غير المنشطات الببتيد MHC المجمعات لا تنشيط الخلايا التائية ولكن يمكن أن تعزز استجابات الخلية T لpetide ناهض MHC. يصف هذا البروتوكول نظام تجريبي للتحقيق في ناهض مشترك أثناء تنشيط الخلايا T CD8 الإنسان. نحن نعبر عن جزيئات MHC كمجمعات واحدة بالسلاسل مع سلسلة ثقيلة مرتبطة بتكهية ، بيتا - 2 ميكروغلوبولين ، والببتيد.
وهذا يسمح بإدخال الطفرات في جزيئات MHC تقديم الببتيدات المحددة سلفا. يستخدم هذا البروتوكول استنساخ CTN الإنسان، وهو محدد لنوبة من فيروس التهاب الكبد B. فهم آلية ناهض المشترك خلال استجابات الخلايا التى ضد التهاب الكبد يمكن أن يسهم في تطوير مناعي ضد هذه العدوى الفيروسية.
ويمكن استخدام الأساليب المعروضة في البحوث وغيرها من الجوانب الأساسية لتفعيل الخلية T في أنظمة الخلايا T الإنسان مع خصوصية معروفة MHC الببتيد. يستخدم هذا البروتوكول واحد سلسلة الإنسان MHC فئة I الجزيئات ، التي تتكون من تسلسل إشارة ، الببتيد من الفائدة ، linker ، الإنسان بيتا 2 - microglobulin linker ، وسلسلة ثقيلة MHC. يستخدم الببتيد E1A3 من التهاب الكبد B كما الببتيد ناهض.
يستخدم الهفوة من فيروس نقص المناعة البشرية كما الببتيد غير المنشط. يتم التعبير عن جزيئات MHC البشرية ذات السلسلة الواحدة في خط خلية الهامستر الذي يحتوي على مكبوت التتراسيكلين. يتم التعبير عن MHC أحادي السلسلة الناهضة باستخدام التتراسيكلين-inducible plasmid، مما يؤدي إلى مستويات التعبير منخفضة جدا في غياب التتراسيكلين، وارتفاع مستويات التعبير في وجود تتراسيكلين.
خلايا CHO التي تعبر عن مستويات منخفضة من الببتيد المهاتي MHC مصابة بببتيد غير منبه غير مُبَرَّغ عنه بشكل مكوّن MHC. استخدام هذا النظام التجريبي يسمح بمقارنة استجابات الخلية T إلى الببتيد المهدّب MHC في وجود أو عدم وجود الببتيد غير المنشط MHC. لبدء هذا الإجراء، زراعة خلايا CHO في قارورة T-75، كما هو موضح في بروتوكول النص.
في اليوم السابق لتجربة تنشيط الخلية T، قم بغسل الخلايا في القارورة باستخدام PBS. إضافة حل يحتوي على 05٪ التربسين و 2٪ EDTA في برنامج تلفزيوني، واحتضان لمدة خمس إلى عشر دقائق في درجة حرارة الغرفة. باستخدام مجهر خفيف، لاحظ الخلايا للتأكد من أنها قد فصل.
ثم أضف F12 كاملة إلى القارورة لوقف التربسينية. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب 15 ملليلتر. جهاز طرد مركزي في 400G لمدة خمس دقائق، وإزالة المابير عن طريق الأنابيب إما أو decanting.
إعادة تعليق بيليه الخلية في خمسة ملليلتر من F12 كاملة. استخدم مقياس الهيموسيت لعد الخلايا، وضبط تركيز الخلايا إلى 200000 خلية لكل ملليلتر في CF12. إضافة 50 إلى 60 نانوغرام لكل ملليلتر من التتراسيكلين إلى عينات ناهض فقط للحث على كميات عالية من فئة pMHC ناهض الأول كتحكم إيجابي.
بعد ذلك، اخلطي خلايا CHO إما عن طريق التنبيب أو الخفقان. إضافة 100 ميكرولترات من تعليق الخلية إلى كل بئر من لوحة U-أسفل 96-well. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
في اليوم السابق للتجربة، خلايا CTLS بالطرد المركزي في 400 مرة G و أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. استخدم مقياس الدم لحساب الخلايا، ثم أعد تعليقها بكثافة مليون خلية لكل ملليلتر في وسائط الخلايا التائية البشرية الكاملة بدون السيتوكينات أو PHA. احتضان CTLs بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
وفي اليوم التالي، كانت الخلايا التائية تعمل بالطرد المركزي بمعدل 400 مرة في G، وبأربعون درجات مئوية لمدة خمس دقائق. تجاهل عظمى، وإعادة تعليق الخلايا في 2 ملليلتر من وسائل الإعلام الكاملة خالية من المصل. استخدام مقياس الدم لحساب الخلايا التائية، وضبط كثافتها إلى مليون خلية حية لكل ملليلتر في كامل وسائل الإعلام خلية T الإنسان.
إضافة المضادة المضادة للدمية CD107a المضادة في تخفيف واحد إلى 100، وBrefeldin A في تخفيف واحد إلى 1000. بعد ذلك، استرداد لوحة 96-well التي تحتوي على خلايا CHO. باستخدام ماصة باستور الزجاج، التعرق وسائل الإعلام من خلايا CHO.
إضافة 200 ميكرولترات من تعليق الخلية T إلى كل بئر. شارك في زراعة الخلايا التائية مع خلايا CHO في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاث إلى أربع ساعات. وفي نهاية الثقافة المشتركة، تعمل أجهزة الطرد المركزي على 96 بئراً في 400 مرة من G وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق.
إزالة افرنح عن طريق التعرق أو الخفقان. ثم إضافة 2.5 ميكرولتررس من الأجسام المضادة CD3 و 2.5 ميكرولترات من الأجسام المضادة CD8 في 50 ميكرولترات من 5٪ BSA في برنامج تلفزيوني لكل بئر، لسطح الخلية مستضد تلطيخ، ومزيج عن طريق الأنابيب. احتضان العينات في الظلام، وعلى الجليد، لمدة 30 دقيقة.
بعد هذا، إضافة 150 ميكرولترات من عازلة غسل إلى كل بئر لغسل العينات. أجهزة الطرد المركزي العينات في 400 مرة G و4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق. إزالة افرنح عن طريق التعرق أو الخفقان.
تعيين مجموعة التثبيت / Permeabilization ، وإضافة 100 ميكرولترات من حل التثبيت / permeabilization لكل بئر ، وماصة لخلط. احتضان على الجليد لمدة 20 دقيقة. ثم، الطرد المركزي في 400 مرة G في أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق.
تجاهل supernatant وإضافة 200 ميكرولترات من 1X بيرم / غسل العازلة إلى كل بئر. كرر هذه العملية من الطرد المركزي من خلال إضافة المخزن المؤقت بيرم/ الغسيل مرة واحدة. بعد ذلك، إعادة تعليق الخلايا في 50 ميكرولترات من بيرم / غسل العازلة التي تحتوي على مضاد للفيروسات غاما بتركيز 3 ميكروغرام لكل ملليلتر.
احتضان على الجليد في الظلام لمدة 30 دقيقة. المقبل، إضافة 150 ميكرولترات من 1X بيرم / غسل العازلة. جهاز طرد مركزي عند 400 جي، أربع درجات مئوية، لمدة خمس دقائق.
إزالة عظمى وإضافة 200 ميكرولترات من 1X بيرم / غسل العازلة. الطرد المركزي لوحة مرة أخرى في 400 مرة G، أربع درجات مئوية، لمدة خمس دقائق، وإزالة افرنح عن طريق الطامح أو الخفقان. إعادة تعليق العينة في 200 ميكرولترات من العازلة غسل والمضي قدما مع تحليل السيتومترية.
قبل يوم واحد من التجربة، اخلطي خلايا CHO إما عن طريق الدوامة أو الخفقان. أضف التالي ملليلتر واحد من تعليق الخلية إلى كل بئر من لوحة 12-well. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
في يوم التجربة، استخدم مكشطة الخلايا لفصل خلايا CHO من أسفل كل بئر. نقل ملليلتر واحد من وسائل الإعلام التي تحتوي على الخلايا من كل بئر إلى أنابيب FACS. جهاز طرد مركزي في 400 مرة G و4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق.
إعادة تعليق في 100 ميكرولترات من الأجسام المضادة HLA المخففة في عازلة الغسيل. احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة. ثم إضافة ملليلتر واحد من مخزن الغسيل إلى كل عينة CHO.
أجهزة الطرد المركزي في 400 مرة G و أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق، والتخلص من فائقة. أعد تعليق كل عينة في 3 ملليلترات من مخزن الغسيل، ثم انتقل إلى تدفق تحليل القياسات. في هذه الدراسة، يتم تقديم أداة قوية للتحقيق في التفاعل الجزيئي خلال تنشيط الخلايا T إيجابية CD8 الإنسان.
يتم إنشاء نظام xenogenic هندسية التي تقدم مستويات منخفضة من pMHC ناهض في وجود أو غياب pMHC ناهض المشترك. ثم يتم استخدام هذه اللجان المضادة للأفراد المهندسة لتحفيز النسخة البشرية CD8 البشرية الخاصة. لا تحفز خلايا CHO غير المُصابة، وخلايا CHO التي تعبر عن عقدة Gag-MHC غير المُحفزة على السلسلة الواحدة.
التعبير عن مستويات عالية من ناهض سلسلة واحدة E183- MHC المعقدة، وهو التحكم الإيجابي، وينظر إلى الحث على كفاءة جدا انترفيرون غاما الإنتاج، وشطب، مما يدل على أن يمكن التعرف على سلسلة واحدة E183 بناء من قبل TCR محددة لتفعيل وظائف T خلية تأثير. التعبير عن مستويات منخفضة من سلسلة واحدة E183- MHC مركب الحث على مستويات أقل من إنتاج الانترفيرون غاما و degranulation، والتي تعززت من وجود غير منبهة غاغ - MHC مجمع. لاحظ أن نسبة عالية جدا من الخلايا CD107a + T لوحظ حتى في استجابة لمستويات منخفضة من pMHC antigenic، وهو ما يتفق مع الدراسات السابقة.
ومع ذلك، فإن وجود مجمع Gag-MHC غير المنشط يزيد من CD107a MFI. خلال هذا الإجراء، من المهم التحكم في التعبير المهون الببتيد MHC لضمان عرض ناهض على قدم المساواة مع أو بدون الببتيد غير المنشط. ومن الأهمية بمكان أن كمي ناهض الببتيد MHC التعبير باستخدام الأجسام المضادة مثل TCR في كل تجربة.
نهج بديل هو استخدام ثنائيات الدهون المدعومة، أو الخرز، وتقديم كمية ثابتة من الببتيد المهضّب MHC في وجود الببتيد غير المنشط MHC. وينبغي أن يسمح هذا النظام التجريبي باختبار متواليات ببتيد غير منبهة متعددة لناهضات المشاركة. ويمكن استخدام تكنولوجيا MHC ذات السلسلة الواحدة للتحقيق في التفاعلات الجزيئية في تنشيط الخلايا T CD4 ، وكذلك للتحقيق في جزيئات MHC غير الكلاسيكية.
يستخدم هذا البروتوكول الدم البشري والخلايا البشرية. اتبع جميع الاحتياطات اللازمة عند العمل مع الدم البشري للحد من خطر انتقال الأمراض المنقولة بالدم.
