Name: detection of low copy number integrated viral dna formed by in vitro hepatitis b infection
Uploaded: 2018-11-07T15:00:00
Duration: 11 min 14 s
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감염 연구 (DZIF), TTU 간염 프로젝트 5.807 및 5.704, 도이치 가운데 (DFG) TRR179 위한 독일 센터에서 자금을 받은이 작품 (TP 15), 및 HIV 및 간염 바이러스학 연구를 위한 오스트레일리아 센터.
우리는 원래 invPCR 메서드를 개발 하 고 우리에 게 그것을 보여주는 그의 부분에 대 한 교수 윌리엄 메이슨에 게 빚을입니다. 우리는 박사가 Ni와 플로리안 A. Lempp 시 약 (셀 라인 및 HBV inoculum)에 감사 하 고 싶습니다. 우리는 기술 지원에 대 한 Anja Rippert, 프란체스카 Schlund, 사라 Engelhardt, 및 박사 카트린 Schöneweis을 인정합니다. 우리는, 교정에 대 한 미리 암 Kleinig 하 고 교수 니콜라스 Shackel 및 지속적인 지원에 대 한 랄 프 Bartenschlager 감사입니다.

1. 세포 감염 및 DNA 추출
<ol><li>교양된 Huh7-NTCP 셀8,9 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM)에 하 10 %v / v 태아 둔감 한 혈 청, 페니실린/스, 그리고 2 m L-글루타민 m x 1와 보완을 유지 합니다. 참고: 이것은 이전 알려졌다 세부40에.</li>
	<li>시드 2 x 105 셀/mL Huh7 NTCP 셀 DMEM 1 mL와 함께 12-잘 접시로.</li>
	<li>세포 치료 (예를 들어, HBV 억제제)를 테스트 하는 경우 적용할 표면에 뜨는 문화에 4 h 시드 (1 일 HBV 감염이 이전) 후. 음수는 컨트롤에 대 한 적용 200 nM Myrcludex B (는 강력한 HBV 항목 억제제41).</li>
	<li>1000 VGE/셀 문화 미디어 (DMEM 보충 10 %v / v 태아 둔감 한 혈 청, 페니실린/스, 2 m L-글루타민, m 및 2.5 %v / v x 1의 500 µ L에서 세포를 감염 하는 inoculum HepAD3843 에서 헤 파 린-열 순화42 상쾌한 사용 DMSO) [인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1에 녹아] 4 %w / v 폴 리 에틸렌 글리콜 8000에 포함 된.</li>
	<li>(5% CO2 와 90% 습도 설정) 37 ° C 배양 기에서 세포 문화.</li>
	<li>16-24 h 감염 된 후에 살 균 1 x PBS의 1 mL로 두 번 셀을 씻어.</li>
	<li>문화 미디어 수확까지 HBV 감염을 따르는 2 일 마다 교체 합니다.</li>
	<li>감염 된 후 3 일에서 5 µ M 테 노와 10 µ M 세포 치료 Lamivudine invPCR에 의해 amplifiable는 HBV 일차 중간체의 생산 제한.</li>
	<li>감염 된 5 일 후, 트립 신-EDTA의 200 µ L 셀 trypsinize과 DMEM (보충 10 %v / v 태아 둔감 한 혈 청, 페니실린/스, 그리고 2 m L-글루타민 m x 1), 또한 포함 하는 5 µ M 테 노와 10 µ M의 2 ml resuspend Lamivudine입니다.</li>
	<li>(어떤 보고 되었습니다 HBV cccDNA44 와 amplifiable는 다른 HBV DNA 중간체의 손실을 유도 하 여 invPCR) 유사 분열의 한 라운드를 유도 하기 위해 6 잘 플레이트 세포 정지를 전송 합니다.</li>
	<li>7 일 감염 된 후, 트립 신-EDTA의 400 µ L에 확장된 셀 trypsinize 고 DMEM 1 mL에 혼합물을 resuspend. 1.5 mL 튜브에 정지를 배치 하 고 5 분 동안 500 x g에서 원심 분리 하 여 세포를 작은 포부에 의해는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
	<li>(선택 사항) 그들은 DNA 추출에 대 한 준비가 될 때까지-20 ° C에서 셀 펠 릿을 저장 합니다.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 DNA 추출 키트를 사용 하 여 셀 펠 릿에서 DNA를 추출 합니다. 광학 densitometry를 사용 하 여 최종 DNA 농도 견적 한다. 참고: 100 μ 차입 볼륨에서 DNA 수율은 일반적으로 250 ~ 400 ng/μ.</li>
</ol>2입니다. DNA의 반전
<ol><li>총 DNA의 aliquot ~1.5–2.5 μ g 200 μ PCR 튜브에 1 단계에서 추출 합니다. 금지 효소 소화 반응 버퍼 x 1을 포함 하는 40 μ 반응 볼륨을 마스터-믹스의 적절 한 금액을 추가 (예., CutSmart 버퍼)와 10 U Nco난-HF.</li>
	<li>반응을 철저 하 게 혼합 하 고 작은 튜브 원심 분리기에 아래로 회전. 제한 효소 반응이 최적의 소화 효율에 대 한 1 시간에 대 한 37 ° C에서 PCR 기계에 품 어.</li>
	<li>20 분 동안 80 ° C에서 배양 하 여 제한 효소 비활성화.</li>
	<li>1.5 mL 튜브에 대 한 전체 제한 효소 반응 전송. T4 DNA 리가 버퍼와 500 U의 T4 DNA 리가 x 1의 400 μ를 추가 하 고 그것을 철저 하 게 혼합. 큰 반응 볼륨 소화 DNA 파편의 내부 분자 (분자 간) 반대 결 찰을 권장합니다.</li>
	<li>결 찰 반응 완전 결 찰 되도록 2 시간 실 온에서 품 어.</li>
	<li>20 분 동안 70 ° C에서 T4 DNA 리가 비활성화</li>
	<li>T4 리가의 완전 한 비활성화 되도록 10 %w / v 나트륨 라우릴 황산 염의 10 μ를 추가 합니다.</li>
	<li>펄스 vortexing에 의해 튜브를 혼합 하 고 짧게 반응 혼합 아래로 회전. 90 µ g/mL의 최종 농도를 100 m m와 dextran (35-45 kDa)의 최종 농도에 NaCl을 추가 합니다. 펄스 vortexing에 의해 튜브를 혼합 하 고 짧게 반응 혼합 아래로 회전.</li>
	<li>반전에 의해 100% 에탄올과 혼합의 900 μ를 추가 합니다. 하룻밤-20 ° C에서 DNA를 침전.</li>
	<li>펠 렛 15 분 14000 x g에서 원심 분리 하 여 침전 된 DNA P200 피 펫과 포부는 상쾌한을 제거 합니다. 14000 x g 15 분 동안에 70 %v / v 에탄올과 원심 분리의 500 μ와 펠 릿을 세척.</li>
	<li>P200 피 펫과 포부에 의해 에탄올을 제거 합니다. 20 분 동안 실 온에서 DNA 펠 릿 건조</li>
	<li>분해 소화 반응 버퍼 x 1, 5 U BsiHKAI의 그리고 5 U Sph-HF. 품 40 μ 반응 볼륨을 제한 효소 마스터 믹스의 H2o. 추가 20 μ의 20 μ에 펠 릿에서 제한 효소 반응 한 열-블록 37 ° C ( SphHF에 대 한 최적의 온도) 1 시간에서.</li>
	<li>짧게 반응 혼합 아래로 회전 합니다. 65 ° C ( BsiHKAI에 대 한 최적의 온도) 1 h에서 열 블록에 제한 효소 반응을 품 어.</li>
	<li>짧게 반응 혼합 아래로 회전 합니다.</li>
	<li>다음 단계까지-20 ° C에서 거꾸로 DNA를 저장 합니다.</li>
</ol>3. 중첩 된 PCR
<ol><li>DNA 저하 솔루션을 사용 하 여 재사용 가능한 실리콘 매트 봉인에서 잠재적인 amplicons를 제거 하 고 매트 DNA 무료 물으로 깨끗이 씻어 PCR 혼합물을 준비 하는 동안 실 온에서 건조.</li>
	<li>외부 앞으로 포함 하는 1 x PCR 믹스의 1 mL를 준비 (5'-TTC GCT TCA CCT CTG CAC G-3')와 역 (5'-AAA GGA CGT CCC GCG CAG-3') 0.5 µ M의 농도에서 뇌관.</li>
	<li>웰 스 a 1과 E1 PCR 96 잘 접시에 170 μ 1 x PCR 믹스를 추가 합니다.</li>
	<li>웰 스 B1 H1 120 μ 1 x PCR 믹스를 추가 합니다.</li>
	<li>단계 2에서에서 a 1과 E1 웰 스 거꾸로 dna 10 μ를 추가 (2 다른 거꾸로 샘플 같은 PCR 접시에 분석 될 수 있다). 믹스에 각각 약 10 배를 부드럽게 pipetting으로 각 잘 반응 사용 P1000 100 μ로 설정 하 여.</li>
	<li>순차적으로 희석 샘플에서 각 단계에서 60 μ를 전송 하 여 1: 3의 비율로 a 1 D1 우물. 부드럽게 10 번 사용 하 여 100 μ로 설정 P1000 pipetting으로 각 단계에서 우물을 믹스. 거품을 형성 하지 마십시오. 잘 H1 아래로 diluting 잘 E1 단계 3.6를 반복 합니다.</li>
	<li>사용 하 여 다중 채널 피 펫 웰 스 A2-H2, H3 a 3에 우물 A1-H1 등 96 잘 접시의 우물 A12 H12 도달까지 반응 혼합물의 aliquot 10 μ. 단계의 3.1, 단단히 눌러 건조 실리콘 매트 PCR 플레이트 커버.</li>
	<li>PCR 기계에 접시를 놓고 다음 프로그램 실행: 95 ° C에서 10 분 15의 35 주기 95 ° C, 15에서 s s 54 ° C 및 72 ° C에서 3 분에서 72 ° C에서 7 분 그런 다음 실 온에서 접시를 개최.</li>
	<li>분 젠 버너와 고온에 96 핀 복제기의 핀 열 하 고 실 온에서 적어도 5 분 동안 쿨.</li>
	<li>10 μ 1 x PCR 혼합 (젤 로드 준비 버퍼 포함)와 내 면 앞으로의 두 번째 PCR 접시의 우물을 채워 (5'-CGC ATG 개 그 ACC ACC GTG A-3')와 역 (5'-CAC AGC CTA GCA GCC ATG G-3')에서 0.5 µ M.</li>
	<li>조심 스럽게 라운드 PCR 96 잘 접시의 PCR 접시에서 실리콘 매트를 제거 하 고 우물 사이의 교차 오염을 방지.</li>
	<li>냉각된 복제기를 사용 하 여 새로 aliquoted 96 잘 접시에 1 라운드 PCR에서 96 잘 접시의 PCR 제품을 전송. 초기 변성 단계 95 ° C에서 10 분에서 2 분으로 변경 제외한 3.8, 단계 에서처럼 동일한 조건을 사용 하 여 중첩 된 PCR을 실시 합니다.</li>
</ol>4. PCR 제품 고립과 젤 추출
<ol><li>1.3 %w / v agarose 젤 96-잘 사용 하는 젤 전기 이동 법으로 PCR 제품을 분석. 100 mL agarose 젤에 대 한 10-15 분에 대 한 200 V에서 실행 합니다.</li>
	<li>일회용 마시는 빨 대를 사용 하 여 agarose 젤에서 DNA 밴드 삭제하시오 각 PCR 제품에 대 한 빨 대 놓고 agarose 젤 1.5 mL 튜브에 연결 하 고가 위로 빨 대 크기를 손질 합니다. 참고: 단일 PCR 제품 해결 될 수 있는 그 희석 에서만에서 밴드 분리 충분 하다.</li>
	<li>(선택 사항) -20 ° C 이상 추출에서 튜브를 저장 합니다.</li>
	<li>밀 짚 조각의 끝에 당기고 하 여 각 관으로 agarose 플러그를 꺼냅니다. 각 튜브를 젤 추출 버퍼의 300 μ와 젤 추출 유리 구슬 슬러리의 5 μ를 추가 합니다.</li>
	<li>(를 제외 하 고 세척 단계에 대 한 반-볼륨을 사용 하 여) 젤 추출 키트에 대 한 제조업체의 지침에 따라 PCR 제품을 추출 하 고 물 30 μ와 구슬에서 DNA elute.</li>
	<li>생어 순화 된 DNA 제출 두 번째 라운드에서 사용 하는 앞으로 뇌관 (공급 업체의 지침)에 따라 시퀀싱 중첩 PCR.</li>
</ol>5. 시퀀스 분석
<ol><li>뉴클레오티드 폭발 분석 (를 사용 하 여 전체 뉴클레오티드 컬렉션을 정렬 하는 기본 설정)를 수행 하 여 바이러스 세포 DNA 연결을 확인 합니다. 참고: 대표적인 결과 그림 3 아래에 자세히 나와 있습니다.<ol>
<li>시퀀스의 부분 정렬, 관찰 하는 경우에 잘라 5' HBV DNA 시퀀스 다시 폭발 분석을 실행 하기 전에.</li>
	</ol>
</li>
	<li>지정 된 시퀀스 나타냅니다 다음과 같이 진정한 통합 접점 확인 하 엄격한 선택 기준 적용:<ol>
<li>포함 된 시퀀스가 포함 > 20 세포 게놈을 확신 매핑 위한 셀룰러 시퀀스의 혈압.</li>
		<li>10 가정된 바이러스-세포 통합 교차점, 그들은 가능성이 대표 체 외에서 결 찰 이벤트의 혈압 보다 진정한 통합 연결 내에서 사용 하는 모든 효소의 금지 사이트를 포함 하는 모든 시퀀스를 무시 했다.</li>
		<li>이들은 연속 반응 동안 교차 오염에 의해 생성 된 가능성이 유물으로 시퀀싱 chromatographs에 가정된 통합 접합의 양쪽에 명백한 비슷하지 피크 형광 수준으로 어떤 시퀀스를 무시 하거나 모 세관 착 색 인쇄기입니다.</li>
		<li>그 정확한 HBV와 바이러스 세포에 세포 시퀀스 고유한 통합 이벤트를 정의 합니다. 참고: 고유한 통합 이벤트의 반복 (부정적인 제어 반응, 대표적인 결과에 설명 추가 사용 하 여 시험 될 수 있는 PCR 동안 그 통합 또는 교차 오염을 포함 된 셀의 클론 확장에서 발생할 수 있습니다. 아래 참조). 특정 세포 시퀀스에 반복된 통합 비 동종 최종 가입 경로 사용된15각 통합 이벤트에 대 한 다른 HBV 터미널 사이트를 표시 하려면 예상 된다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>통합 주파수 정규화 총 DNA 입력 양을 반전 반응으로 다음 그 희석에서 바이러스-셀 연결의 수에 의해 거꾸로 DNA 템플렛의 희석 비율을 곱하여 계산 합니다. 일반적으로, 통합 주파수 1시 10분의 순서는4 셀.</li>
</ol>

수호는 공동 신청자 및 HBV/HDV 항목 억제제로 Myrcludex B를 보호 하는 특허의 공동 발명가. 고작 관심 없음 충돌 선언합니다.

프로토콜을 수행 하기 전에이 invPCR 분석 결과 매우 중요 한 기술, DNA 서식 파일의 단일 복사본을 증폭 할 수는 중요 하다. 따라서, PCR 제품에서 오염을 제한 최대 중요성 이다. PCR 제품 오염 제한 하는 일반적인 전략은 다음과 같다. (i)는 방법의 다른 단계에 대 한 물리적으로 별도 영역을 설정 합니다. 각 지역에서 별도 실험실 코트, 하 고 장갑이이 영역 사이 이동할 때 변경 해야 합니다. 오염 될 가능성이 적어도 대부분의 순서로 아래이 지역 나열 했습니다 우리: PCR 제품 추출 및 시퀀싱 반응 설정 영역 (게시물-PCR); PCR 서식 파일 추가 및 타오르는 핀 전송 영역 (우리는 사용한 PCR 후드 좋은 결과 함께 오염을 UV 램프); DNA 추출 및 반전 영역 (pre-PCR); 그리고 "템플릿 무료 DNA" 지역 준비 재고 및 PCR 솔루션만 사용. (ii) 수 교차 오염을의 잠재적인 드라이버로 실험실에서 공기 흐름의 인식. 특히, 발생 하는 것입니다 염증이 핀 전송 단계 PCR 반응의 교차 오염을 가장 높습니다 통합 주파수의 부정확 한 정량화를 리드. 이러한 크로스-전류 제한 하 PCR 후드를 사용할 수 있습니다. PCR에 부정적인 제어 우물 (예를 들어, Myrcludex B 처리 샘플 또는 템플릿 컨트롤 없음) 또한 교차 오염에 대 한 테스트를 사용할 수 있습니다. (iii) 펫에 잠재적인 PCR 오염 물질을 제한 하 고 정기적으로 DNA 저하 솔루션으로 그들을 닦 여 표면 작업.
여기에 지정 된 프로토콜은 HepAD38 셀 선42에서 생성 된 알려진된 감염 HBV 복제의 통합 감지 하 배열 된다. 사용 inoculum 다른 HBV DNA 시퀀스 (예: 환자 혈 청에서)의 경우, 다음 HBV 게놈 해야 될 처음 시퀀싱 PCR 뇌관 및 반전 디자인의 호환성을 확인 하. 이전에 게시 연구19, 우리 HBV DNA 통합 접합의 예상된 사이트 측면 보존된 HBV DNA 시퀀스를 결속 하는 프라이 머의 3 세트를 이용 했다. 다른 뇌관 시퀀스 및 프로토콜 결정 HBV44,45,,4647,48 의 게놈 시퀀스를 설명 하 고 성공적으로 작동 수 있습니다.
또한, 다른 HBV 감염 셀 (예를 들어, 기본 인간의 hepatocytes, 차별화 된 HepaRG, HepG2-NTCP)을 사용할 수 있습니다; 그러나, 우리는 Huh7 NTCP 세포 DNA 접합은 증폭 하는 증폭된13이 바이러스 중간 DNA에 비해 바이러스 세포의 수를 고려할 때 최고의 신호 대 잡음 비율, 제공을 발견 했다. 특히, 기본 인간의 hepatocytes 등 차별화 된 HepaRG 말기 분화 세포 유사 분열, 세포 내에 남아 있는 amplifiable HBV DNA 일차 중간체의 높은 수준의 결과 효율적으로 받을 하지 할. 우리는 증폭된 시퀀스의 ~ 90% 나타내고 HBV DNA 재배열 (통합 이벤트 하지) 말기 차별화 된 셀에서 은 셀 라인13에서 70-50%에 비해 발견 했다. 이들 제품은 일반적으로 HBV DNA 게놈을 포함 하는 표면 및 핵심 오픈 프레임, 읽기에 큰 삭제 또는 이전 Sph사이트에 사이트를 추가 Nco와 HBV 유사 종 나타낼 수 있습니다. HBV 종을 (를 포함 하 여 도식 다이어그램) 증폭 설명에 자세히 이전13.
이 방법에는 몇 가지 단점이 있다. 힘들고 여러 날의 특성상이 프로토콜, invPCR 샘플의 많은 수의 높은 처리량 분석에 적합 하지 않습니다. 또한, 그것 제한 희석 적정 의존, 우리의 방법은 정확 하지 않습니다 매우 정량화;에 비록, 그것은 쉽게 통합 주파수에 로그 수준 변화를 측정 한다.
또한, 우리의 반전 프로토콜은만 HBV 통합의 대부분이 지역49내 발생으로 HBV 게놈의 DR2 DR1 지역 간에 발생 하는 통합 검색에 적합 하 고. HBV 환자의 조직의 NGS 분석을 큰 소수를 보이고 있다 (최대 ~ 50%)도이 지역49외부 발생할 수 있습니다. 새로운 invPCR 디자인은 이론적으로 이러한 다른 통합 사이트를 검색할 수 있지만 그들이 하지 (우리의 지식)에 왔다 아직 실시. Relatedly, 반전 반응에 대 한 바이러스 세포 접합 시퀀스에서 하류 필요한 필요한 제한 효소 사이트 인 invPCR를 검색 하지 않습니다 HBV 게놈의 DR2 DR1 지역 내에서 발생 하는 모든 통합 (즉, 우리 가 추정 되었다 모든 통합의 ~ 10%는 철에 시뮬레이션13를 사용 하 여 감지). 그러나, 다른 치료의 작은 숫자와 샘플의 집중된 배치에 적용 하면, invPCR 단일 기지-쌍 해상도에서 통합된 HBV DNA를 탐지 하기 위한 유일한 실용적인 방법 중 하나입니다.
우리는 따라서 휴대 (녹아웃 또는 특정 세포 유전자의 overexpression 또는 다양 한 약물의 응용 프로그램을 통해), 및 환경 ( (HBV inoculum의 돌연변이)를 통해 바이러스를 찾는 데 중요 한 역할을 제공 하는이 방법의 응용 프로그램을 구상 예를 들어, 산화 스트레스에 노출) HBV DNA의 통합을 유도 하는 요인. 이 메서드 및 새로 개발된 된 HBV 감염 시스템, 우리가 이러한 요인의 전례 없는 제어를 사용 하는 그들은 잘 격리 하 고 더 나은 특징이 될 수 있도록. 우리는 또한이 HBV DNA 통합을 포함 하 여 어떤 정도 바이러스 성 항 원 (예를 들어, HBx 또는 HBsAg50)이이 식을 컨트롤 통합된 양식에서 표현 된다 세포 결과의 핵심 이해로 이어질 것입니다 기대 그리고 여부 HBV 통합 훨씬 더 프로 종양 스테이트 세포 표현 형을 변경. 이러한 미래 연구의 결과 만성 B 형 간염을 치료 하는 데 사용 하는 치료 전략에 및 바이러스 자체에 대 한 기본적인 이해에 지대한 영향을 해야 합니다.

HBV는 이중 가닥 DNA 바이러스 평생 만성 감염을 일으킬 수 있는 간 경 변 증 및 간세포 암 (HCC)1,2,3. 여러 분자 메커니즘 HBV 지 속성4 (epigenetic 바이러스 transcriptional 서식 파일의예를 들어, 높은 안정성), 면역 감시의 회피, 간에서 hepatocytes의 낮은 회전율 및 그것의 관련을 운전 하는 동안 위험 HCC 개시5,6 (예, 만성 염증 및 세포의 활성화 경로 스트레스), HBV DNA 통합 호스트 세포 게놈 (모두 이러한 현상을 보고 메커니즘)으로 제대로 공부 하고있다 . 주요 이유는 적합 한 생체 외에서 감염 시스템의 HBV에 대 한 통합 이벤트의 믿을 수 있는 탐지를 허용 하는 부족 이다. 여기, 우리 생체 외에서 생성 한 기본 분자 메커니즘 및 그 결과 명료 하 게 하는 데 사용할 수 있는 HBV DNA 통합의 최근 개발 된 프로토콜을 설명 합니다.
HBV 복제 및 HBV DNA 통합의 형성은 이전 평가 되었습니다 세부 사항7. 간단히, HBV hepatocytes 감염8,9에 대 한 주요 세포 수용 체로 나트륨 Taurocholate Co-transporting 펩 티 드 (NTCP)를 사용 하 여 입력 합니다. HBV 편안 원형 DNA (rcDNA)를 포함 하는 HBV nucleocapsids 게놈이 들어간다 핵는 rcDNA episomal covalently 닫힌된 원형 DNA (cccDNA)로 변환 됩니다. 핵 cccDNA 바이러스 성 mRNAs를 미리 게놈 RNA (pgRNA)10transcriptional 템플릿 역할을 합니다. HBV 중 합 효소 및 pgRNA 다음 새로 형성 된 nucleocapsids (HBV 핵심 단백질 이합체 구성)으로 패키징 됩니다. HBV pgRNA rcDNA 게놈 또는 더블-좌초 선형 DNA (dslDNA) 게놈11,12nucleocapsid 내 역 문자입니다. 이러한 성숙 nucleocapsids HBV DNA 게놈을 포함 하는 마지막으로 덮여 고 virions로.
DslDNA 분자를 포함 하는 포함 된 입자에 의해 hepatocytes의 감염 호스트 세포 게놈13, HBV DNA7,,1415복제 무능 형태의 선도에 바이러스 성 통합 될 수 있습니다. HBV DNA 통합 염색체 이중 가닥 DNA 틈15의 사이트에서 발생합니다. 증거를 축적 각 통합 이벤트 호스트 세포 게놈16,17내 본질적으로 임의의 위치에서 발생 하는 것을 건의 한다. 또한, HBV DNA 통합 다소 발생 거의 104 셀13,18,,1920당 1의 속도로. HBV DNA의 통합에 관한 중요 한 질문 특히 정확한 분자 통로, 바이러스에 대 한 의존도 호스트 요소, 통합된 형태, 그리고 그들의 가능한 기여에서 표현 하는 바이러스 성 항 원에 대 한 답이, 있다 바이러스 성 지 속성7 우리는 이러한 일부의이 질문에 빛을 발산 하는 생체 외에서 모델을 설정 했습니다.
HBV 감염 생체 외에서 (통합 속도 셀 당와 각 고유한 통합의 복사본 수에 관하여 둘 다) HBV DNA 통합 이벤트의 희귀 한 모델 확인 검색에 도전 하는 그들. 세포 유사 분열으로 나누어 셀 효율적인 감염을 지원 하지 않는 우리의 생체 외에서 시스템에 제한 됩니다. 따라서, 달리 환자의 간 조직 hepatocytes의 상당한 클론 확장18,19,를 발생 하는 위치에20, 각 통합의 몇 가지 (1 ~ 2) 복사본은 셀의 지정된 풀에 매우 감염 체 외에 . 우리는 또한 통합 초기 감염 hepatocytes의 (그리고 아니라 지속적으로 만성 감염 hepatocytes에)13중에 주로 발생을 발견. 따라서, HBV DNA 통합 간단 하 게 더 긴 기간에 대 한 세포를 배양 하 여 증가 될 수 없습니다.
일반적으로, 이전 남부를 포함 하 여 통합된 HBV DNA를 검출 하는 데 사용 하는 방법 오 교 잡21,22,23,,2425, Alu-PCR26,27 점 , 카세트 중재 결 찰 PCR28, 그리고 전체 게놈 시퀀싱29,30,31,,3233, 검출 감도 없어 통합의 단일 사본입니다. 우리와 다른 연구원은 사용 역 중첩 오리, 마 못, 그리고 인간의 감염된 간13,,1418,19, hepadnaviral DNA 통합 감지 하 PCR (invPCR) 34,,3536. 다른 허위-긍정적인 신호 생성 변경 정량화37에 대 한 능력을 제한할 수 있는 invPCR 기술 수정 절차를 도입 했습니다. 분석 결과이 프로토콜에서 설명 된 대로 수행, invPCR 특정 하 고 과민 한 분석 결과를 식별 하 고 수량화 (절대 복사 번호)에서 여러 HBV DNA 통합을 나타냅니다. HBV-세포 DNA 접합 바이러스의 bioinformatical 연구를 수 있도록 단일 자료 쌍 해상도 시퀀스와 통합13의 사이트에 호스트 DNA 시퀀스.
스냅-냉동 간 조직, 파라핀 끼워 넣어진 간 섹션, 매우 작은 조직 샘플에 의해 분리 등의 넓은 범위에서 추출한 DNA의 HBV에 감염 된 조직에 invPCR에서38 결과 앞서 설명한는 우리 레이저-서19. 이 프로토콜의 invPCR 분석 결과 생체 외에서 감염 후, 통합 (통합 당 1-2 부)의 낮은 복사 번호 생성 됩니다 셀 문화 파생 조직에서 추출한 DNA를 사용 하 여 업데이트 된 버전을 설명 합니다. 세포 게놈 및 접합은 통합된13,16, 바이러스 시퀀스 내에서 그들의 배급에 관하여 환자의 조직에서 발견 그들을 닮는 HBV DNA 형성 통합에 체 외에서 제안 하는 감염 된 간 내에 유사한 통로

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s PBS</td>
			<td>PAA</td>
			<td>H15-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>41965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-151</td>
			<td>Heat-inactivate before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin, 10000U/ml; Streptomycin 10mg/ml, 100&#215;</td>
			<td>PAA</td>
			<td>P11-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine, 200mM</td>
			<td>PAA</td>
			<td>M11-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, 0.5 mg/ml; EDTA, 0.22mg/ml, 1&#215;</td>
			<td>PAA</td>
			<td>L11-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG, MW 8000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89510</td>
			<td>Stock at 40% w/v in 1xPBS, autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO for spectroscopy</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tenofovir disoproxil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CDS021622</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lamivudine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L1295</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Tissue kit</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740952.250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrolphotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcoI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3193L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>433209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran (35 -45 kDa)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1662-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32205-1L-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsiHKAI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0570L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SphI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3182L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplitaq Gold Taq kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331816</td>
			<td>Use for first nest PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon sealing Mats for 96-Well PCR Plates</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>2239442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAZap PCR DNA Degradation Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plates</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS6509 SIGMA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-pin replicator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>250520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq Flexi PCR kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M8295</td>
			<td>Use for second nest PCR, use green buffer for easy loading of agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biozym LE Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAEX II Gel extraction kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>20051</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of low copy number integrated viral dna formed by in vitro hepatitis b infection

B 형 간염 바이러스 (HBV)는 일반적인 혈액을 매개로 병원 체 간 암 및 간 경 변 증 만성 감염에서 결과 일으키는 원인이 되는. 바이러스는 일반적으로 episomal DNA 중간; 통해 복제 그러나, HBV DNA 파편의 호스트 게놈으로 통합 관찰 되었습니다, 비록이 양식을 바이러스 성 복제에 필요 하지 않습니다. 정확한 목적, 타이밍, 그리고 따라 장치를 마더보드에 HBV DNA에 의해 통합 발생은 아직, 하지만 최근 데이터 표시 그것은 아주 초기 감염 후 발생 하는 것. 여기, 생체 외에서 생성 및 통합 HBV DNA의 검출 자세히 설명 합니다. 우리의 프로토콜 특히 바이러스 세포 DNA 통합의 단일 복사본을 증폭 하며 절대 정량화 및 단일 자료 쌍 접합 시퀀스의 해상도 이 기술은 다양 한 HBV 돌연변이, 그리고 다양 한 약물 노출와 함께 다양 한 HBV 감염 세포 유형 (기본 인간의 hepatocytes 포함)에 적용 되었습니다. 우리는이 기술이 되는이 임상으로 관련 된 현상의 근본적인 분자 메커니즘을 결정 하는 주요 분석 결과 예견 한다.

InvPCR 기술은의 도식 대표는 그림 1에 표시 됩니다. PCR 제품 절연 전후는 예제 agarose 젤 전기 이동 법 성공적인 invPCR의 그림 2 에 표시 됩니다. 그림 3 의 HBV DNA 일차 중간 단계 (i) 바이러스 세포 DNA 접점의 확대 및 (ii) 증폭의 경우에서 5.1에서에서 폭발 분석 출력을 보여 줍니다.
긍정적인 결과 예상: Huh7 NTCP 셀이 HBV 주식 덤플링을 정화 (그림 1) 위에서 설명한 대로 감염 긍정적인 컨트롤로 사용할 수 있습니다. 이 경우, 단일 PCR 제품 각 샘플 (희석, 그림 2당 10 ~4 셀 등가물에 해당)의 두 번째 또는 세 번째 1:3 희석에 의해 달성 되어야. 이 희석에서 제품의 약 50% 나머지 절반 HBV DNA 중간체 (그림 3)의 증폭을 나타내는 진정한 바이러스-세포 DNA 접합, 대표할 것 이다.
이전 연구13, 우리 반복된 바이러스-세포 접합, 제안 우대 HBV DNA 통합의 아무 세포 게놈 사이트의 몇 가지 사례를 발견 했다. 우리는 또한 그 바이러스 세포 접합의 >80% 사이 발생 뉴클레오티드 1732 및 1832 (뉴클레오티드의 번호 찍기 HBV 유전자 형 D, 은행 가입 #U95551.1)에 따르면 후자 나타냅니다 HBV dslDNA 폼의 오른쪽 종점을 찾을. 진정한 바이러스-세포 접합부 실험 체 외에 있는 우리의 방법을 통해의 시퀀스 은행 (승인 번호 MH057851 MH058006)에 공개적으로 사용할 수 있습니다.
부정적인 결과 예상: Huh7 NTCP 세포를 감염 되지 않은 또는 주사 Huh7 NTCP Myrcludex B로 미리 치료 하는 세포 부정적인 컨트롤 역할을 할 수. 이 세포에서 추출한 DNA의 InvPCR 분석 PCR 제품을 생산 한다. 긍정적인 샘플으로 같은 PCR에 이러한 부정적인 제어 샘플 실행 중첩 PCR 과정의 교차 오염 테스트 수 있습니다. 교차 오염에 대 한 가장 엄격한 테스트 스 A-D 부정적인 제어 샘플 및 96 잘 접시에 스 E-H 긍정적인 샘플의 실행 이다. 이 경우에, 긍정적인 샘플의 가장 집중된 희석 부정적인 샘플의 적어도 집중된 희석에 직접 인접 한 행에서 실행 됩니다. 증폭 제품 부정적인 제어 샘플에서 관찰 된다, 하는 경우 교차 오염을 이벤트를 최소화 하기 위해 토론에 제안 대책 연구소.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58202/58202fig1.jpg"> 그림 1: HBV DNA 통합 검색 invPCR 프로세스의 도식 그림. HBV 감염, Huh7-NTCP 세포의 단지 소수 민족 포함 HBV dslDNA (레드) 호스트 세포 게놈 (레드) 통합, 후 위쪽 섹션에 그려져 있습니다. 총 DNA는 세포 (1 단계)에서 추출, (2 단계) 반전, 그리고 중첩된 PCR (3 단계)에 의해 증폭. 제한 효소 사이트의 상대 위치는 표시 (Nco어 BsiHKAI) 삭제 바이러스-세포 DNA 접합에서. 그림은 이전 게시13에서 적응. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58202/58202fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58202/58202fig2.jpg"> 그림 2: Agarose 젤 전기 이동 법 및 성공적인 invPCR의 후속 젤 추출. "M" DNA 마커 사다리를 나타냅니다. 12의 각 행은 PCR에 단일 희석에 기술 복제를 나타냅니다. PCR 플레이트/agarose 젤 당 두 거꾸로 DNA 샘플을 실행할 수 있습니다. 각 희석에 대 한 PCR 제품 ~ 1에 밖으로 적정 한다: 3 비율. 단일 밴드 쉽게 격리 될 수 있는 두 가지 이상 집중된 희석에서 제품의 추출은 일반적으로 충분 하 고, HBV DNA 통합 속도 끝점 적정에 의해 결정 됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58202/58202fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58202/58202fig3.jpg"> 그림 3: invPCR 제품 시퀀스의 폭발 분석. 시퀀스의 긴 책자는 생어 시퀀싱의 소스에서에서 생성 된 DNA 순서 일반적으로 모호 하지 않습니다. HBV와 세포 게놈을 강한 정렬 생어에서 생성 된 FASTA 시퀀스 파일의 서로 다른 영역에서 관찰 진정한 바이러스-세포 DNA 접합 제안 상단 패널에 시퀀싱. 하단 패널에 순서 재배열된 HBV DNA 게놈 증폭에 의해 생성 된 제품을 제안 하는 HBV 게놈의 조각에만 정렬 합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58202/58202fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

우리 여기는 생체 외에서 세대의 HBV DNA는 B 형 간염 바이러스 감염 시스템을 통해 설명 하 고 역을 사용 하 여 (1-2 부) 통합의 매우 민감한 탐지 중첩 PCR.

낮은 복사의 번호 통합된 바이러스 성 DNA 생체 외에서 B 형 간염 감염에 의해 형성 된

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...

이 방법은 HPV DNA 통합에 영향을 미치는 세포 또는 바이러스성 요인을 찾는 것과 같은 B형 간염 바이러스학의 주요 질문에 대답하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 기술에는 여러 가지 장점이 있습니다. 비교적 저렴하고 수행하기 쉽고 결과 분석은 간단하며 단일 복사본까지 매우 민감합니다.이 방법은 HBV 통합에 대한 통찰력을 제공하기 위해 사용될 수 있지만, HIV, HTLV-1 또는 HPV와 같은 숙주 세포 게놈에 통합되는 다른 바이러스에도 사용될 수 있습니다. 세포를 감염시키기 위하여는, D-mem의 1 밀리리터와 더불어 12 개의 우물 접시에 있는 밀리리터 당 200, 000 세포를 종자. 다음 날, HEP-AD 38으로부터 헤파린 컬럼을 세포당 1, 000 VGE에서 감염시키기 위해 접종한 것으로, 배양 배지의 500 마이크로리터를 사용한다.그런 다음 세포를 섭씨 37도에서 배양합니다. 그런 다음, 다음 날에, 멸균 1 회 PBS의 1 밀리리터로 세포를 두 번 씻는다. 그런 다음, 수확 될 때까지, 매 2 일마다 배양 매체를 교체합니다.3일째 감염 후, 5 마이크로몰라 테노포비르 디소프록실과 10 마이크로몰러 라미부딘으로 세포를 치료하여 역PCR에 의해 증폭되는 HBV 복제 중급제의 생산을 제한한다. 5일째, 감염 후, 트립신 EDTA의 200 마이크로리터로 일부 세포를 트립시화하고 5 마이크로몰라 테노포비르 디소프록실과 10 마이크로몰러 라미부딘을 포함하는 D-mem의 2 밀리리터에서 다시 중단합니다. 이어서, 세포 현탁액을 6개의 웰 플레이트로 이송하여 1라운드의 미토시스를 유도한다.7일째 감염 후, 트립신 EDTA의 400 마이크로리터에서 확장된 세포를 시험하고 D-mem의 1밀리터에서 혼합물을 중단한다. 이어서, 서스펜션을 1.5 밀리리터 튜브로 이송한다. 5 분 동안 500 회 G에서 원심 분리에 의해 세포를 펠렛.그리고 포부로 수당 나딘을 제거하십시오. 제조업체의 지시에 따라 DNA 추출 키트를 사용하여 세포 펠릿에서 DNA를 추출합니다. DNA 반전의 경우 총 DNA 추출물의 1.5~2.5마이크로그램을 200 마이크로리터 PCR 튜브에 할당합니다.다음으로, 적절한 양의 제한 효소 마스터 믹스를 추가하여 40 마이크로리터의 반응 부피를 초래하고, 1회 소화 반응 버퍼및 10단위 NCO-1HF를 함유한다. 최적의 소화 효율을 위해 PCR 기계에서 섭씨 37도에서 1시간 동안 제한 효소 반응을 배양합니다. 그런 다음, 20 분 동안 섭씨 80도를 배양하여 제한 효소를 비활성화합니다.전체 제한 효소 반응을 1.5 밀리리터 튜브로 전달합니다. 이어서, T4 DNA 리개세 완충제 의 1회 T4 DNA 리구아제 완충제의 400 마이크로리터와 500단위의 T4 DNA 리개세를 추가하고 철저히 섞는다. 대반응량은 소화된 DNA 단편의 분자 내 결찰을 장려합니다.완전한 결찰을 보장하기 위해 실온에서 2시간 동안 결찰 반응을 배양합니다. 2 시간 후, 20 분 동안 섭씨 70도에서 T4 DNA 리그아제 비활성화. 그런 다음, T4 리구가스의 완전한 비활성화를 보장하기 위해 10 나트륨 도데딜 황산염의 10 마이크로 리터를 추가합니다.염화나트륨을 100 밀리몰러의 최종 농도에 추가하고, Dextran은 밀리리터당 90 마이크로그램의 최종 농도를 유지합니다. 펄스 소용돌이에 의해 혼합하고 반응 믹스를 잠시 회전시합니다. 다음으로, 100 에탄올의 900 마이크로 리터를 추가하고 반전으로 섞습니다.하룻밤 사이에 마이너스 섭씨 20도에서 DNA를 침전시합니다. 그리고 15 분 동안 14000 배 G에서 원심 분리에 의해 침전 된 DNA를 펠릿. 그 후, 포부로 수-당 나-식사를 제거합니다.70 에탄올의 500 마이크로 리터로 펠릿을 씻으십시오. 그리고 15 분 동안 14000 배 G에서 원심 분리. 그런 다음, 에탄올을 흡인으로 제거하고 실온에서 DNA 펠릿을 20분 동안 공기 건조시한다.20 마이크로리터의 물에 펠릿을 녹이고 효소 마스터 믹스 20마이크로리터를 추가하여 40마이크로리터 반응 부피, 1회 소화 반응 버퍼, 5단위 BSIHK-1, SPH-1HF 5대를 함유하고 있다. 둥지는, 1 시간 동안 섭씨 37도에서 열 블록에서 제한 효소 반응을 배양한다. 반응 혼합물을 잠시 스핀 다운하고, 1 시간 동안 65섭씨에서 열 블록에서 제한 효소 반응을 배양합니다.이 절차에서는 DNA 분해 용액을 사용하여 재사용 가능한 실리콘 매트 씰에서 잠재적 인 앰플리턴을 제거하십시오. DNA가 없는 물로 매트를 철저히 헹구고 실온에서 공기를 건조시다. 다음으로, 0.5 마이크로몰러의 농도로 외부 전방 및 역 프라이머를 포함하는 1회 PCR 믹스의 1밀리터를 준비한다.1회 PCR이 A-1과 E-1에 혼합되면 96개의 잘 PCR 플레이트에 170마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음, 1회 PCR 믹스의 120마이크로리터를 우물 B-1 및 H-1에 추가합니다. 그 후, A-1과 E-1을 우물에 반전된 DNA의 10 마이크로리터를 추가합니다.100 마이크로리터로 설정된 P-1000을 사용하여 각각 약 10회 부드럽게 파이펫팅하여 각 우물에서 반응을 혼합합니다. 각 단계에서 60 마이크로리터를 전송하여 1:3의 비율로 우물 A-1에서 D-1로 샘플을 연속적으로 희석시. 100 마이크로리터로 설정된 P-1000을 사용하여 약 10회 부드럽게 파이프를 사용하여 각 단계에서 우물을 섞습니다.거품을 형성하지 마십시오, 잘 E-1에 대한 절차를 반복, 잘 H-1로 희석. 그 후, 반응 혼합물의 10 마이크로리터를 웰스 A-1, H-1, 우물 A-2, H2, A-3, H-3 및 So-on에 사용하여 96 웰 플레이트의 우물 A-12, H-12에 도달할 때까지 반응 혼합물의 10 마이크로리터를 할당한다. PCR 플레이트를 마른 실리콘 매트로 덮고 단단히 누릅니다.그런 다음 플레이트를 PCR 기계에 넣고 플레이트를 실온으로 옮기기 전에 표시된 프로그램을 실행합니다. 그 후, 96 핀 복제기의 핀을 분젠 버너로 적색 으로 가열한 다음 실온에서 최소 5분 동안 식힙니다. 두 번째 PCR 플레이트의 웰을 10 마이크로리터의 10 마이크로리터PCR 믹스로 채우고 젤 로드 준비 버퍼를 포함하고, 내부 전방 및 0.5 마이크로몰러로 역전한다.1라운드 PCR에서 96웰 플레이트의 PCR 플레이트에서 실리콘 매트를 조심스럽게 제거하고 우물 간 교차 오염을 피하십시오. 냉각 된 복제기를 사용하여 1 라운드 PCR에서 새로 할당 된 96 웰 플레이트로 96 웰 플레이트의 PCR 제품을 전송하십시오. 표시된 대로 조건을 사용하여 중첩된 PCR을 수행합니다.PCR 제품을 분리하려면 1.3 아가로즈 젤로 96웰 플레이트를 사용하여 젤 전기전구로 분석합니다. 100 밀리리터 아가로즈 젤의 경우 200볼트에서 10~15분 간 드시면 됩니다. 그 후, 일회용 마시는 빨대를 사용하여 아가로즈 젤에서 DNA 밴드를 소비합니다.각 PCR 제품에 대해, 1.5 밀리리터 튜브에 빨대와 아가로즈 젤 플러그를 놓고 가위로 짚크기를 다듬습니다. 그 후, 아가로즈 플러그를 각 튜브에 꺼내밀 조각의 끝을 압박합니다. 그런 다음 젤 추출 버퍼 300 마이크로리터와 각 튜브에 젤 추출 유리 구슬 5 마이크로리터를 추가합니다.젤 추출 키트에 대한 제조업체의 지침에 따라 PCR 제품을 추출하고 30 마이크로 리터의 물로 구슬에서 DNA를 희석시하십시오. Sanger 시퀀싱을 위해 정제된 DNA를 제출하고, 2라운드 중첩 PCR에 사용되는 전방 프라이머를 제출한다. PCR 제품 격리 전후의 성공적인 역 PCR의 아가로즈 젤 전기전도가 여기에 나와 있다.M은 DNA 마커 후자를 나타내며, 12의 각 행은 PCR 플레이트의 단일 희석에서 기술적 복제를 나타낸다. 이 경우 단일 PCR 제품은 각 샘플의 두 번째 또는 세 번째 1:3 희석에 의해 달성되어야 합니다. 이러한 희석에서, 제품의 대략 50%는 진정한 바이러스 세포 DNA 접합을 나타낼 것입니다.나머지 절반은 HBV DNA 중급물의 증폭을 나타내지만. 이 기술은 연구원이 고도로 통제된 체외 감염 시스템에 있는 HPV DNA 통합을 탐구하는 것을 허용했습니다. 생물학 분석과 같은 추가 방법은 추가 질문에 대답하는 데 사용할 수 있습니다.예를 들어, HPV DNA 통합이 세포 게놈의 특정 영역에서 발생하는 경우. 감염 B형 간염 바이러스와 함께 일하는 것은 바이오 안전 캐비닛 및 사전 예방 접종과 같은 위험하고 적절한 감염 통제가 항상 이러한 절차를 수행하는 동안 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Nucleocapsids에서 바이러스성 DNA의 준비

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

연구

면역학 및 감염병학

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

설립<em&gt; 체외</em&gt; 시스템의 세포 내 행동을 연구하는<em&gt; 칸디다 글라 브라</em&gt; 인간 THP-1 식세포에

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

진정한 검출 마우스 B 리니지 세포를 IgE 항체가 발현

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

의 탐지를위한 동결 건조 루프 - 매개 등온 증폭 시약의 개발<em&gt; Coxiella burnetii의</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

효소 결합 렉틴 분석에 의해 인플루엔자 뉴 라미니다 아제 억제 항체가를 측정

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

나노 PCR에 의한 동물 표본의 호흡기 병원체의 높은 처리량 검출

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

B 형 간염 바이러스 리포터 시스템 개발은 복제주기의 초기 단계를 모니터링하기

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

표면에 인간의 노로 바이러스의 검출을위한 면봉 표본 추출 방법

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

"Liver-on-a-Chip" Cultures of Primary Hepatocytes and Kupffer Cells for Hepatitis B Virus Infection

기본 Hepatocytes 및 B 형 간염 바이러스 감염에 대 한 Kupffer 세포의 "간-온-어-칩" 문화

Despite the exceptional infectivity of the hepatitis B virus (HBV) in vivo, where only three viral genomes can result in a chronicity of experimentally ...