وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (5U01CA137070) والجمعية الأميركية للسرطان (RSG - 09 - 070 - 01 - LIB) ، وهو معهد أبحاث السرطان محقق جائزة (MK) ، وجمعية القلب الأميركية قبل الدكتوراه زمالة (كم) و وزارة التربية والتعليم الاسبانية والعلوم زمالة (APG). نود أن نشكر الدكتور نيكولاس Restifo والدكتور Zhiya يو (NIH / NCI) للحصول على اقتراحات مفيدة للبروتوكول.

1. إعداد أنشئ فيروسات الرجعية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفرعي استنساخ الخلايا T - مستقبلات (TCR) الجينات ذات الاهتمام الموجه إلى فيروس (الشكل 1 ، وناقلات المثال pMSG 7 ، 5،8 pMIGII ، pMXs من Cellbiolabs). يجب أن α β TCR وسلسلة الجينات يكون على نفس ناقلات تحت سيطرة المروج نفس التعبير لضمان المساواة. إذا كان من مصلحة TCR هو الإنسان ، والمجالات الإنسانية ثابتة يجب أن يتم استبداله المجالات الماوس المستمر 9. ملاحظتنا أن TCRs كامل طول الإنسان لا تعبر عن ستابلي على الماوس الخلايا التائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد عالية الجودة DNA البلازميد باستخدام أدوات Qiagen ماكسي الإعدادية أو منتج مماثل. وينبغي تركيز البلازميد تكون في حدود 1 ميكروغرام / ميكرولتر. </li></ol> 2. ترنسفكأيشن وعزل خلايا T اليوم -1 (خلايا التغليف بلايت) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طرد البلاتين - E (بلات - E ، Cellbiolabs) خلايا التعبئة والتغليف مع فيروسات التربسين - EDTA وتحييد وسائل الإعلام مع DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي الخلايا في 1000 x ج لمدة 5 دقائق. نضح في وطاف بيليه resuspend في الخلية في وسائل الإعلام DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد عدد الخلايا والخلايا في تمييع 0.6x10 6 / مليلتر. لوحة 10 مل من تعليق خلية في بولي يسين المغلفة 10MM نسيج لوحة الثقافة وتنمو بين عشية وضحاها في الخلية الحاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2. </li></ol> اليوم 0 (ترنسفكأيشن) <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في صباح اليوم التالي ، لفحص الخلايا تحت المجهر الخفيفة. وينبغي أن تكون هذه الخلايا ما يقرب من 80 ٪ متموجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بلطف وسائل الإعلام من لوحة. غسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1X وإضافة 10 مل قبل تحسنت ، طازجة DMEM سائل الاعلام من دون البنسلين ، الستربتوميسين (القلم / بكتيريا). (ملاحظة : القلم / بكتيريا يمكن أن تتداخل مع ترنسفكأيشن) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد ترنسفكأيشن المعقدة. تحضير مزيج A و B على النحو التالي : <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> مزيج ج : DNA البلازميد </td><td> 9 ميكروغرام </td></tr><tr><td> PCL - ايكو المساعد البلازميد </td><td> 6.3 ميكروغرام </td></tr><tr><td> OptiMEM </td><td> 1.5 مل </td></tr><tr><td colspan="2"></td></tr><tr><td> مزيج B : Lipopfectime 2000 </td><td> 60 ميكرولتر </td></tr><tr><td> OptiMEM </td><td> 1.5 مل </td></tr></tbody></table> احتضان ألف وباء بشكل منفصل لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة مزيج A و B معا بلطف واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتشكيل مجمع ترنسفكأيشن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بالتنقيط ببطء الخليط (المجموع 3 مل) في الخلايا بلات - E. صخرة بلطف لوحة ذهابا وإيابا لتوزيع الخليط بالتساوي ترنسفكأيشن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان خلايا في 37 ° C CO / 5 2 ٪ في حاضنة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 6-8 ساعات ، استبدل المتوسطة مع 10 مل من المتوسط ​​DMEM جديدة (مع القلم / بكتيريا) لإنتاج الفيروسية. </li></ol> طبق معطف مع الأضداد <ol start="10" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماوس الخلايا التائية ضرورة تفعيلها قبل تنبيغ الفيروسية. هناك طرق متنوعة لتنشيط خلايا تي. هنا نستخدم لوحة ملزمة أضداد CD3e ومكافحة CD28. يعد خليط الضد من 1 ميكروغرام / مل من CD3e المضادة للطائرات و2 ميكروغرام / مل من CD28 للسامية في برنامج تلفزيوني العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستغناء عن 250 ميليلتر من مزيج الأجسام المضادة إلى كل بئر من لوحة نسيج الثقافة 24 أيضا. يمكن أن تكون مغلفة لوحة بين عشية وضحاها في 4 ساعات 2 درجة مئوية أو 37 درجة مئوية. </li></ol> إعداد وحيدة الخلية تعليق من الطحال الماوس <ol start="12" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الطحال الماوس ونقل إلى متوسطة RPMI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الطحال في مصفاة الخلية. الهريس والطحال مع المكبس حقنة في لوحة 5 سم زراعة الأنسجة. شطف الخلايا قبالة مصفاة زنزانة مع برنامج تلفزيوني العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي XG 1000 ، 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف. Resuspend بيليه في الخلية العازلة lysing ACK (2 مل في الطحال). احتضان 2-3 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إضافة RPMI المتوسطة ما يصل الى 20 مل وأجهزة الطرد المركزي 1000 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف. Resuspend الخلية بيليه في برنامج تلفزيوني العقيمة. تحديد عدد الخلايا وأجهزة الطرد المركزي XG 1000 لمدة 5 دقائق على 4 درجات مئوية. انتقل إلى عزل الخلايا التائية. </li></ol> العزلة وتنشيط خلايا تي الماوس <ol start="17" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمية الخلايا مغناطيسيا وفقا لدليل المنتج (CD8 + T - العزلة عدة خلية من Miltenyi بيوتيك). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان عمود LS (Miltenyi بيوتيك) في مagnetic الميدان. تطبيق المسمى تعليق على خلية العمود. جمع التدفق من خلال (المخصب الماوس CD8 + الخلايا التائية). يغسل ثلاث مرات مع العمود العازلة مل 3 وفقا لدليل المنتجات وتتحد مع السابقة من خلال تدفق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار الخلايا مع أضداد CD3e ومكافحة CD8a وتحليلها حسب التدفق الخلوي (الشكل 2A). لفصل نموذجي ، يمكن أن تكون معزولة ~ 8-10 ٪ من مجموع الخلايا. ~ 90 ٪ من خلايا منعزلة وCD8 + الخلايا التائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في الخلايا XG 1000 ، 5 دقائق. تجاهل طاف. Resuspend الكرية خلية في المتوسط ​​RPMI المؤتلف مع 2 - IL الإنسان (rhIL2 ، 20 نانوغرام / مل) في 1x10 6 / مليلتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فقط قبل إضافة الخلايا ، وإزالة الأجسام المضادة من حل لوحة (المعدة مسبقا في 2.11). شطف جيدا مع كل برنامج تلفزيوني في برنامج تلفزيوني العقيمة وإزالته. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من خلية إلى تعليق كل بئر. وضع لوحة في 37 ° / C 5 ٪ CO 2 في حاضنة الخلية. </li></ol> 3. (يوم ويوم 2 3) العدوى من الخلايا التائية المنشطة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 بعد أيام من إنتاج الفيروس ، ويجب على المديين المتوسط ​​في لوحة الخلية بلات - E تصبح صفراء. طاف الفيروسية لنقل أنبوب مخروطي 15 مل. إضافة 10 مل من المتوسط ​​DMEM جديدة لوحة لإنتاج مزيد من الفيروسات (اختياري). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طاف الفيروس في جهاز الطرد المركزي 1000 x ج لمدة 5 دقائق لإزالة الخلايا الحطام. طاف بعناية نقل الفيروس إلى أنبوب جديد. ترك بعض السائل في الجزء السفلي من الأنبوب وعدم تعكير صفو حطام الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع تنشيط خلايا تي من لوحة إلى أنبوب مخروطي 50 مل. تحديد عدد الخلايا. انقاذ بعض الخلايا في أنبوب منفصل يمكن استخدامها لمكافحة (UN - transduced) سلبية. أجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 5 دقائق وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الكرية خلية في طاف الفيروس في الخلايا 6 10 لكل 1 مل مع rhIL2 نانوغرام / مل 20 و 10 ميكروغرام / مل سلفات بروتامين. إضافة 1 مل من خلية إلى تعليق كل بئر من لوحة البئر 24. Resuspend الخلايا في الأنبوب التحكم في المتوسط ​​RPMI في كثافة الخلية نفسها مع نفس الكمية من سلفات بروتامين rhIL2 و. إضافة إلى لوحة الخلايا نفسها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التفاف لوحة مع فيلم من البلاستيك. أجهزة الطرد المركزي في 90 دقيقة XG 2000 ، في 32 درجة مئوية مع عدم وجود الفرامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الطرد المركزي ، وإزالة الفيلم من البلاستيك. إضافة 1 مل من المتوسط ​​RPMI الطازجة مع 20 نانوغرام / مل rhIL2 إلى كل بئر. وضع لوحة العودة إلى الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن (اختياري) يمكن تحقيق المستوى العالي من التعبير عن طريق جمع TCR طاف الفيروس والعدوى تكرار الإجراء في اليوم 3. </li></ol> 4. توسيع الخلايا وتقييم كفاءة تنبيغ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فحص خلايا تي transduced اليومية. انقسام الخلايا في نسب 01:03 عند الضرورة في rhIL2 RPMI المتوسطة. لا تدع اكتسى الخلايا (المتوسط ​​يتحول إلى اللون الأصفر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 6 أو 7 أيام ، وصمة عار على الأجسام المضادة والخلايا مع MHC tetramer محددة لTCR لتقييم التعبير عن TCR على سطح الخلايا التائية. استخدام الامم المتحدة transduced الخلايا التائية كما التحكم (الشكل 2C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وtransduced الخلايا التائية مستعدون لمزيد من التطبيقات المصب. </li></ol> 5. ممثل النتائج غالبا ما يكون من المفيد لتنقية تي خلية فرعية قبل تنبيغ الرغم من أنه يمكن splenocytes transduced دون تنقية. ويمكن الحصول على نقاوة عالية تي خلية فرعية باستخدام الخرز المغناطيسي التجارية (الشكل 2A). لتقييم مستوى التعبير عن TCRs على خلايا - T ، ويمكن استخدام الأجسام المضادة المحددة لألفا TCR أو سلاسل بيتا. عادة 30 ٪ إلى 80 ٪ من الخلايا يمكن أن تعبر عن transduced TCR (الشكل 2B) اعتمادا على جينات الفيروس TCR والتتر. ويمكن أيضا MHC tetramer محددة لTCR يمكن استخدامها لمزيد من التحقق من التعبير الوظيفي للTCRs (الشكل 2C). <img src="/files/ftp_upload/2307/2307fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. مثال على الجين تي مستقبلات الخلية المستنسخة بناء الفرعي في ناقلات فيروسات. ترتبط كامل طول ألفا وبيتا سلسلة الجينات بواسطة رابط 2A الببتيد الذاتي شطورة 8. <img src="/files/ftp_upload/2307/2307fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. مثال ناجح والعزلة تنبيغ من الماوس الخلايا التائية (أ) تم عزل الخلايا التائية CD8 من splenocytes CD8a باستخدام الخلايا T + كيت عزل (Miltenyi بيوتيك) وملطخة أضداد CD3e ومكافحة CD8a. عزل الخلايا التائية CD8 كانت transduced مع R6C12 TCR محددة لgp100 الإنسان : 209 -217 4 الببتيد وملطخة المضادة للجسم البشري Vbeta 8 (ب) و HLA - A2kb gp100 tetramer (ج).

<ol>
	<li>Krogsgaard, M., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+T+cells+'see'+antigen.">How T cells 'see' antigen.</a> Nat. Immunol. 6, 239-245 (2005).</li><li>Berg, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen/MHC-specific+T+cells+are+preferentially+exported+from+the+thymus+in+the+presence+of+their+MHC+ligand.">Antigen/MHC-specific T cells are preferentially exported from the thymus in the presence of their MHC ligand.</a> Cell. 58, 1035-1046 (1989).</li><li>Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+receptor+antagonist+peptides+induce+positive+selection.">T cell receptor antagonist peptides induce positive selection.</a> Cell. 76, 17-27 (1994).</li><li>Yu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poor+immunogenicity+of+a+self/tumor+antigen+derives+from+peptide-MHC-I+instability+and+is+independent+of+tolerance.">Poor immunogenicity of a self/tumor antigen derives from peptide-MHC-I instability and is independent of tolerance.</a> J. Clin. Invest. 114, 551-559 (2004).</li><li>Holst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+T-cell+receptor+retrogenic+mice.">Generation of T-cell receptor retrogenic mice.</a> Nat Protoc. 1, 406-417 (2006).</li><li>Morgan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+regression+in+patients+after+transfer+of+genetically+engineered+lymphocytes.">Cancer regression in patients after transfer of genetically engineered lymphocytes.</a> Science. 314, 126-129 (2006).</li><li>Hawley, R. G., Lieu, F. H., Fong, A. Z., Hawley, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+retroviral+vectors+for+potential+use+in+gene+therapy.">Versatile retroviral vectors for potential use in gene therapy.</a> Gene Ther. 1, 136-138 (1994).</li><li>Szymczak, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+multi-gene+deficiency+in+vivo+using+a+single+'self-cleaving'+2A+peptide-based+retroviral+vector.">Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single 'self-cleaving' 2A peptide-based retroviral vector.</a> Nat. Biotechnol. 22, 589-594 (2004).</li><li>Cohen, C. J., Zhao, Y., Zheng, Z., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+antitumor+activity+of+murine-human+hybrid+T-cell+receptor+(TCR)+in+human+lymphocytes+is+associated+with+improved+pairing+and+TCR/CD3+stability.">Enhanced antitumor activity of murine-human hybrid T-cell receptor (TCR) in human lymphocytes is associated with improved pairing and TCR/CD3 stability.</a> Cancer Res. 66, 8878-8886 (2006).</li><li>Letourneur, F., Malissen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+a+T+cell+hybridoma+variant+deprived+of+functional+T+cell+receptor+alpha+and+beta+chain+transcripts+reveals+a+nonfunctional+alpha-mRNA+of+BW5147+origin.">Derivation of a T cell hybridoma variant deprived of functional T cell receptor alpha and beta chain transcripts reveals a nonfunctional alpha-mRNA of BW5147 origin.</a> Eur. J. Immunol. 19, 2269-2274 (1989).</li><li>Bendle, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lethal+graft-versus-host+disease+in+mouse+models+of+T+cell+receptor+gene+therapy.">Lethal graft-versus-host disease in mouse models of T cell receptor gene therapy.</a> Nat. Med. 16, 565-570 (2010).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

عدة خطوات حاسمة من أجل تحقيق أفضل النتائج. يجب أن تبقى بلات - E خط التعبئة والتغليف في الخلية حالة صحية جيدة. إذا لزم الأمر ، يمكن passaged الخلايا بضع مرات في المتوسط ​​مع DMEM 1 ميكروغرام / مل بوروميسين ، ميكروغرام / 10 مل blasticidin لمنع فقدان فيروسات هيكل بروتين تعبير. يوم ترنسفكأيشن ، ينبغي أن تكون الخلايا ~ متموجة 80 ٪. قد خلايا قليلة جدا أو كثيرة جدا تقلل من عيار الفيروس. يمكن التحقق من نوعية الفيروس عن طريق اختبار على خطوط الخلية التي يمكن transduced بسهولة. منذ TCRs يتطلب أعرب CD3 المجمعات على سطح الخلية ، ونحن نستخدم بشكل روتيني 58α-/β- خلايا ورم هجين 10 (خط الخلية التي لا تعبر عن الذاتية أو سلسلة TCR α β ، لكن التعبير عن CD3 المعقدة). نحصل على ما يقرب من 100 ٪ من الكفاءة تنبيغ الخلايا خلايا ورم هجين عندما transducing مع 1 مل من طاف الفيروس. وأخيرا ، فإن الخلايا التائية ضرورة تفعيلها وبسبب تكاثر الفيروس الارتجاعي يمكن أن تصيب فقط تقسيم بنشاط الخلايا. قدم هنا طريقة لإنتاج محددة مستضد الخلايا التائية عدة قيود. الأول ، أنه من الصعب أن تصل إلى 100 ٪ كفاءة تنبيغ للماوس الأولية (خلايا تي). جزء من خلايا لا تعبر عن TCR المصالح. ثانيا ، transduced TCR α β وسلاسل يمكن mispair TCRs الذاتية مع 9 ، التي قد تقلل من مستوى التعبير TCR المصالح. بالإضافة إلى ذلك ، قد يتسبب TCRs mispaired المناعة الذاتية في الجسم الحي 11. أخيرا ، ليس هناك سوى فترة زمنية محدودة transduced الخلايا التائية يمكن استخدامها. بعد حوالي أسبوع واحد ، والخضوع لموت الخلايا المبرمج الخلايا ما لم يتم إعادة حفز. ومع ذلك ، قد تصبح استنفاد الخلايا وفقدان الوظائف المتكررة مع إعادة التحفيز.

وسائل الإعلام : DMEM المتوسطة (+10 ٪ DMEM الحرارة المعطل FBS القلم + / + L - بكتيريا حمض الغلوتاميك الصوديوم + + البيروفات غير الأحماض الأمينية الأساسية). DMEM وسيط وبدون القلم / بكتيريا (نفس DMEM المتوسطة ، ولكن دون إضافة القلم / بكتيريا). RPMI المتوسطة (+10 ٪ RPMI الحرارة المعطل FBS + + L - حمض الغلوتاميك غير الضروري من الأحماض الأمينية + + β - Mercaphoethanol القلم / بكتيريا البيروفات الصوديوم +).

retroviral transduction of t-cell receptors in mouse t-cells

مستقبلات الخلية T - (TCRs) تلعب دورا مركزيا في النظام المناعي. يمكن TCRs على سطوح الخلايا T - تعترف تحديدا مستضدات الببتيد التي قدمها مستضد تقديم الخلايا (ناقلات الجنود المدرعة) 1. هذا الاعتراف يؤدي الى تنشيط خلايا تي وسلسلة من النتائج الفنية (مثل إنتاج السيتوكينات ، وقتل الخلايا المستهدفة). فهم دور وظيفي للTCRs أمر بالغ الأهمية لتسخير قوة جهاز المناعة لعلاج العديد من الأمراض المتصلة المناعة (سرطان على سبيل المثال أو المناعة الذاتية). أنه لأمر مريح للدراسة في نماذج TCRs الماوس ، والذي يمكن أن يتحقق بعدة طرق. صنع نماذج الماوس المعدلة وراثيا TCR مكلفة وتستغرق وقتا طويلا ، وحاليا لا يوجد سوى عدد محدود منهم المتاحة 2-4. بدلا من ذلك ، يمكن أن تتولد الفئران مع مستضد محددة خلايا تي من قبل نخاع العظم وهم. هذا الأسلوب يستغرق عدة أسابيع أيضا ، ويتطلب خبرة 5. تنبيغ من فيروسات TCRs في المختبر في الماوس تنشيط خلايا تي هو وسيلة سريعة وسهلة نسبيا للحصول على خلايا تي من التحديد الببتيد MHC - المرجوة. يمكن أن تتولد مستضد محددة (خلايا تي) في أسبوع واحد وتستخدم في أي تطبيقات المصب. دراسة transduced الخلايا التائية كما التطبيق المباشر لالمناعي البشري ، ونقل بالتبني من الخلايا البشرية transduced - T مع TCRs محددة مستضد هو استراتيجية الناشئة لعلاج السرطان 6. هنا نقدم بروتوكول لتنبيغ retrovirally TCRs في المختبر الى تنشيط خلايا تي الماوس. ويمكن استخدام كل من جينات الإنسان والفأر TCR. يتم إنشاء الفيروسات القهقرية تحمل جينات محددة TCR واستخدامها لتصيب الماوس تنشيط خلايا تي مع أضداد CD3 ومكافحة CD28. بعد التوسع في المختبر ، ويتم تحليل transduced الخلايا التائية التي التدفق الخلوي.

Watch this Scientific Journal Video about Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells at JoVE.com

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

نقدم بروتوكول لانتاج المستضد محددة الماوس T - تنبيغ الخلايا باستخدام فيروسات

تنبيغ من فيروسات تي خلية المستقبلات في الخلايا التائية ماوس

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

retroviral-transduction-of-t-cell-receptors-in-mouse-t-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

34.5K Views.  New York University School of Medicine. نقدم بروتوكول لانتاج المستضد محددة الماوس T - تنبيغ الخلايا باستخدام فيروسات

Video: Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

piggyBac تعديل النظام الأساسي للخلايا ينقول T الإنسان

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 T cells in vitro with TCR- and co-stimulation in the presence of TGF&beta; and IL-2. This bears enormous potential for future therapies, however, the molecules and signaling pathways that control differentiation are largely unknown.
Primary T cells can be manipulated through ectopic gene expression, but common methods fail to target the most important naive state of the T cell prior to primary antigen recognition. Here, we provide a protocol to express ectopic genes in naive CD4 T cells in vitro before inducing Treg differentiation. It applies transduction with the replication-deficient adenovirus and explains its generation and production. The adenovirus can take up large inserts (up to 7 kb) and can be equipped with promoters to achieve high and transient overexpression in T cells. It effectively transduces naive mouse T cells if they express a transgenic Coxsackie adenovirus receptor (CAR). Importantly, after infection the T cells remain naive (CD44low, CD62Lhigh) and resting (CD25-, CD69-) and can be activated and differentiated into Tregs similar to non-infected cells. Thus, this method enables manipulation of CD4 T cell differentiation from its very beginning. It ensures that ectopic gene expression is already in place when early signaling events of the initial TCR stimulation induces cellular changes that eventually lead into Treg differentiation.

Adenoviral gene transfer into naive CD4 T cells with transgenic expression of the Coxsackie adenovirus receptor enables the molecular analysis of regulatory T cell differentiation in vitro.

تنبيغ الفيروسة الغدانية من CD4 الخلايا التائية ساذج لدراسة التمايز Treg

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

اشتقاق خلايا T<em&gt; في المختبر</em&gt; من الفأر الجنينية الخلايا الجذعية

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&amp;#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

الماوس السذاجة CD4<sup&gt; +</sup&gt; عزل T خلية و<em&gt; في المختبر</em&gt; التمايز إلى T مجموعات فرعية خلية

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCR&#945; and TCR&#946; chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

فيروسات تنبيغ من خلايا نخاع العظم السلف لتوليد خلايا T مستقبلات Retrogenic الفئران

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

توليد<em&gt; دي نوفو</em&gt; محددة مستضد تي الإنسان مستقبلات الخلية من قبل فيروسات تنبيغ من مركزية Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

فيروسات تنبيغ من الخلايا التائية المساعدة كنهج الوراثي لدراسة آليات السيطرة على التمايز وظيفة

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the key steps to investigate TRMs. There are slight variations in lymphocyte isolation protocols for different organs. Kidney is an essential non-lymphoid organ with numerous immune cell infiltration especially after pathogen exposure or autoimmune activation. In recent years, multiple labs including our own have started characterizing kidney resident CD8+ T cells in various physiological and pathological settings in both mouse and human. Due to the abundance of T lymphocytes, kidney represents an attractive model organ to study TRMs in non-mucosal or non-barrier tissues. Here, we will describe a protocol commonly used in TRM-focused labs to isolate CD8+ T cells from mouse kidneys following systemic viral infection. Briefly, using an acute lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) infection model in C57BL/6 mice, we demonstrate intravascular CD8+ T cell labeling, enzymatic digestion, and density gradient centrifugation to isolate and enrich lymphocytes from mouse kidneys to make samples ready for the subsequent flow cytometry analysis.

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Following viral infection, kidney harbors a relatively large number of CD8+ T cells and offers an opportunity to study non-mucosal TRM cells. Here, we describe a protocol to isolate mouse kidney lymphocytes for flow cytometry analysis.

عزل الماوس الكلى المقيم CD8+ الخلايا T لتحليل تدفق cytometry

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...

Purification and Expansion of Mouse Invariant Natural Killer T Cells for in vitro and in vivo Studies

Invariant Natural Killer T (iNKT) cells are innate-like T Lymphocytes expressing a conserved semi-invariant T cell receptor (TCR) specific for self or microbial lipid antigens presented by the non-polymorphic MHC class I-related molecule CD1d. Preclinical and clinical studies support a role for iNKT cells in cancer, autoimmunity and infectious diseases. iNKT cells are very conserved throughout species and their investigation has been facilitated by mouse models, including CD1d-deficient or iNKT-deficient mice, and the possibility to unequivocally detect them in mice and men with CD1d tetramers or mAbs specific for the semi-invariant TCR. However, iNKT cells are rare and they need to be expanded to reach manageable numbers for any study. Because the generation of primary mouse iNKT cell line in vitro has proven difficult, we have set up a robust protocol to purify and expand splenic iNKT cells from the iV&#945;14-J&#945;18 transgenic mice (iV&#945;14Tg), in which iNKT cells are 30 times more frequent. We show here that primary splenic iV&#945;14Tg iNKT cells can be enriched through an immunomagnetic separation process, yielding about 95-98% pure iNKT cells. The purified iNKT cells are stimulated by anti-CD3/CD28 beads plus IL-2 and IL-7, resulting in 30-fold expansion by day +14 of the culture with 85-99% purity. The expanded iNKT cells can be easily genetically manipulated, providing an invaluable tool to dissect mechanisms of activation and function in vitro and, more importantly, also upon adoptive transfer in vivo.

We describe a rapid and robust protocol to enrich invariant natural killer T (iNKT) cells from mouse spleen and expand them in vitro to suitable numbers for in vitro and in vivo studies.

تنقية وتوسيع الخلايا T القاتل الطبيعي الثابت الماوس في المختبر وفي دراسات في الجسم الحي

Invariant Natural Killer T (iNKT) cells are innate-like T Lymphocytes expressing a conserved semi-invariant T cell receptor (TCR) specific for self or ...

Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry

Calcium influx in response to T-cell receptor stimulation is a common measure of T-cell signaling. Several calcium indicator dyes have been developed to assess calcium signaling by band-pass flow cytometry. This protocol is designed to measure calcium responses in primary murine T-cells using full spectrum flow cytometry. Total splenocytes are labeled with the ratiometric calcium indicator dye Indo-1, along with a panel of fluorochrome-conjugated antibodies to cell surface molecules. Leveraging the capabilities of full spectrum flow cytometry provides a platform for utilizing a wide array of cell surface stains in combination with Indo-1. Cells are then analyzed in real-time at 37 &#176;C before and after the addition of an anti-CD3 antibody to stimulate the T-cell receptor. After unmixing the spectral signals, the ratio of calcium-bound to calcium-free Indo-1 is calculated and can be visualized over time for each gated population of splenocytes. This technique can allow for the simultaneous analysis of calcium responses in multiple cell populations.

Calcium influx, a measure of T-cell signaling, is an effective way to analyze responses to T-cell receptor stimulation. This protocol for multiplexing Indo-1 with panels of antibodies directed at cell surface molecules takes advantage of the highly flexible capabilities of full spectrum flow cytometry.

تحليل تدفق الكالسيوم الناجم عن مستقبلات الخلايا التائية في الخلايا التائية الأولية عن طريق قياس التدفق الخلوي الكامل الطيف

Calcium influx in response to T-cell receptor stimulation is a common measure of T-cell signaling. Several calcium indicator dyes have been developed to ...