يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم المناعة بالخلايا التائيّة وتطوير لقاحات النواقل الفيروسية. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أن هناك حاجة إلى كميات صغيرة فقط من الدم ، مما يسمح بقياسات متكررة من نفس الماوس. بالإضافة إلى ذلك، يمكن الكشف عن الفيروسات وCTLs الخاصة بـ transgene من نفس العينة.
ومن خلال هذا الإجراء، ستكون ياسمين رينوفنر، وهي فنيّة، وأنيكا روسلر، طالبة غراد. وسوف يكون قياس وتحليل العينات Zoltan Banki ، بعد وثيقة. للبدء ، وكبح جماح الماوس بأمان وفقا لبروتوكول النص.
جمع 20 ميكرولترات من الدم في أنبوب المغلفة EDTA من الوريد الذيل من الماوس. عند العمل مع الطحاليات، عزل الطحال واستخدام المكبس من حقنة للضغط على الأنسجة من خلال مصفاة الخلية. بعد إجراء التحلل على كريات الدم الحمراء، عد الخلايا وضبط تركيز العينة.
إعداد وتسمية أنبوب فاكس واحد لكل عينة، ونقل 100 ميكرولترات من تعليق الجهاز، أو 20 ميكرولترات من الدم إلى الأنبوب. عند العمل مع الطحال، الطرد المركزي تعليق الجهاز لمدة خمس دقائق، والتخلص من supernatant. ثم، دوامة الأنبوب لإعادة تعليق بيليه الخلية.
وبالنسبة لكل قناة تستخدم، أعد أيضا أنبوب فاكس لعينة من التعويضات. تحضير عينة إضافية واحدة كـ عنصر تحكم غير مُطَرَد. إعداد أنبوب مع مخازن الفاكس مع رباعيات في التخفيف الأمثل، ودوامة لخلط.
بعد ذلك، إضافة 50 ميكرولترات من تخفيف رباعية إلى كل عينة، ودوامة لخلط. إضافة مخزن فاكس بدون رباعيات إلى ضوابط التعويض والعينة غير المُطَوَّنة. بعد ذلك، احتضان العينات في ظروف مظلمة في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
في حين أن العينات تحتضن، إضافة Facs العازلة إلى أنبوب. ثم إضافة الأجسام المضادة إلى المخزن المؤقت وفقا لتخفيفات المحددة في الجدول 2 من بروتوكول النص، ودوامة الحل. في انتظار على السؤال العلمي هي تركيبات علامة ، وبصرف النظر عن واحد هو موضح هنا ، يمكن استخدامها.
تأكد من تضمين الأجسام المضادة دائماً ضد CD3 و CD8 في اللوحة. لكل قناة، إعداد أنبوب مع 200 ميكرولترات من العازلة الفاكس، وإضافة ميكرولترات واحدة من تخفيف الأجسام المضادة ضد CD8 في لون كل منها، ودوامة لخلط. ثم، قم بتخزين التخفيفات المضادة كما هو محدد في بروتوكول النص.
ولغسل العينات، يضاف أحد عناصر التخزين الاحتياطي للفاكس إلى العينات وأجهزة الطرد المركزي. ثم، والتخلص من المابير، واستنزاف أي السائل المتبقية مع المناشف الورقية. عند العمل مع الدم، كن حذرا عند استنزاف السائل المتبقية.
قبل تحلل كريات الدم الحمراء ، لن تلتصق الدم بأسفل الأنبوب. بدلا من ذلك، يمكنك التعرق. بعد ذلك، إضافة 50 ميكرولترات من محلول الأجسام المضادة لكل بيليه الخلية، ودوامة بلطف.
إضافة 50 ميكرولترات من كل مزيج التعويض إلى التحكم في التعويض المقابلة، و 50 ميكرولترات من عازلة الفاكس إلى بيليه الخلية من السيطرة غير المقعوعة، ودوامة بلطف. عند العمل مع الطحال، قم بغسل العينات بعد تلطيخ الأجسام المضادة مباشرة بميليلتر إلى ملليلتر من مخزن فاكس، وطاردة مركزية لمدة خمس دقائق. ثم، والتخلص من افرا واستنزاف قبالة السائل المتبقية على المناشف الورقية.
إضافة 500 ميكرولترات من ACK العازلة لكل عينة الدم، ودوامة بلطف. ثم، احتضان العينات في الظلام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. إضافة ملليلتر واحد من مخزن الفاكسات الاحتياطية إلى العينات، والطرد المركزي.
ثم، والتخلص من افرط واستنزاف أي السوائل المتبقية مع المناشف الورقية. تحلل السليم من الكريات الحمراء هو خطوة حاسمة لتسهيل قياس الفاكس، لذلك، عندما بيليه هو الرطب بدلا، وتكرار تحلل من كريات الدم الحمراء. اغسل العينات مرة أخرى كما سبق وصفه.
ثم، والتخلص من افرا واستنزاف أي السوائل المتبقية على منشفة ورقية. قبل التثبيت، تأكد من أن الخلايا يتم إعادة اعتمادها بشكل جيد من أجل منع تشكيل كتل. إضافة 150 إلى 300 ميكرولترات من فاكس تحديد العازلة إلى كل أنبوب، ودوة لخلط.
ثم، والمضي قدما مع تدفق القياسات السيتومية في أسرع وقت ممكن. أولاً، قياس ضوابط التعويض وتصحيح أي تداخل طيفي. بعد ذلك، قم بإعداد بوابات متتابعة لتحديد الخلايا إيجابية CD3 وD8-positive.
بوابة على الخلايا الليمفاوية باستخدام منطقة التشتت الأمامية والجانبية. ثم، داخل السكان اللمفاوية، بوابة على خلايا واحدة باستخدام عرض مبعثر إلى الأمام مقابل منطقة. استخدم قنوات CD3 و CD8 لرسم الخلايا الليمفاوية أحادية الخلية.
تحديد خلايا T-إيجابية CD8، عن طريق الغاء على الخلايا CD3 إيجابية وD8-إيجابية. تأكد من تضمين الخلايا منخفضة CD8 في الغواة. يعد النشر على خلايا CD3/CD8 الإيجابية خطوة هامة في هذا البروتوكول.
كما تفعيل الخلايا غالبا ما يؤدي إلى أسفل تنظيم CD3 و / أو CD8، وينبغي أيضا CD3/CD8-المنخفضة الخلايا التي تدرج. بعد ذلك، رسم الخلايا إيجابية CD8 مقابل خلايا رباعية، الغات على الخلايا CD8 إيجابية/رباعية الإيجابية. إذا كان ذلك ممكناً، سجل 20،000 خلية في بوابة CD3 إيجابية و CD8-positive لكل عينة.
وأخيرا، حفظ القياسات كملف FCS. في هذا البروتوكول، تم الكشف عن خلايا CD8+ T الخاصة بالمستضد كمياً في عينات الدم والأنسجة. بعد الغاء الخلايا إيجابية CD3 و CD8 إيجابية، تم تحديد الخلايا رباعية الإيجابية.
تم الجمع بين اثنين من tetramers مختلفة في نفس الأنبوب للتلوين، مما يسمح للكمية المتزامنة من خصوصيات مختلفة CTL اثنين. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن اتباع استجابات الخلية T من نفس الماوس مع مرور الوقت، حيث يلزم وجود كميات صغيرة فقط من الدم لكل قياس. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تحليل الأنماط الظاهرية من CTLs المستضدات الخاصة.
أثناء محاولة هذا الإجراء, من المهم تجنب فترات حضانة طويلة, لأن هذا يمكن أن يؤدي إلى استيعاب مستقبلات الخلايا التائية. منذ اكتشاف تكنولوجيا رباعية التمرر، أصبح تلطيخ رباعيات الدم أداة أساسية لتحليل الخلايا التاتى، ومجموعة واسعة من التطبيقات، والتي تشمل تتراكم رباعيات. مستقبل مشرق لـ tetraات مشرق.
