Name: use of single chain mhc technology to investigate co-agonism in human cd8+ t cell activation
Uploaded: 2019-02-28T15:00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Single Chain MHC Technology to Investigate Co-agonism in Human CD8+ T Cell Activation at JoVE.com

هذا البحث وأيده "مجلس البحوث الطبية الوطنية" سنغافورة التابعة لوزارة الصحة تحت كبرج/0064/2014 إلى N.R.J.G.، بإنشاء إطار به R571-002-012-592 إلى P.A.M.، "إينفيستيجاتورشيب مؤسسة البحوث الوطنية" R571-000-272-281 إلى P.A.M -، وعلى سنغافورة بحوث متعدية الجنسيات (STaR) محقق جائزة (نمرك/ستار/013/2012) إلى أتال بيهاري نحن ممتنون للدكتور بول هتشينسون، والسيد تيو قو هوي من المرافق "الأساسية تدفق البرنامج" اللائي يقبلن علم المناعة لفرز الخلايا الخبراء. ونحن ممتنون لتشن إيليا لقراءة نقدية من المخطوطة.

الكتاب يعلن لا تضارب المصالح.

ينص البروتوكول على تقديم أداة قوية لتحقيق تفاعلات الجزيئية أثناء تنشيط الخلية CD8 + "تي" البشرية. خطوة حاسمة لتحقيق أجونيسم co أثناء تنشيط الخلية تي البشرية هو السيطرة على الرهن العقاري مؤثر خلية التعبير السطحية لضمان مؤثر متساوية العرض الرهن على ناقلات الجنود المدرعة مع أو بدون مؤثر المشارك الرهن التعبير. في نظامنا التجريبية، ويتحقق ذلك باستخدام استنساخ خلية مفردة التعبير عن كميات قليلة من الرهن مؤثر، تليها سوبيرترانسفيكتيون مع مؤثر المشارك الرهن بناء ومؤثر الرهن تحديد كمي باستخدام الأجسام المضادة مثل تكر10، 32-كمؤثر sc الرهن التعبير يمكن أن تتغير بمرور الوقت، من الأهمية بمكان تحديد مقدار الرهن مؤثر التعبير السطحي على ناقلات الجنود المدرعة المستخدمة في كل تجربة باستخدام الأجسام المضادة مثل تكر. إذا كان متوفراً، لا جسم مثل تكر محددة مؤثر سكمهك--يمكن أن تكون معبراً الانصهار بروتين فلوري، وإعرابها سطح الخلية يمكن ثم قياسها كمياً باستخدام أسلوب الفحص المجهري حساسة، مثل انعكاس الداخلية مجموع الأسفار مجهرية 35 , 36-وعلاوة على ذلك، التعبير الخلية السطحية للرهن العقاري مؤثر المشارك تتناقص بمرور الوقت بسبب تعتمد على مثلايشن والمستقله إسكات مروج CMV37، وينبغي رصد استخدام جسم تلطيخ والتدفق الخلوي التحليل، مع المتكررة نظام مراقبة الأصول الميدانية-الفرز عند الحاجة. ونحن قد مثقف شو الخلايا لمدة 5 أسابيع مع خسارة محدودة نسبيا للتعبير الرهن العقاري اتفاقية استكهولم. ونحن نوصي بشدة تجميد الخلايا تشو قريبا بعد اختيار/الفرز لضمان أسهم موثوقة للخلايا مع اتفاقية استكهولم المعروف MHC التعبير.
يمكن تعديل عدة خطوات للبروتوكولات المقدمة، رهنا بتوافر المعدات، أو اعتماداً على أهداف محددة للبحث. على سبيل المثال، ببمك الانتشار المحتملة يمكن أن تحول دون (الخطوة 3.2.1) باستخدام الطرق البديلة التي لا تتطلب غاما (أو X-) إيرادياتور، مثل المعاملة مع ميتوميسين ج38. يمكن استخدام المخازن مؤقتة تفكك خلية غير الانزيمية المحتوية على المعادن chelators39 بدلاً من خلية القشط في خطوة 3.3.1. وعلاوة على ذلك، يمكن تعديل مستضد تقديم النظام لجعله أكثر ملاءمة لاستنساخ الإنسان CTL الإعراب عن مختلف تكرس. شو الخلايا الهامستر التعبير عن MHC الفئة الأولى الجزيئات، وعلى الرغم من أن هذه ليست ذات صلة للسطر CTL درس هنا (الشكل 2A و الشكل 3 ألف، لاحظنا أية استجابات الخلية T إلى خلايا شو أونترانسفيكتيد)، هناك إمكانية أن تكرس البشرية الأخرى قد تظهر بعض إكسينوريكتيفيتي. في أن حالة، MHC الهامستر الفئة الأولى التعبير يمكن الحد من انقطاع الهامستر β2-ميكروجلوبولين أو الاستفادة من استخدام كريسبر/Cas9؛ أو يمكن استخدام خط APC بشرية بعد ضرب ميكروجلوبولين β2 كريسبر/Cas9-بوساطة أو الصنبور.
النظام التجريبي المقدمة هنا يتيح مراقبة دقيقة للتفاعلات تكر و CD8 مع جزيئات MHC عرض الببتيدات المعرفة مسبقاً. على سبيل المثال، نحن سابقا أظهرت أن الطفرات إلغاء CD8 ملزم40 للرهن العقاري كواجونيست القضاء على تعزيز تفعيل كواجونيست بوساطة في مورين والبشرية CD8 + "تي" الخلايا9،10، بينما يلغي تكر التفاعل مع الرهن مؤثر المشارك ليس أثر على تعزيز تفعيل وساطة كواجونيست10. ومع ذلك، قد استخدام ثوابت السلسلة واحدة MHC العديد من القيود. على سبيل المثال، أن الوقت قد حان والمستهلكة للعمل لاختبار متعددة المشارك مؤثر الببتيد تسلسل باستخدام هذا النظام التجريبي، كما يشمل هذا جيل البلازميدات متعددة ترميز sc MHC مع الببتيدات مختلفة، وترانسفيكشنز اللاحقة وفرز الخلايا. سابقا، استخدمنا خط الخلية تفتقر إلى الصنبور مورين RMA-S لاختبار متعددة الببتيدات مؤثر المشارك في الماوس تي خلية التنشيط8،9، ولكن هذا النهج لم يكن ناجحاً مع نقص الاستفادة البشرية T2 الخلية خط10، الأكثر احتمالاً بسبب عرض مستقلة عن الاستفادة من الببتيدات41. قيد آخر من نظامنا التجريبية أنها لا توفر طريقة سريعة لتغيير كمية الجزيئات الرهن مؤثر المشارك لغرض تحديد مقدار الرهن مؤثر المشارك المطلوبة لتشغيل تنشيط خلية T الحرجة. وعلاوة على ذلك، التتراسيكلين إيندوسيبلي المستخدمة لا يسمح النظام المعايرة لمؤثر كمية الرهن العقاري على مستوى الخلية الواحدة بتغيير تركيز التتراسيكلين، كما يغير متفاوتة تتراسكلين تركيز نسبة الخلايا A2 هلا إيجابية، وبدلاً من مستويات هلا-A2 على أساس كل خلية. نهج بديل ونحن نحقق حاليا هو استخدام الدهن معتمدة بليرس42، استخدمت سابقا للتحقيق أجونيسم co أثناء تنشيط الخلايا CD4 + T مورين4 أو الخرز تقديم مبلغ ثابت للرهن العقاري مؤثر في وجود كميات متفاوتة من الرهن مؤثر المشارك. عندما تستخدم بالاقتران مع التكنولوجيا الببتيد الأشعة فوق البنفسجية--كليفابل4،43، هذه النظم التجريبية البديلة ينبغي السماح باختبار سريع متعددة تسلسلات الببتيد مؤثر المشارك، فضلا عن مبالغ مختلفة للرهن العقاري مؤثر المشارك .
التكنولوجيا MHC اتفاقية استكهولم يمكن أن تكون أيضا تنطبق على التحقيق في أجونيسم co في خلايا CD4 تي البشرية أو مورين، واحد في سلسلة MHC class الثاني جزيئات تقديم تحدد مسبقاً الببتيدات عبرت بنجاح في خلايا الثدييات السطوح44. وعلاوة على ذلك، يمكن توسيع استخدام تكنولوجيا sc MHC لتحقيق جزيئات MHC غير الكلاسيكية مثل هلا-هاء- هلا Sc-ه قد وصفت قبل، والتعبير عنه قد ثبت أن تمنع تنشيط الخلية تي البشرية45. آخر جزيء MHC غير الكلاسيكية للاهتمام هو CD1، الذي يعرض الدهون بدلاً من الببتيدات46. اتفاقية استكهولم بنيات تتكون من سلسلة ثقيلة CD1 و β2-ميكروجلوبولين أظهرت أن يعبر على سطح الخلية وربط دهني ذات الصلة يغاندس47. واحد في سلسلة تكنولوجيا MHC إمكانات كبيرة كأداة بحث للتحقيق في التفاعلات الجزيئية أثناء تنشيط خلية تي وناغورني-كاراباخ.

MHC الفئة الأولى (MHC--أنا) تقديم جزيئات الببتيدات قصيرة (8-10 الأحماض الأمينية) المستمدة من البروتينات تصنيعه من كل خلية. MHC--أنا الجزيئات في خلايا صحية تقدم النفس الببتيدات المستمدة من البروتينات الذاتية. التهاب فيروسي يؤدي إلى العرض تقديمي الببتيدات المشتقة من الفيروسات غير المتمتعة بالحكم الذاتي على MHC--أنا، ولكن الخلايا المصابة حتى هذه الببتيدات غير المتمتعة بالحكم الذاتي وجود كميات كبيرة من النفس الببتيد-MHC (الرهن العقاري). MHC-هو يقرها مستقبلات خلية تي (تكر) ومستقبلات CD8 المشارك في خلايا تي. تكر تقارب ملزمة للرهن العقاري الببتيد يعتمد اعتماداً كبيرا على تسلسل الببتيدات المقدمة، حين ملزمة CD8 الببتيد المستقلة. تكر ملزمة للرهن مؤثر غير المتمتعة بالحكم الذاتي مجمع يؤدي إلى وظائف الخلية تي التنشيط والمستجيب. المجمعات الرهن الذاتي تنشيطية عدم الحث على عدم مهام التنشيط والمستجيب خلية T، ولكن يمكن تعزيز استجابات الخلية T للرهن العقاري مؤثر، من خلال عملية تسمى شركة أجونيسم1،،من23. وقد لوحظ أجونيسم Co في الماوس CD4 + "تي" الخلايا4،،من56 فضلا عن الماوس والبشرية CD8 + "تي" الخلايا7،،من89،10، 11 , 12 , 13-تحت الظروف الفسيولوجية، خلايا تي بحاجة إلى الاعتراف بكميات محدودة للرهن العقاري مؤثر على مستضد تقديم الخلايا (Apc) شارك تقديم مستويات عالية من مجمعات الرهن غير محفزة، اقتراح يسهم ذلك co-أجونيسم تي الأمثل الخلية الحية في الردود. خلية الإجمالي سطح الطبقة MHC أنا المستويات كثيرا ما دوونريجولاتيد خلال14 من الالتهابات الفيروسية والأورام15. هذه الاستراتيجية محصنة ضد التهرب من إنقاص عرض الرهن العقاري مؤثر، ولكن أيضا يقلل من مقدار الرهن مؤثر المشارك أنا متاحة لتعزيز تنشيط خلية تي. وعلاوة على ذلك، الفئة الأولى خلية ارتفاع مستويات التعبير السطحي MHC جزيء ج هلا قد ثبت أن ترتبط مع تحسين فيروس نقص المناعة البشرية مراقبة16، مما يوحي دور حاسم لمجموع MHC class التعبير في تنشيط خلية تي. وعلى الرغم من أهمية فسيولوجية co-أجونيسم، لا يزال غير كامل المفهوم آليتها الجزيئية. هذا إلى حد كبير بسبب التحديات التقنية تجريبيا مراقبة مقدار الرهن مؤثر المشارك قدم مع إبقاء مؤثر ثابت الرهن العقاري.
قمنا بتطوير تجريبي نظام التحقيق co-أجونيسم أثناء تنشيط الخلية CD8 + "تي" البشرية بالتعبير عن MHC البشرية الفئة الأولى جزيئات تقديم الببتيد سلفا ببتيد واحد (واحد سلسلة MHC-الأول، الشكل 1A) في خلية إكسينوجينيك خط9،10. وأعرب الرهن مؤثر واحد في سلسلة (sc) تحت سيطرة المروج التتراسيكلين إيندوسيبلي في خط الخلية تشو تي ركس المستمدة من الهامستر الإعراب عن التتراسكلين قامع؛ يسمح هذا التعبير "راشح" منخفضة جداً لاتفاقية استكهولم مؤثر الرهن العقاري في غياب التتراسيكلين واتفاقية استكهولم ارتفاع مؤثر الرهن التعبير بعد إضافة التتراسيكلين (الشكل 1، ج). وكانت الزنزانات تشو تي ركس sc مؤثر معربا عن الرهن العقاري ثم سوبيرترانسفيكتيد مع مؤثر المشارك غير محفزة، اتفاقية استكهولم الرهن-الأول تحت سيطرة أحد المروجين مؤثرا النشطة (الشكل 1، ج). استخدام هذا النظام التجريبي سمح لنا بمقارنة CD8 + تي خلية الردود على الرهن العقاري مؤثر في وجود أو عدم وجود مستويات عالية للرهن العقاري غير محفزة. حاسمة، منذ الببتيد و MHC-أنا سلسلة ثقيلة ترتبط تساهميا في سكمهك-أنا تنسيق، وهذا يسمح مقدمات للطفرات إلى جزيئات MHC عرض الببتيدات سلفا. استخدام سمك--أنا التكنولوجيا مما أتاح لنا أن تعدل خصائص تكر أو CD8-ملزم للرهن العقاري مؤثر أو مؤثر المشارك على وجه التحديد.
Co-أجونيسم في تنشيط الخلية CD8 + T وقد لوحظ استخدام MHC المنقي-أنا مجمعات عرض مؤثر ومؤثر المشارك الببتيدات في شكل هيتيروديميرس11،17 أو عرضها على الكم ونقاط12،13. العمل في وقت مبكر في co-أجونيسم في تنشيط الخلية CD8 + "تي" في السياق الاعتراف بالرهن العقاري مؤثر في آسيا والمحيط الهادئ كخطوط الخلايا التي تفتقر إلى TAP2 ناقلات الجنود المدرعة. الصنبور مطلوب للنقل الببتيد من السيتوبلازم إلى هيولى، ونقص الاستفادة من شدة يقلل تجمع الطبقة MHC المتاحة-ربط الببتيدات. نظراً لغياب الببتيدات، مجمع الوليدة MHC الفئة الأولى سلسلة ثقيلة وبيتا2-ميكروجلوبولين غير مستقر، أسفر عن MHC منخفضة جداً--أنا خلية التعبير السطحي. في البداية، مقارنة بين خلايا تي حفزت مع مستضد محملة على الاستفادة الكافية والماوس ناقص الجيش الملكي المغربي والجيش الملكي المغربي-S خطوط الخلايا، على التوالي، كناقلات الجنود المدرعة، لم تكشف عن أي أدلة لشركة أجونيسم خلال الماوس تنشيط خلية T18. ومع ذلك، لم يسمح استخدام هذا النظام التجريبي دقة السيطرة على مقدار الرهن مؤثر قدم مستقلة عن الرهن الذاتي غير محفزة. وعلاوة على ذلك، قد تختلف هذه الخطوط الخلية اثنين أيضا في التعبير عن الجزيئات الأخرى التي تعدل تنشيط خلية T، مثل يغاندس لمستقبلات خلية تي كوستيمولاتوري أو المثبطة، أو جزيئات الالتصاق.
وفي وقت لاحق، علينا وضع بروتوكول لتحميل خلايا تفتقر إلى TAP2 الجيش الملكي المغربي-S مع الببتيدات خارجية للسماح بعرض مبلغ ثابت للرهن العقاري مؤثر في وجود أو غياب للرهن العقاري غير محفزة. وقد تحقق ذلك من خلال ما يلي: الحضانة للجيش الملكي المغربي التي تفتقر إلى TAP2-S الخلايا عند درجات حرارة منخفضة (28 درجة مئوية، بدلاً من المعتاد 37 درجة مئوية) لتحقيق استقرار MHC فارغة الفئة الأولى سلسلة ثقيلة/β2 microglobulin مجمعات19؛ الحضانة عند 28 درجة مئوية مع الببتيد مؤثر خارجية؛ الحضانة عند 28 درجة مئوية في وجود أو عدم وجود الببتيد غير محفزة خارجية؛ والحضانة عند 37 درجة مئوية للحد من الخلايا السطحية التعبير عن MHC فارغة الفئة الأولى المجمعات8،9. استخدام هذا الإعداد التجريبية كشفت أن تعزيز الوجود للرهن العقاري غير محفزة التنشيط الماوس الثيموسيه والسذاجة الطرفية CD8 + "تي" الخلايا CTLs8. ميتشانيستيكالي، يمكن أن تحفز وجود الرهن غير محفزة CD8 التجنيد الخلية: APC تي المشبك محصنة حتى في الغياب للرهن العقاري مؤثر، والرهن غير محفزة ويمكن تعزيز التفاعل تكر مع CD8 التمييز7،8. ومع ذلك، لا يسمح هذا النظام التجريبي اختبار المساهمة النسبية لربط التمييز تكر و CD8 للرهن العقاري مؤثر ومؤثر المشارك في التوسط في تعزيز التنشيط، كالتعديلات أي تغيير الربط تكر أو CD8 للطبقة MHC أود أن تؤثر على جميع جزيئات MHC، بغض النظر عن عرض الببتيد. ولذلك استخدمنا الطبقة MHC أخص بسلسلة التكنولوجيا للتغلب على هذه المشكلة.
وقد استخدمت الطبقة MHC سلسلة واحدة (sc) تنسيق أنا قبل لتحسين عرض الرهن مولده للاستراتيجيات العلاجية، وللإجابة على أسئلة أساسية على آليات لتفعيل مستقبلات الخلية تكر وناغورني-كاراباخ وتعمل20،21 . سمك-الأول يتألف من الببتيد، β2-ميكروجلوبولين و MHC--أنا سلسلة ثقيلة وانضم اثنان linkers سيرين/جليكاين-الأغنياء مرنة (الشكل 1A)، كانت عدة تسلسلات مختلفة رابط طورت واختبرت22. سمك--يمكن أن أمثال مستقل عن برنامج المشورة التقنية المعقدة والبروتينات اللازمة للرهن العقاري التقليدية المعقدة الجمعية20لكوصي. سكمهك-وقد أظهرت أن يطوي بشكل صحيح، كما تحدد باستخدام الأجسام المضادة الخاصة بتكيف تلطيخ22 وحل هيكل اتفاقية استكهولم مع23من البلورات بالأشعة السينية. سمك الأساسية--أنا تم تعديل التصميم لتحسين الربط تقارب منخفضة الببتيدات24،25.
يصف هذا البروتوكول استخدام سمك البشرية-الأول للتحقيق أجونيسم co أثناء CTL البشرية استنساخ التنشيط. تم تحسين البروتوكول لاستنساخ البشر CTL محددة حانمه فيروس التهاب الكبد B (HBV). HBV عبء الرعاية الصحية شديدة في جميع أنحاء العالم، كما أن هناك 350 مليون شخص مصاب بالتهاب وعدوى التهاب مزمنة يمكن أن تؤدي إلى تطوير سرطانه الخلية الكبدية (HCC). يمكن أن يقدم عادة [ابيتوبس] HBV-مشتقة الخلايا العقود الناجمة عن الإصابة بالتهاب ويمكن التعرف عليه بالخلايا التائية البشرية محددة. إزالة HBV والعقود يعتمد على ردود الخلية T البشرية26، لكن العقود المرضى الذين غالباً ما يعانون من استنفاد الخلايا T وانخفاض تي خلية الردود27. إدخال تكر HBV-خاصة في خلايا تي من HBV قد حوكم كاستراتيجية العلاج المناعي محتملة للقضاء على الإصابة بالتهاب مزمن28. بيد أنه غير معروف إذا كان هذا الأسلوب سوف تكون فعالة في إعداد سريرية، بسبب انخفاض مستويات MHC السطحية--أنا في خلايا الكبد البشري29. ولذلك، فهم إليه كواجونيسم قد توفر منظورات بديلة للعلاج المناعي HBV، ربما عن طريق تعزيز العرض التقديمي للرهن العقاري الذاتية للحث على ردود الخلية T co-أجونيسم-بوساطة. البروتوكول يغطي جميع الخطوات اللازمة للبحوث على البشرية co-أجونيسم: تعداء الخلايا تشو تي ركس مع الرهن العقاري اتفاقية استكهولم مؤثر ومؤثر المشارك، جيل خطوط الخلايا تشو تي ركس مستقرة، وثقافة محددة HBV البشرية CTL CD8 + "تي" خلية خط والتنشيط CTL تجارب قياس إنتاج سيتوكين وتحبب استجابة لخلايا تي ركس تشو. على الرغم من أن نركز على استخدام sc MHC الفئة الأولى تكنولوجيا للتحقيق أجونيسم co أثناء تنشيط خلية HBV T، وتجدر الإشارة إلى أن أساليب عرض يمكن تكييفها للبحوث المتعلقة بالجوانب الأخرى لتنشيط الخلية T بسهولة في النظم البشرية T الخلية مع الرهن العقاري معروفة--أنا خصوصية.
هذا البروتوكول يستخدم الإنسان CD8 + CTL خط محدد المستمدة من HBV الببتيد E183-91 (فلتريلتي: "E183")30 قدم على هلا-A2. اتفاقية استكهولم هلا جزيئات تتكون من تسلسل إشارة من البشر β2-microglobulin، ببتيد ملزم هلا-A2 الاهتمام ورابط جليكاين/سيرين، β2-ميكروجلوبولين بشرية، ورابط جليكاين/سيرين و A2 من السلسلة الثقيلة يمكن أن يكون تجارياً تصنيعه (الشكل 1A ). والبلازميدات ترميز ثوابت scA2 مع الببتيد E183 مؤثر، أو "فيروس نقص المناعة البشرية" (سلينتفاتل) اسكت كواجونيست31 الببتيدات متوفرة من المؤلفين عند الطلب. يمكن تغيير تسلسل الببتيد باستخدام الطفرات الموجهة على الموقع. ناقل التتراسيكلين إيندوسيبلي pcDNA5/استخدم للتعبير عن سلسلة واحدة مؤثر هلا-A2 مع E183 الببتيد (sc E183-هلا-A2). حضور قامع التتراسكلين، pcDNA5 وإلى بلازميد يتيح التعبير فقط منخفضة جداً، "راشح" من بروتين الاهتمام؛ يمكن أن يتسبب التعبير عالية بإضافة التتراسيكلين (الشكل 1، ج). يسمح استخدام نظام التعبير التتراسيكلين إيندوسيبلي للسيطرة على مقدار خلية مؤثر سطحي الرهن التعبير. PcDNA3.1 تأسيسي تعبير بلازميد استخدمت للتعبير عن scA2 كواجونيست مع هفوة الببتيد (sc هفوة-هلا-A2). التعبير ينظم التتراسيكلين تشو (تي ركس) الخلية خط (خط الخلية الهامستر، لا MHC البشرية الذاتية) استخدمت للتعبير عن نيات sc-هلا-A2 مؤثر ومؤثر المشارك. ويسمح هذا النظام التجريبي تحكماً دقيقا في تقديم الرهن العقاري (الشكل 1): لا تقديم الرهن العقاري (أونترانسفيكتيد تي ريكس)، وعلى كمية عالية من تقديم الرهن العقاري مؤثر المشارك (sc التأسيسي التعبير هفوة-هلا-A2)، مبلغاً ضئيلا للرهن العقاري مؤثر العرض التقديمي (sc E183-هلا-A2 في الغياب من التتراسيكلين)، وعلى كمية عالية من مؤثر الرهن العرض التقديمي (sc E183-هلا-A2 حضور التتراسيكلين)، كمية منخفضة من تقديم الرهن العقاري مؤثر والتعبير عالية للرهن العقاري مؤثر المشارك (sc E183-هلا-A2 في نظراً لغياب التتراسيكلين، واتفاقية استكهولم التأسيسي التعبير هفوة-هلا-A2). يتيح استخدام هذا النظام التجريبي مراقبة دقيقة لمبالغ الخلية السطحية مؤثر والرهن كواجونيست.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aim-V (serum free media)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12055091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blasticidin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm (fixation/permealibisation kit)</td>
			<td>BD</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH3007103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>geneticin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10131035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GolgiPlug (Brefeldin A)</td>
			<td>BD</td>
			<td>555029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hygromycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10687010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (low serum media)</td>
			<td>Bibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 X PBS</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>PB0344 &#8211; 1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>408727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant human IL2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>202-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant human IL7</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>207-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant human IL15</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>247-ILB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetracycline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-REx CHO cell line</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R71807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 x Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BD</td>
			<td>347347</td>
			<td>Clone SK7, RRID:AB_400287</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8&#945;</td>
			<td>BD</td>
			<td>563795</td>
			<td>Clone RPA-T8, RRID:AB_2722501</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD107a</td>
			<td>BD</td>
			<td>566261</td>
			<td>Clone H4A3, RRID:AB_2739639</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-A2</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-9876-41</td>
			<td>Clone BB7.2, RRID:AB_11151522</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-&#947;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-7319-41</td>
			<td>Clone 4S.B3, RRID:AB_1311250</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of single chain mhc technology to investigate co-agonism in human cd8+ t cell activation

الببتيد النفس عدم تنشيطية مجمعات MHC (الرهن العقاري) الحث على عدم مهام التنشيط والمستجيب خلية T، ولكن يمكن تعزيز استجابات الخلية T للرهن العقاري مؤثر، من خلال عملية تسمى أجونيسم co. يصف هذا البروتوكول التجريبي نظام التحقيق co-أجونيسم أثناء تنشيط الخلية CD8 + "تي" البشرية بالتعبير عن MHC البشرية الفئة الأولى تقديم الببتيدات سلفا كجزيئات مفردة البروتينية (واحد في سلسلة MHC) في خط خلية إكسينوجينيك. وأعربنا عن سلسلة واحدة مكس تحت ظروف حيث أعرب عن المستويات المنخفضة لمؤثر واحد في سلسلة MHC ف المجمعات ومستويات عالية من مجمعات MHC ف سلسلة واحدة غير محفزة. استخدام هذا النظام التجريبي سمح لنا بمقارنة CD8 + تي خلية الردود على الرهن العقاري مؤثر في وجود أو غياب للرهن العقاري غير محفزة. وصف البروتوكول تعداء خط الخلية مع ثوابت السلسلة واحدة MHC، خطوط جيل خلية مستقرة، الثقافة الخاصة بفيروس التهاب الكبد البائي البشرية CD8 + "تي" الخلايا وتنشيط خلية T تجارب إنتاج سيتوكين في الوقت نفسه تحديد و تحبب. يمكن استخدام طرق عرض للبحوث المتعلقة بجوانب مختلفة من CD8 + تي خلية التنشيط في النظم البشرية T الخلية مع خصوصية الببتيد المعروفة MHC.

اتفاقية استكهولم MHC الفئة الأولى التكنولوجيا المستخدمة هنا يتيح مراقبة دقيقة للتعبير خلية سطح الطبقة MHC أنا مع الببتيدات المعروف، مرتبط تساهميا، للحث على تنشيط خلية تي. ونحن قد ولدت المهندسة إكسينوجينيك APC نظام (الشكل 1 أ، ب، ج) تسمح بالعرض التقديمي للمستويات المنخفضة للرهن العقاري مؤثر في وجود أو غياب للرهن العقاري مؤثر المشارك (الشكل 1، ه). نقديا، استخدمنا محدد مثل تكر جسم لهلا-A2 الببتيد E183 عرض لإظهار هذا العرض لاتفاقية استكهولم مؤثر ولا يتم تبديل E183-هلا-A2 بالتعبير المشارك لاتفاقية استكهولم مؤثر المشارك هفوة-هلا-A2 (الشكل 1E). ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن جسم مثل تكر محددة E183-هلا-A2 يظهر بعض ملزمة لهلا-A2 تقديم هفوة الببتيد (الشكل 1E). يمكن بناؤها مستضد هندسيا مماثلة تعرض الخلية نظم استخدام الببتيدات مختلفة أو جزيئات MHC للتحقيق في المتطلبات الجزيئية للتفاعلات تكر و/أو التمييز في خلايا تي البشرية مع خصوصيات مختلفة.
استخدمنا هذه المدرعة هندسيا لحفز E183-هلا-A2-محددة CD8 + تي خلية استنساخ البشر. واستخدمت ثلاثة عناصر سلبية: تي الخلايا خلايا تشو تي ركس فقط، أونترانسفيكتيد، وخلايا تي ركس تشو معربا عن كميات عالية من اتفاقية استكهولم مؤثر المشارك هفوة-هلا-A2 لاختبار T المحتملة خلية التنشيط بأي جزيئات أعرب في الخلايا تشو تي ريكس (تي ريكس أونترانسفيكتيد شو الخلايا بالمقارنة مع تي الخلية فقط)، ولتنشيط خلية T بمقرر اتفاقية استكهولم-اسكت-هلا-A2 (الخلايا تشو تي ركس معربا عن مستويات عالية من مقرر اتفاقية استكهولم-اسكت-هلا-A2 بالمقارنة مع أونترانسفيكتيد تشو تي ركس الخلايا). أونترانسفيكتيد شو تي ركس الخلايا أو الخلايا تي ركس تشو معربا عن اتفاقية استكهولم-اسكت-هلا-A2 عدم حمل التنشيط لاستنساخ CTL CD8 + E183-هلا-A2-محددة، كما يحددها التحديد الكمي لإنتاج IFN-γ والتعبير عن علامة تحبب CD107a كمقياس للخلية T سيتوتوكسيسيتي (الشكل 2 أ، ب). التعبير عن مستويات عالية من اتفاقية استكهولم مؤثر E183-هلا-A2، تستخدم كمراقبة إيجابية والمستحثه IFN-γ إنتاج فعالة جداً وتحبب (الشكل 2 أ، ب)، مما يدل على أن بناء هلا-A2 اتفاقية استكهولم يمكن التعرف عليه تكر محددة لتنشيط وظائف المستجيب الخلية t. التعبير عن المستويات المنخفضة لاتفاقية استكهولم E183-هلا-A2 الناجم عن انخفاض مستويات الإنتاج IFN-γ وتحبب، وهذا تم تعزيز وجود مؤثر المشارك sc هفوة-هلا-A2 (الشكل 2 أ، ب). تجدر الإشارة إلى أن نسب عالية جداً من الخلايا CD107a + T لوحظت حتى في استجابة لمستويات منخفضة من الرهن مستضدي (الشكل 2)، تتسق مع التقارير السابقة لمتطلبات منخفضة نسبيا مقدار الرهن مؤثر لتحريض الخلايا T سيتوتوكسيسيتي33. مؤسسة مونتانيار CD107a، تشير إلى مقدار تحبب على أساس خلية واحدة، يوفر أفضل مجموعة ديناميكية (الشكل 2). يسمح الإنزيم تنشيط خلية T تستخدم الكمي المتزامن لاثنين من المهام الرئيسية المستجيب: سيتوكين الإنتاج وسيتوتوكسيسيتي، ويقدم قراءات حساسة جداً مع مجموعة ديناميكية جيدة.
استخدمنا التكنولوجيا سلسلة واحدة لاختبار ما إذا كانت ملزمة تكر للرهن العقاري مؤثر المشارك المطلوبة لتعزيز تفعيل الرهن العقاري تعتمد على مؤثر المشارك. نحن تحور فالين في موقف 152 على الحافة الاخدود ملزمة الببتيد هلا-A2 (الشكل 3B) إلى حمض الجلوتاميك لإنشاء متحولة V152E، كما تم الإبلاغ عن هذه الطفرة إلغاء ربط تكر إلى A2 هلا34. ثم قمنا باختبار إذا كان يمكن إلغاء الطفرة V152E تكر ملزمة لاستنساخ CTL E183-هلا-A2 المستخدمة، من خلال إدخال هذه الطفرة في اتفاقية استكهولم مؤثر E183-هلا-A2 والإعراب عن بناء اتفاقية استكهولم مؤثر متحولة في الخلايا تشو تي ركس. اتفاقية استكهولم نوع البرية، ولكن لا V152E، E183-هلا-A2 التي يسببها التنشيط لاستنساخ CTL E183-هلا-A2-الخاصة بالمستخدم (الشكل 3A). تجدر الإشارة إلى أن أي طفرة تكر الملزمة على الطبقة MHC أنا يحتاج لفحصها بشكل منفصل لكل استنساخ تكر/T الخلية الفردية المستخدمة، كما سيتوقف تأثير الطفرة على التفاعلات الجزيئية الدقيقة بين تكر والرهن العقاري المعقدة، وهذه سوف تختلف بين تكرس مختلفة. على سبيل المثال، اختبرنا الطفرات الثمانية، أما ذكرت سابقا الطفرات تكر الملزمة أو الطفرات التي تنبأت بتعطيل الربط تكر دون إلغاء ربط الببتيد إلى هلا-A2. من هؤلاء، كان V152E الطفرة الوحيدة التي إلغاء التنشيط لاستنساخ الخلايا T E183 محددة تستخدم10. ثم عرض الطفرة V152E في اتفاقية استكهولم مؤثر المشارك هفوة-هلا-A2، والمشترك وأعرب sc WT أو V152E هفوة-هلا-A2 مع مستويات منخفضة من اتفاقية استكهولم مؤثر E183-هلا-A2. اتفاقية استكهولم WT و V152E المحسن هفوة-هلا-A2 الإنتاج IFN-γ وتحبب (الشكل 3د)، مما يوحي بأن تكر ملزمة للرهن العقاري مؤثر المشارك غير مطلوب لمؤثر المشارك تعتمد على الرهن العقاري CD8 + "تي" خلية التنشيط تعزيز. واحد في سلسلة MHC الفئة الأولى التكنولوجيا، كما عرضت هنا، ويمكن استخدامها لتعديل تكر و/أو التمييز ملزمة بفئة MHC أنا مع الببتيد المعروفة للتحقيق في متطلبات الجزيئي للخلية T مستضد الاعتراف والتنشيط.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59126/59126fig1.jpg"> رقم 1: واحدة سلسلة هلا-A2 بنيات المستخدمة للتحقيق المشارك مؤثر في تنشيط الخلية CD8 + "تي" البشرية. (أ) رسم تخطيطي لبناء سكلا-A2، تتألف من تساهمي إشارة تسلسل من تنصهر البشرية بيتا2 microglobulin، الببتيد الاختيار، رابط سيرين جليكاين مرنة (جججسجججس جججس)، والإنسان بيتا2 microglobulin، مرنة رابط جليكاين-سيرين وسلسلة ثقيلة هلا-A2. (ب) رسم تخطيطي والبلازميدات المستخدمة لتوليد مستضد هندستها تعرض الخلايا للتحقيق أجونيسم co في تنشيط الخلية CD8 + "تي" البشرية: قامع التتراسيكلين, sc مؤثر E183-هلا-A2 تحت سيطرة المروج التتراسيكلين إيندوسيبلي، sc مؤثر المشارك غير محفزة هفوة-هلا-A2 تحت سيطرة المروج النشط مؤثرا. (ج) رسم تخطيطي مستضد هندسيا عرض الخلايا المستخدمة للتحقيق co-أجونيسم: تشو تي ركس الخلايا (لا البشرية التعبير MHC)، والخلايا تي ركس تشو معربا عن مستويات عالية مؤثرا لاتفاقية استكهولم هفوة-هلا-A2 (مؤثر المشارك غير محفزة الرهن العقاري)، الخلايا خلايا تشو تي ركس معربا عن تدني مستويات "راشح" لاتفاقية استكهولم E183-هلا-A2 في غياب التتراسيكلين (تدني مستوى الببتيد مؤثر)، خلايا تي ركس تشو معربا عن مستويات عالية من اتفاقية استكهولم E183-هلا-A2 حضور التتراسيكلين (ارتفاع مستوى الببتيد مؤثر)، تشو تي ركس وإذ تعرب عن المستويات المنخفضة لاتفاقية استكهولم E183-هلا-A2 ومستويات عالية من اتفاقية استكهولم هفوة-هلا-A2 (تدني مستوى الببتيد مؤثر) وارتفاع مستوى الببتيد مؤثر المشارك. (د) الخلايا تلطيخ السطحية من مستضد هندسيا عرض خطوط الخلية باستخدام الأجسام المضادة-هلا-A2. الأرقام المعروضة تدل القيم مؤسسة مونتانيار لوصمة عار MHC في بوابة الخلية الحية. بيانات الممثل من التجارب المستقلة 5 (ﻫ) خلية تلطيخ السطحية من مستضد هندسيا عرض خطوط الخلية باستخدام جسم مثل تكر محددة ضد الببتيد E183 عرض هلا-A2. الأرقام المعروضة تدل القيم مؤسسة مونتانيار لوصمة عار MHC في بوابة الخلية الحية. بيانات الممثل 5 تجارب مستقلة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59126/59126fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59126/59126fig2v3.jpg"> رقم 2: تعزيز الوجود للرهن العقاري مؤثر المشارك إنتاج سيتوكين وتحبب مستنسخ CTL CD8 + E183-هلا-A2-خاصة- (أ) داخل الخلايا IFN-γ تلطيخ هلا-A2-محددة CD8 + CTL مستنسخ بعد التحفيز ح 3 مع المشار إليه هندسيا مستضد عرض الخلايا. الأرقام المعروضة الدلالة الإيجابية النسبة المئوية لتلطيخ IFN-γ. بيانات الممثل 3 تجارب مستقلة، كل إجراء مع تريبليكاتيس التقنية. سطح الخلية (ب) CD107a تلطيخ هلا-A2-محددة CD8 + CTL مستنسخ بعد التحفيز ح 3 مع المشار إليه هندسيا مستضد عرض الخلايا. تدل الأرقام المعروضة نسبة إيجابية لتلوين CD107a أو CD107a مؤسسة مونتانيار للسكان الخلية CD8 + T. بيانات الممثل 3 تجارب مستقلة، كل إجراء مع تريبليكاتيس التقنية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59126/59126fig2v3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59126/59126fig3.jpg"> الشكل 3: مؤثر المشارك – لا يتطلب تعزيز تفعيل وساطة T الخلية تكر ملزمة للرهن العقاري مؤثر المشارك المعقدة. (أ) V152E الطفرة في اتفاقية استكهولم E183-هلا-A2 يلغي تنشيط CD8 + CTL مستنسخ E183-هلا-A2-محددة. واستخدمت خلايا تي ركس تشو معربا عن مستويات عالية (التتراسيكلين التعريفي) من اتفاقية استكهولم متحولة WT أو V152E E183-هلا-A2 لتحفيز E183-هلا-A2-الخاصة باستنساخ CD8 + CTL البشرية ح 3. كان كمياً تنشيط الخلية تي استخدام تلطيخ IFN-γ داخل الخلايا. الأرقام المعروضة الدلالة الإيجابية النسبة المئوية لتلطيخ IFN-γ. بيانات الممثل 3 تجارب مستقلة، كل إجراء مع تريبليكاتيس التقنية. (ب) موقع الطفرة V152E داخل الاخدود ملزمة الببتيد من هلا-A2. (ج) طفرة V152E في اتفاقية استكهولم هفوة-هلا-A2 مؤثر المشارك الرهن معقدة لا إلغاء التنشيط المشارك agonist تعتمد على تعزيز. داخل الخلايا IFN-γ تلطيخ هلا-A2-محددة CD8 + CTL مستنسخ بعد التحفيز ح 4 مع المشار إليه هندسيا مستضد عرض الخلايا. الأرقام المعروضة الدلالة الإيجابية النسبة المئوية لتلطيخ IFN-γ. بيانات الممثل 3 تجارب مستقلة، كل إجراء مع تريبليكاتيس التقنية. (د) V152E الطفرة في اتفاقية استكهولم هفوة-هلا-A2 مؤثر المشارك الرهن معقدة لا إلغاء التنشيط المشارك agonist تعتمد على تعزيز. الخلايا السطحية CD107a تلطيخ هلا-A2-محددة CD8 + CTL مستنسخ بعد التحفيز ح 3 مع المشار إليه هندسيا مستضد عرض الخلايا. تدل الأرقام المعروضة نسبة إيجابية لتلوين CD107a أو CD107a مؤسسة مونتانيار للسكان الخلية CD8 + T. بيانات الممثل 3 تجارب مستقلة، كل إجراء مع تريبليكاتيس التقنية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59126/59126fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Use of Single Chain MHC Technology to Investigate Co-agonism in Human CD8+ T Cell Activation at JoVE.com

Use of Single Chain MHC Technology to Investigate Co-agonism in Human CD8+ T Cell Activation

استخدام تكنولوجيا MHC سلسلة واحدة للتحقيق في أجونيسم Co في البشرية CD8 + تي خلية التنشيط

ويصف هذا البروتوكول الاستخدام سلسلة واحدة MHC الفئة الأولى مجمعات للتحقيق في التفاعلات الجزيئية في تنشيط الخلية CD8 + "تي" البشرية: يبني جيل مستضد هندسيا عرض الخلايا معربا عن سلسلة واحدة، ثقافة البشرية استنساخ الخلية CD8 + T وتجارب التنشيط خلية تي.

Non-stimulatory self peptide MHC (pMHC) complexes do not induce T cell activation and effector functions, but can enhance T cell responses to agonist ...

غير المنشطات الببتيد MHC المجمعات لا تنشيط الخلايا التائية ولكن يمكن أن تعزز استجابات الخلية T لpetide ناهض MHC. يصف هذا البروتوكول نظام تجريبي للتحقيق في ناهض مشترك أثناء تنشيط الخلايا T CD8 الإنسان. نحن نعبر عن جزيئات MHC كمجمعات واحدة بالسلاسل مع سلسلة ثقيلة مرتبطة بتكهية ، بيتا - 2 ميكروغلوبولين ، والببتيد.وهذا يسمح بإدخال الطفرات في جزيئات MHC تقديم الببتيدات المحددة سلفا. يستخدم هذا البروتوكول استنساخ CTN الإنسان، وهو محدد لنوبة من فيروس التهاب الكبد B. فهم آلية ناهض المشترك خلال استجابات الخلايا التى ضد التهاب الكبد يمكن أن يسهم في تطوير مناعي ضد هذه العدوى الفيروسية.ويمكن استخدام الأساليب المعروضة في البحوث وغيرها من الجوانب الأساسية لتفعيل الخلية T في أنظمة الخلايا T الإنسان مع خصوصية معروفة MHC الببتيد. يستخدم هذا البروتوكول واحد سلسلة الإنسان MHC فئة I الجزيئات ، التي تتكون من تسلسل إشارة ، الببتيد من الفائدة ، linker ، الإنسان بيتا 2 - microglobulin linker ، وسلسلة ثقيلة MHC. يستخدم الببتيد E1A3 من التهاب الكبد B كما الببتيد ناهض.يستخدم الهفوة من فيروس نقص المناعة البشرية كما الببتيد غير المنشط. يتم التعبير عن جزيئات MHC البشرية ذات السلسلة الواحدة في خط خلية الهامستر الذي يحتوي على مكبوت التتراسيكلين. يتم التعبير عن MHC أحادي السلسلة الناهضة باستخدام التتراسيكلين-inducible plasmid، مما يؤدي إلى مستويات التعبير منخفضة جدا في غياب التتراسيكلين، وارتفاع مستويات التعبير في وجود تتراسيكلين.خلايا CHO التي تعبر عن مستويات منخفضة من الببتيد المهاتي MHC مصابة بببتيد غير منبه غير مُبَرَّغ عنه بشكل مكوّن MHC. استخدام هذا النظام التجريبي يسمح بمقارنة استجابات الخلية T إلى الببتيد المهدّب MHC في وجود أو عدم وجود الببتيد غير المنشط MHC. لبدء هذا الإجراء، زراعة خلايا CHO في قارورة T-75، كما هو موضح في بروتوكول النص.في اليوم السابق لتجربة تنشيط الخلية T، قم بغسل الخلايا في القارورة باستخدام PBS. إضافة حل يحتوي على 05٪ التربسين و 2٪ EDTA في برنامج تلفزيوني، واحتضان لمدة خمس إلى عشر دقائق في درجة حرارة الغرفة. باستخدام مجهر خفيف، لاحظ الخلايا للتأكد من أنها قد فصل.ثم أضف F12 كاملة إلى القارورة لوقف التربسينية. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب 15 ملليلتر. جهاز طرد مركزي في 400G لمدة خمس دقائق، وإزالة المابير عن طريق الأنابيب إما أو decanting.إعادة تعليق بيليه الخلية في خمسة ملليلتر من F12 كاملة. استخدم مقياس الهيموسيت لعد الخلايا، وضبط تركيز الخلايا إلى 200000 خلية لكل ملليلتر في CF12. إضافة 50 إلى 60 نانوغرام لكل ملليلتر من التتراسيكلين إلى عينات ناهض فقط للحث على كميات عالية من فئة pMHC ناهض الأول كتحكم إيجابي.بعد ذلك، اخلطي خلايا CHO إما عن طريق التنبيب أو الخفقان. إضافة 100 ميكرولترات من تعليق الخلية إلى كل بئر من لوحة U-أسفل 96-well. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.في اليوم السابق للتجربة، خلايا CTLS بالطرد المركزي في 400 مرة G و أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. استخدم مقياس الدم لحساب الخلايا، ثم أعد تعليقها بكثافة مليون خلية لكل ملليلتر في وسائط الخلايا التائية البشرية الكاملة بدون السيتوكينات أو PHA. احتضان CTLs بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.وفي اليوم التالي، كانت الخلايا التائية تعمل بالطرد المركزي بمعدل 400 مرة في G، وبأربعون درجات مئوية لمدة خمس دقائق. تجاهل عظمى، وإعادة تعليق الخلايا في 2 ملليلتر من وسائل الإعلام الكاملة خالية من المصل. استخدام مقياس الدم لحساب الخلايا التائية، وضبط كثافتها إلى مليون خلية حية لكل ملليلتر في كامل وسائل الإعلام خلية T الإنسان.إضافة المضادة المضادة للدمية CD107a المضادة في تخفيف واحد إلى 100، وBrefeldin A في تخفيف واحد إلى 1000. بعد ذلك، استرداد لوحة 96-well التي تحتوي على خلايا CHO. باستخدام ماصة باستور الزجاج، التعرق وسائل الإعلام من خلايا CHO.إضافة 200 ميكرولترات من تعليق الخلية T إلى كل بئر. شارك في زراعة الخلايا التائية مع خلايا CHO في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاث إلى أربع ساعات. وفي نهاية الثقافة المشتركة، تعمل أجهزة الطرد المركزي على 96 بئراً في 400 مرة من G وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق.إزالة افرنح عن طريق التعرق أو الخفقان. ثم إضافة 2.5 ميكرولتررس من الأجسام المضادة CD3 و 2.5 ميكرولترات من الأجسام المضادة CD8 في 50 ميكرولترات من 5٪ BSA في برنامج تلفزيوني لكل بئر، لسطح الخلية مستضد تلطيخ، ومزيج عن طريق الأنابيب. احتضان العينات في الظلام، وعلى الجليد، لمدة 30 دقيقة.بعد هذا، إضافة 150 ميكرولترات من عازلة غسل إلى كل بئر لغسل العينات. أجهزة الطرد المركزي العينات في 400 مرة G و4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق. إزالة افرنح عن طريق التعرق أو الخفقان.تعيين مجموعة التثبيت / Permeabilization ، وإضافة 100 ميكرولترات من حل التثبيت / permeabilization لكل بئر ، وماصة لخلط. احتضان على الجليد لمدة 20 دقيقة. ثم، الطرد المركزي في 400 مرة G في أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق.تجاهل supernatant وإضافة 200 ميكرولترات من 1X بيرم / غسل العازلة إلى كل بئر. كرر هذه العملية من الطرد المركزي من خلال إضافة المخزن المؤقت بيرم/ الغسيل مرة واحدة. بعد ذلك، إعادة تعليق الخلايا في 50 ميكرولترات من بيرم / غسل العازلة التي تحتوي على مضاد للفيروسات غاما بتركيز 3 ميكروغرام لكل ملليلتر.احتضان على الجليد في الظلام لمدة 30 دقيقة. المقبل، إضافة 150 ميكرولترات من 1X بيرم / غسل العازلة. جهاز طرد مركزي عند 400 جي، أربع درجات مئوية، لمدة خمس دقائق.إزالة عظمى وإضافة 200 ميكرولترات من 1X بيرم / غسل العازلة. الطرد المركزي لوحة مرة أخرى في 400 مرة G، أربع درجات مئوية، لمدة خمس دقائق، وإزالة افرنح عن طريق الطامح أو الخفقان. إعادة تعليق العينة في 200 ميكرولترات من العازلة غسل والمضي قدما مع تحليل السيتومترية.قبل يوم واحد من التجربة، اخلطي خلايا CHO إما عن طريق الدوامة أو الخفقان. أضف التالي ملليلتر واحد من تعليق الخلية إلى كل بئر من لوحة 12-well. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.في يوم التجربة، استخدم مكشطة الخلايا لفصل خلايا CHO من أسفل كل بئر. نقل ملليلتر واحد من وسائل الإعلام التي تحتوي على الخلايا من كل بئر إلى أنابيب FACS. جهاز طرد مركزي في 400 مرة G و4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق.إعادة تعليق في 100 ميكرولترات من الأجسام المضادة HLA المخففة في عازلة الغسيل. احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة. ثم إضافة ملليلتر واحد من مخزن الغسيل إلى كل عينة CHO.أجهزة الطرد المركزي في 400 مرة G و أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق، والتخلص من فائقة. أعد تعليق كل عينة في 3 ملليلترات من مخزن الغسيل، ثم انتقل إلى تدفق تحليل القياسات. في هذه الدراسة، يتم تقديم أداة قوية للتحقيق في التفاعل الجزيئي خلال تنشيط الخلايا T إيجابية CD8 الإنسان.يتم إنشاء نظام xenogenic هندسية التي تقدم مستويات منخفضة من pMHC ناهض في وجود أو غياب pMHC ناهض المشترك. ثم يتم استخدام هذه اللجان المضادة للأفراد المهندسة لتحفيز النسخة البشرية CD8 البشرية الخاصة. لا تحفز خلايا CHO غير المُصابة، وخلايا CHO التي تعبر عن عقدة Gag-MHC غير المُحفزة على السلسلة الواحدة.التعبير عن مستويات عالية من ناهض سلسلة واحدة E183- MHC المعقدة، وهو التحكم الإيجابي، وينظر إلى الحث على كفاءة جدا انترفيرون غاما الإنتاج، وشطب، مما يدل على أن يمكن التعرف على سلسلة واحدة E183 بناء من قبل TCR محددة لتفعيل وظائف T خلية تأثير. التعبير عن مستويات منخفضة من سلسلة واحدة E183- MHC مركب الحث على مستويات أقل من إنتاج الانترفيرون غاما و degranulation، والتي تعززت من وجود غير منبهة غاغ - MHC مجمع. لاحظ أن نسبة عالية جدا من الخلايا CD107a + T لوحظ حتى في استجابة لمستويات منخفضة من pMHC antigenic، وهو ما يتفق مع الدراسات السابقة.ومع ذلك، فإن وجود مجمع Gag-MHC غير المنشط يزيد من CD107a MFI. خلال هذا الإجراء، من المهم التحكم في التعبير المهون الببتيد MHC لضمان عرض ناهض على قدم المساواة مع أو بدون الببتيد غير المنشط. ومن الأهمية بمكان أن كمي ناهض الببتيد MHC التعبير باستخدام الأجسام المضادة مثل TCR في كل تجربة.نهج بديل هو استخدام ثنائيات الدهون المدعومة، أو الخرز، وتقديم كمية ثابتة من الببتيد المهضّب MHC في وجود الببتيد غير المنشط MHC. وينبغي أن يسمح هذا النظام التجريبي باختبار متواليات ببتيد غير منبهة متعددة لناهضات المشاركة. ويمكن استخدام تكنولوجيا MHC ذات السلسلة الواحدة للتحقيق في التفاعلات الجزيئية في تنشيط الخلايا T CD4 ، وكذلك للتحقيق في جزيئات MHC غير الكلاسيكية.يستخدم هذا البروتوكول الدم البشري والخلايا البشرية. اتبع جميع الاحتياطات اللازمة عند العمل مع الدم البشري للحد من خطر انتقال الأمراض المنقولة بالدم.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

تنبيغ من فيروسات تي خلية المستقبلات في الخلايا التائية ماوس

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Use of Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

استخدام مضاد للفيروسات، γ الإنزيم المرتبط الفحص Immunospot لوصف الرواية تي خلية الحواتم من فيروس الورم الحليمي البشري

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

تحريض الطعم ضد المضيف المرض و<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; مراقبة الخلايا T باستخدام نموذج MHC المطابقة الفئران

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac تعديل النظام الأساسي للخلايا ينقول T الإنسان

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

استخدام المصابيح الفلورية الهدف صالحة لتقييم T الردود الخليوي<em&gt; في الجسم الحي</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

تدفق تحليل Cytometric من القاتل الطبيعي خلية التحللي آخر في الدم الجامع البشري

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

تحليل قردي نقص المناعة CD8 للفيروسات محددة<sup&gt; +</sup&gt; خلايا تي في القرد قرود المكاك التي كتبها الببتيد-MHC-I Tetramer تلطيخ

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

عالية متعددة، والتصوير فائقة الدقة من الخلايا T باستخدام مادستورم

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

في الموقع تلوين تيترامير MHC والتحليل الكمي تحديد الموقع، ووفرة، والنمط الظاهري للخلايا التائية CD8 محددة مستضد في الأنسجة

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...