن59.
وفي حالات أخرى، أظهرت المتحقق إيواء علامات الكروماتين المرتبطة بالقمع النسخي. شارك المتحقق والمروجين المتفاعلة ملزمة ب PRC1 في بتوليدا الماوس في شبكة واسعة النطاق المكاني مكبوتة الجينات تحمل القمعية مناسبة H3K27me37. في الخلايا البشرية ليمفوبلاستويد، وقمع عنصر بعيدة التفاعل مع المروج BCL6 التحوير مراسل الجينات التعبير33، مما يوحي بأنها قد تعمل على قمع النسخ BCL6 في سياقه الأصلي.
المتحقق في إثراء لشغل البروتين عازل الكروماتين كتكف في بتوليدا ونيكس البشرية37 قد تمثل فئة أخرى من المتحقق. جماعياً، توحي هذه النتائج أن المتحقق إيواء مجموعة من الجينات الأنشطة التنظيمية بعد تتسم وظيفيا.

تتراكم الأدلة تشير إلى أن منظمة ثلاثية الأبعاد للجينوم دوراً هاما فنية في مجموعة من العمليات النووية، بما في ذلك الجينات التنشيط1،2،3، القمع4 ،،من56،،من78، ممارسو9،10، إصلاح الحمض النووي11، الحمض النووي النسخ المتماثل12،13، و الشيخوخة الخلوية14. وتوجد معززات البعيدة القرب المكاني من المروجين أنها تنظم15،،من1617، هو أمر ضروري لتحكم تعبير الجينات الزمانية المناسبة. إظهار الحذف محسن أن معززات القاصي ضروريان للجينات المستهدفة النسخ19،18،20،21،22، و 'القسري حلقات الكروماتين' يوضح أن الربط هندسيا بين محسن وعلى مروج المستهدفة في محور سداسي البروم ثنائي الفينيل كاف لحملة التنشيط النسخي23. علاوة على ذلك، يمكن أن يؤدي الجينوم ترتيبات جديدة التي تجلب الجينات تحت سيطرة القدرة على حمل خارج الرحم في تنشيط الجينات غير مناسب ومرض24،،من2526. وتوضح هذه الأمثلة معا، أن التفاعلات المروج-محسن ضرورية للتحكم في الجينات وتتطلب تنظيم محكم لضمان التعبير الجيني المناسب. الإنسان ومورثات الماوس يقدر كل المرفأ القدرة على حوالي 1 مليون. للغالبية العظمى من هذه المنشطات، الجينات المستهدفة غير معروفة، وهي غير مفهومة 'قواعد الاشتباك' بين المروجين ومحسنات. تعيين القدرة على النسخي للجينات المستهدفة وبالتالي يظل تحديا كبيرا في فك رموز تحكم تعبير الجينات الثدييات.
كانت ثورة فهمنا للهندسة المعمارية ثلاثية الأبعاد الجينوم بإدخال ج 327 (التقاط تكيف كروموسوم) وعن المتغيرات28،29،،من3031 . أقوى من هذه التقنيات، مرحبا-ج (إنتاجية عالية كروموسوم تكيف التقاط) يهدف إلى تحديد فرقة كاملة من التفاعلات الكروموسومات داخل سكان خلية. المكتبات ج، عادة ما تولد من ملايين خلايا، ومعقدة للغاية مع منتجات ربط مستقل11 ما يقدر 10 بين شظايا ~ 4 كيلوبايت في المجين البشري32. كنتيجة لذلك، تحديد موثوق بها واستنساخه من التفاعلات بين تقييد الفردية وشظايا (مثل تلك التي تحتوي على مروج أو محسن) من البيانات مرحبا-ج لا مجديا إلا إذا مكتبات C مرحبا يتعرضون لتسلسل عميق جداً، هي ليست حلاً اقتصاديا لمختبرات إعداد مكتبات C مرحبا بشكل روتيني. للالتفاف على هذا القصور، قمنا بتطوير المروج التقاط مرحبا-ج لإثراء عملية ربط المنتجات المحتوية على مروج من مكتبات مرحبا-ج على وجه التحديد. ركزنا على المروجين لسببين. أولاً، أظهرت الاتصالات المروج-محسن أن تكون حاسمة بالنسبة لمستويات التعبير الجيني السليم في العديد من الدراسات (انظر المراجع أعلاه)، وثانيا، كما دعاة ثابتة إلى حد كبير بين أنواع الخلايا، يمكن استخدام نفس نظام التقاط الطعم باستجواب الدوائر التنظيمية عبر عدة أنواع الخلايا والظروف. لدينا نهج يعتمد على التهجين بالحل من مكتبات C مرحبا مع عشرات آلاف 120mers بيوتينيلاتيد الحمض النووي الريبي مكملة مرحبا-ج ربط المنتجات المحتوية على مروج والتقاط اللاحقة على الخرز المغناطيسي المغلفة ستريبتافيدين. هذه النتائج في مكتبات شارتر-ج مع تخفيض كثير التعقيد مكتبة مرحبا-C الأصلية، يركز فقط على تحديد الأجزاء التي هي متصلة للمروجين على ترددات عالية إلى حد كبير بالمقارنة.
وقد استخدمنا شارتر-ج في عدد من الإنسان وأنواع الخلايا الماوس للمساهمة في فهم أفضل لمراقبة التعبير الجيني بالكشف عن مناطق التفاعل المروج البعيدة المدى مع الوظيفة التنظيمية المفترضة، فضلا عن غير عشوائية المروج المروج جهات الاتصال في مساحة ثلاثية الأبعاد من النواة. الدراسات بتعيين مئات آلاف اتصالات المروج-محسن عبر عديدة الخلية أنواع33،34،35،36،،من3738، 39، حددت منظمة الجينوم المكانية "بوليكومب قمعية معقدة" بوساطة في الخلايا الجذعية الجنينية الماوس7، أظهرت الأسلاك على نطاق واسع للمروج إينتيراكتوميس خلال التمايز الخلوي37، 38 , 39، والمرتبطة غير الترميز المرتبطة بالمرض تسلسل المتغيرات للجينات المروجين35.
شارتر ج أسلوباً مثاليا لخريطة الفرقة على نطاق الجينوم تسلسل الحمض النووي التفاعل مع المروجين. النهج ذات الصلة، مثل التقاط مرحبا-ج مناطق الجينوم المستمر (انظر المناقشة) هي الأسلوب المفضل الحصول على ملفات ذات دقة عالية التفاعل لمناطق مختارة الجينوم. شارتر-C و C مرحبا التقاط متشابهة جداً تجريبية لوجهة (والفرق الوحيد هو اختيار نظام التقاط)، حيث أن المبادئ التوجيهية التي نقدمها ومشورة قابلة للتطبيق لكلا النهجين. هنا، فإننا نقدم وصفاً مفصلاً شارتر-C. نحن الخطوط العريضة للأساس المنطقي وتصميم تجربة شارتر-ج، يوفر بروتوكول جيل مكتبة شارتر-C خطوة بخطوة، وتوضح كيف يمكن رصد نوعية شارتر ج المكتبات في مختلف الخطوات في البروتوكول أن تسفر عن بيانات عالية الجودة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1420">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:671px;">16% (vol/vol) paraformaldehyde solution</td>
			<td style="width:140px;">Agar Scientific</td>
			<td style="width:333px;">R1026</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) 1x</td>
			<td style="width:140px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:333px;">41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS) sterile filtered</td>
			<td style="width:140px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:333px;">F9665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Low-retention filter tips&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Starlab</td>
			<td style="width:333px;">S1180-3810, S1180-1810, S1180-8810 and S1182-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10x PBS pH 7.4</td>
			<td style="width:140px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:333px;">70011-036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Molecular biology grade water</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:333px;">W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 M Tris-HCl pH 8.0</td>
			<td style="width:140px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:333px;">15568-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IGEPAL CA-630&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:333px;">I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 M NaCl&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:333px;">24740-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease inhibitor cocktail (EDTA-free)&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Roche Diagnostics</td>
			<td style="width:333px;">11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Restriction buffer 2 (10x NEBuffer 2)</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">B7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA LoBind tube, 1.5 mL&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:333px;">0030 108.051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA LoBind tube, 2 mL</td>
			<td style="width:140px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:333px;">30108078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">20% (wt/vol) SDS&#160;&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Bio-Rad Laboratories</td>
			<td style="width:333px;">161-0418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20% (vol/vol) Triton X-100&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:333px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">HindIII, 100 U/uL</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">R0104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 mM dCTP&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:333px;">18253-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 mM dGTP</td>
			<td style="width:140px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:333px;">18254-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 mM dTTP&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:333px;">18255-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.4 mM Biotin-14-dATP</td>
			<td style="width:140px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:333px;">19524-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mL</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">M0210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">10x T4 DNA ligase reaction buffer&#160;</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">B0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">100x 10mg/ml Bovine Serum Albumin&#160;</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">B9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 DNA ligase, 1 U/&#956;L&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:333px;">15224-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase A&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Roche</td>
			<td style="width:333px;">10109142001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K, recombinant, PCR grade&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Roche</td>
			<td style="width:333px;">3115836001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20 000&#215;g 50 ml centrifuge tube</td>
			<td style="width:140px;">VWR</td>
			<td style="width:333px;">525-0156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 M EDTA pH 8.0&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:333px;">15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol pH 8.0&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:333px;">P4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:333px;">P3803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium acetate pH 5.2&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td>S7899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quant-iT PicoGreen&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:333px;">P7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:140px;">Qiagen</td>
			<td style="width:333px;">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:140px;">Qiagen</td>
			<td style="width:333px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Restriction buffer 2.1 (10x NEBuffer 2.1)</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">B7202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">NheI, 100U/uL</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">R0131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6x16mm vials&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Covaris</td>
			<td style="width:333px;">520045</td>
			<td>For sonication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SPRI beads (Agencourt AMPure XP)&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:333px;">A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:333px;">65001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 mM dATP&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:333px;">18252-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">T4 DNA polymerase 3000 units/mL</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">M0203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">T4 PNK 10000 units/mL</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">M0201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Klenow exo minus 5000 units/mL&#160;</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">M0212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Quick ligation reaction buffer&#160;</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">B6058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">NEB DNA Quick ligase&#160;</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">M2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE adapter 1.0 (5&#39;-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGC 
			AGGAATGCCGAG-3&#39;)</td>
			<td style="width:140px;">Illumina</td>
			<td style="width:333px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE adapter 2.0 (5&#39;-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT 
			CTTCCGATCT-3&#39;)</td>
			<td style="width:140px;">Illumina</td>
			<td style="width:333px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">NEB Phusion PCR kit&#160;</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">M0530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE PCR primer 1.0 (5&#39;-AATGATACGGCGACCACCGA 
			GATCTACACTCTTTCCCTAC 
			ACGACGCTCTTCCGATCT-3&#39;)</td>
			<td style="width:140px;">Illumina</td>
			<td style="width:333px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE PCR primer 2.0 (5&#39;-CAAGCAGAAGACGGCATACGA 
			GATCGGTCTCGGCATTCCT 
			GCTGAACCGCTCTTCCGATCT-3&#39;)&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Illumina</td>
			<td style="width:333px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">PCR strips&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:333px;">410022 and 401425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">SureSelect SSEL TE Reagent ILM PE full adaptor kit&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Agilent Technologies</td>
			<td>931108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">SureSelect custom 3-5.9 Mb library&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:333px;">5190-4831</td>
			<td>custom design mouse or human PCHi-C system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:333px;">65601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E220&#160; high-performance focused ultra-sonicator</td>
			<td style="width:140px;">Corvaris</td>
			<td style="width:333px;">E220</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

promoter capture hi-c: high-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions

منظمة ثلاثية الأبعاد للجينوم مرتبط بوظيفتها. على سبيل المثال، التحكم العناصر التنظيمية مثل القدرة على النسخي الزمانية التعبير عن الجينات المستهدفة من خلال الاتصال الجسدي، غالباً ما سد مسافات كبيرة (في بعض الحالات مئات من كيلوبس) الجينوم وتجاوز الجينات القريبة. الجينوم البشري المرافئ القدرة على 1 مليون المقدرة، الغالبية العظمى منها يكون معروف الأهداف الجينات. ومن ثم تعيين المناطق التنظيمية البعيدة للجينات المستهدفة أمر حاسم لفهم التحكم التعبير الجيني. قمنا بتطوير المروج التقاط مرحبا-ج (شارتر-ج) لتمكين الكشف عن الجينوم على نطاق المنظومة لمناطق التفاعل المروج البعيدة (المتحقق)، لكل من المروجين في تجربة واحدة. في شارتر-ج، هي على وجه التحديد أثري مكتبات C مرحبا معقدة للغاية لتسلسل منظم من خلال اختيار الهجين في الحل مع آلاف الطعم بيوتينيلاتيد الحمض النووي الريبي مكملة لينتهي من كافة الأجزاء المحتوية على مروج تقييد. ويهدف إلى تسلسلات المروج ثم سحب لأسفل وشركائها التفاعل المتكرر مثل القدرة وغيرها من العناصر التنظيمية المحتملة. بعد الفائق إقران نهاية التسلسل، يتم تطبيق اختبار إحصائية لكل جزء متصلة المروج تقييد تحديد الكبير المتحقق على مستوى جزء التقييد. وقد استخدمنا شارتر-C لتوليد أطلس التفاعلات المروج البعيدة المدى في عشرات من الإنسان وأنواع الخلايا الماوس. أسهمت هذه الخرائط إينتيراكتومي المروج إلى فهم أكبر لمراقبة التعبير الجيني الثدييات بتعيين المناطق التنظيمية المفترضة للجينات المستهدفة والكشف عن شبكات التفاعل المروج المكانية التفضيلية-المروج. هذه المعلومات أيضا له أهمية عالية لفهم الأمراض الوراثية البشرية، وتحديد الجينات الأمراض المحتملة، عن طريق ربط غير الترميز المرتبطة بالمرض تسلسل المتغيرات في أو بالقرب من تسلسلات تحكم للجينات المستهدفة.

Watch this Scientific Journal Video about Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions at JoVE.com

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

العناصر التنظيمية الحمض النووي، مثل القدرة على، التحكم في التعبير الجيني عن طريق الاتصال فعلياً بمروجي الجينات المستهدفة، غالباً من خلال التفاعلات صبغية طويلة المدى تمتد مسافات كبيرة الجينوم. مروج التقاط مرحبا-ج (شارتر-ج) يعرف التفاعلات الهامة بين المروجين والمناطق البعيدة، وتمكين تعيين تسلسل التنظيمية المحتملة للجينات المستهدفة.

مروج التقاط مرحبا c: عالية الاستبانة، وعلى نطاق الجينوم التنميط التفاعلات المروج

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

تحديد الجينوم على نطاق توقيت النسخ المتماثل الثدييات بواسطة الحمض النووي قياس المحتوى

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

تحليل ج- كيت يجند المروج باستخدام الكروماتين مناعي

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

رسم الخرائط على نطاق الجينوم من التفاعلات البروتين الحمض النووي مع تشيك-سيق في<em&gt; ساكاروميسز سيريفيسياي</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

رسم خرائط الجينوم المنظومة الكروماتين موجوداً في الخلايا الليمفاوية تي البشرية الأولية التي أتاك-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

تحديد معدلات تسوس نسخة على نطاق الجينوم في الخلايا الليفية البشرية المتكاثرة وهادئة

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

جيل من الكروماتين على نطاق الجينوم تكيف التقاط المكتبات من الأجنة المورفولوجية محكم نظموا في وقت مبكر

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

المراقبة على نطاق الجينوم من أخطاء النسخ في الكائنات الحية حقيقية النواة

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

High-Resolution Comparison of Bacterial Conjugation Frequencies

مقارنة عالية الاستبانة للترددات الاقتران البكتيري

Bacterial conjugation is an important step in the horizontal transfer of antibiotic resistance genes via a conjugative DNA element. In-depth comparisons ...

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

رسم الخرائط الوراثية للاختلافات التسامح الحراري بين أنواع الخميرة Saccharomyces عن طريق تحليل الهيميزيغوستي على نطاق الجينوم المتبادل

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

تحديد جهات اتصال محسن-المروج في الأجسام الجنينية من خلال التقاط تثبيت الكروموسومات الكمية (4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...