Name: use of single chain mhc technology to investigate co-agonism in human cd8+ t cell activation
Uploaded: 2019-02-28T15:00:00
Duration: 12 min 9 s
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इस शोध को सिंगापुर के स्वास्थ्य मंत्रालय द्वारा अपने cbrg/0064/2014 के तहत n.r.j.g. को अपने R571-002-012-592 से स्पंद आयाम मॉडुलन तक, नेशनल रिसर्च फाउंडेशन अन्वेटरशिप R571-000-272-281 के तहत पी. ए. एम के द्वारा समर्थित किया गया । ., और एक सिंगापुर translational अनुसंधान द्वारा (स्टार) अन्वेषक पुरस्कार (nmrc/स्टार/013/2012) अटल बिहारी के लिए हम विशेषज्ञ सेल छंटाई के लिए NUS इम्यूनोलॉजी कार्यक्रम प्रवाह कोर सुविधा से डॉ पॉल hutchinson और श्री teo guo के लिए आभारी हैं । हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए एलिय्याह चेन के लिए आभारी हैं ।

लेखकों को कोई प्रतिस्पर्धा हितों की घोषणा ।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल मानव सीडी 8 + T सेल सक्रियण के दौरान आणविक बातचीत की जांच के लिए एक मजबूत उपकरण प्रदान करता है । मानव टी सेल सक्रियण के दौरान सह-एगोनिज्म की जांच के लिए एक महत्वपूर्ण कदम एगोनिस्ट pmhc सेल सतह अभिव्यक्ति पर नियंत्रण के साथ या सह-एगोनिस्ट pmhc अभिव्यक्ति के बिना apcs पर बराबर एगोनिस्ट pmhc प्रस्तुति सुनिश्चित करने के लिए है । हमारे प्रयोगात्मक प्रणाली में, यह एक एकल सेल क्लोन का उपयोग करके हासिल की कम मात्रा में एगोनिस्ट pmhc, एक सह-एगोनिस्ट pmhc का निर्माण और एगोनिस्ट pmhc का उपयोग कर के साथ supertransfection द्वारा पीछा किया जाता है tcr-एंटीबॉडी की तरह10, ३२. के रूप में एगोनिस्ट sc pmhc अभिव्यक्ति समय के साथ बदल सकते हैं, यह tcr की तरह एंटीबॉडी का उपयोग कर प्रत्येक प्रयोग में इस्तेमाल किया apcs पर एगोनिस्ट pmhc सतह अभिव्यक्ति यों तो करने के लिए महत्वपूर्ण है. यदि कोई विशिष्ट tcr-एंटीबॉडी की तरह उपलब्ध है, एगोनिस्ट scmhc-मैं फ्लोरोसेंट प्रोटीन फ्यूजन के रूप में व्यक्त किया जा सकता है, और उसके सेल सतह अभिव्यक्ति तो कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के रूप में एक संवेदनशील माइक्रोस्कोपी विधि, का उपयोग कर मात्रा निर्धारित जा सकता है ३५ , ३६. इसके अलावा, सह-agonist pmhc की सेल सतह अभिव्यक्ति समय के साथ कम हो जाती है, के कारण methylation निर्भर और-स्वतंत्र cmv प्रवर्तक३७के मुंह बंद, और निगरानी की जानी चाहिए एंटीबॉडी धुंधला और प्रवाह cytometry विश्लेषण का उपयोग कर, के साथ दोहराया facs-छंटाई जब जरूरत है । हम अनुसूचित जाति pmhc अभिव्यक्ति के अपेक्षाकृत सीमित नुकसान के साथ 5 हफ्तों तक के लिए सुसंस्कृत चो कोशिकाओं है । हम अत्यधिक सुझा है चो कोशिकाओं को जल्दी ही चयन के बाद ठंड ज्ञात अनुसूचित जाति mhc अभिव्यक्ति के साथ कोशिकाओं का एक विश्वसनीय शेयर सुनिश्चित करने के लिए/
प्रस्तुत प्रोटोकॉल के कई कदम संशोधित किया जा सकता है, उपकरणों की उपलब्धता पर निर्भर करता है, या विशिष्ट अनुसंधान उद्देश्य पर निर्भर करता है । उदाहरण के लिए, pbmc प्रसार क्षमता हिचकते किया जा सकता (3.2.1 कदम) वैकल्पिक तरीकों कि एक गामा की आवश्यकता नहीं है का उपयोग कर (या एक्स-) irradiator, ऐसे मीतोमयसीं सी३८के साथ उपचार के रूप में. एक गैर enzymatic सेल वियोजन बफ़र्स धातु chelators३९ युक्त के बजाय कदम में scraping सेल 3.3.1 का इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, antigen पेश प्रणाली इसे और अधिक मानव ctl क्लोन अलग tcrs व्यक्त करने के लिए उपयुक्त बनाने के लिए संशोधित किया जा सकता है । चो कोशिकाओं हंसटर mhc वर्ग मैं अणुओं एक्सप्रेस, और यद्यपि इन ctl लाइन के लिए अप्रासंगिक है यहां का अध्ययन (चित्रा 2a और चित्रा 3a, हम कोई टी सेल प्रतिक्रियाओं को मनाया चो कोशिकाओं अनट्रांसफेक्टेड), वहां एक संभावना है कि अंय मानव tcrs कुछ xenoreactivity दिखा सकता है । उस मामले में, हैम्स्टर mhc वर्ग मैं अभिव्यक्ति हंसटर β2 दस्तक द्वारा कम किया जा सकता है-microglubulin या crispr का उपयोग कर नल/Cas9; या एक मानव apc लाइन crispr के बाद इस्तेमाल किया जा सकता/Cas9-mediated β2-microglubulin या ठोकर बाहर दस्तक ।
प्रायोगिक प्रणाली यहां प्रस्तुत tcr और mhc पूर्व परिभाषित पेप्टाइड्स पेश अणुओं के साथ सीडी 8 बातचीत के सटीक नियंत्रण की अनुमति देता है । उदाहरण के लिए, हम पहले से पता चला है कि परिवर्तन सीडी 8 बाध्यकारी coagonist pmhc को समाप्त करने के लिए coagonist-मध्यस्थता सक्रियण मुरीन और मानव सीडी 8 + T कोशिकाओं9,10में वृद्धि, जबकि tcr खत्म करने सह agonist pmhc के साथ इंटरेक्शन coagonist-मध्यस्थता सक्रियकरण10वृद्धि पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा । हालांकि, एकल श्रृंखला mhc constructs का उपयोग कई सीमाएं हैं । उदाहरण के लिए, यह समय और श्रम-उपभोक्ता इस प्रयोगात्मक प्रणाली का उपयोग कर कई सह-agonist पेप्टाइड दृश्यों का परीक्षण करने के लिए है, के रूप में यह विभिन्न पेप्टाइड्स के साथ अनुसूचित जाति mhc एंकोडिंग कई plasmids की पीढ़ी शामिल है, और बाद में transfections और सेल छँटाई. पहले, हम मूरीन नल की कमी सेल लाइन RMA-एस माउस टी सेल सक्रियकरण8,9में कई सह agonist पेप्टाइड्स परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया है, लेकिन इस दृष्टिकोण नल की कमी मानव T2 सेल लाइन10के साथ सफल नहीं था, सबसे अधिक संभावना नल की प्रस्तुति के कारण-स्वतंत्र पेप्टाइड्स४१. हमारे प्रयोगात्मक प्रणाली की एक और सीमा है कि सह-agonist pmhc टी सेल सक्रियण ट्रिगर करने के लिए आवश्यक की महत्वपूर्ण राशि का निर्धारण करने के प्रयोजन के लिए सह-agonist pmhc अणुओं की राशि में फेरबदल के लिए एक तेजी से विधि प्रदान नहीं करता है. इसके अलावा, टेट्रासाइक्लिन-प्रेरित प्रणाली का इस्तेमाल टेट्रासाइक्लिन एकाग्रता को बदलकर एकल सेल स्तर पर एगोनिस्ट pmhc मात्रा के अनुमापन की अनुमति नहीं देता है, क्योंकि अलग टेट्रासाइक्लिन एकाग्रता एचएलए-ए2 सकारात्मक कोशिकाओं के अनुपात को बदल देती है, सेल के आधार पर एचएलए-A2 के स्तर के बजाय । एक वैकल्पिक दृष्टिकोण है कि हम वर्तमान में जांच कर रहे है समर्थित लिपिड bilayers४२का उपयोग करने के लिए है, पहले से मुरीन सीडी4 + टी सेल सक्रियण के दौरान सह-agonism की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया या मोती एगोनिस्ट pmhc की निश्चित राशि पेश सह-agonist pmhc की बदलती मात्रा की उपस्थिति । जब यूवी-क्लीवेबल पेप्टाइड प्रौद्योगिकी के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया4,४३, इन वैकल्पिक प्रयोगात्मक प्रणालियों के साथ ही सह agonist pmhc के विभिन्न मात्रा में कई सह-agonist पेप्टाइड दृश्यों के तेजी से परीक्षण की अनुमति चाहिए .
अनुसूचित जाति mhc प्रौद्योगिकी भी मानव या murine सीडी 4 टी कोशिकाओं में सह-agonism की जांच करने के लिए लागू किया जा सकता है, के रूप में एकल श्रृंखला mhc वर्ग द्वितीय पेश अणुओं पूर्व निर्धारित पेप्टाइड्स सफलतापूर्वक स्तनधारी कोशिका सतहों४४पर व्यक्त किया गया है. इसके अलावा, एचएलए-ई जैसे गैर-शास्त्रीय एमएचसी अणुओं की जांच के लिए एससी एमएचसी प्रौद्योगिकी का उपयोग बढ़ाया जा सकता है । Sc hla-E से पहले वर्णित किया गया है, और इसकी अभिव्यक्ति मानव T सेल सक्रियण४५को बाधित करने के लिए दिखाया गया है । ब्याज की एक और गैर शास्त्रीय mhc अणु CD1 है, जो पेप्टाइड्स४६के बजाय लिपिड प्रस्तुत करता है । Sc ने CD1 हैवी चेन और β2-माइक्रोग्लोब्युलइन के साथ मिलकर सेल की सतह पर व्यक्त किया है और प्रासंगिक लिपिड लिगन्स४७को बाइंड करने के लिए दिखाया गया है । एकल श्रृंखला mhc प्रौद्योगिकी टी और nk सेल सक्रियण के दौरान आणविक बातचीत की जांच के लिए एक अनुसंधान उपकरण के रूप में महान क्षमता है.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aim-V (serum free media)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12055091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blasticidin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm (fixation/permealibisation kit)</td>
			<td>BD</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH3007103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>geneticin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10131035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GolgiPlug (Brefeldin A)</td>
			<td>BD</td>
			<td>555029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hygromycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10687010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (low serum media)</td>
			<td>Bibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 X PBS</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>PB0344 &#8211; 1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>408727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant human IL2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>202-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant human IL7</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>207-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant human IL15</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>247-ILB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetracycline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-REx CHO cell line</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R71807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 x Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BD</td>
			<td>347347</td>
			<td>Clone SK7, RRID:AB_400287</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8&#945;</td>
			<td>BD</td>
			<td>563795</td>
			<td>Clone RPA-T8, RRID:AB_2722501</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD107a</td>
			<td>BD</td>
			<td>566261</td>
			<td>Clone H4A3, RRID:AB_2739639</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-A2</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-9876-41</td>
			<td>Clone BB7.2, RRID:AB_11151522</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-&#947;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-7319-41</td>
			<td>Clone 4S.B3, RRID:AB_1311250</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of single chain mhc technology to investigate co-agonism in human cd8+ t cell activation

गैर-उत्तेजक स्व पेप्टाइड mhc (pmhc) परिसरों टी सेल सक्रियण और effector कार्यों को प्रेरित नहीं करते, लेकिन सह-agonism कहा एक प्रक्रिया के माध्यम से, एगोनिस्ट pmhc के लिए टी सेल प्रतिक्रियाओं को बढ़ा सकते हैं. इस प्रोटोकॉल एक प्रयोगात्मक प्रणाली मानव सीडी 8 + टी सेल सक्रियण के दौरान मानव mhc वर्ग मैं एक xenogeneic सेल लाइन में एकल polypeptides (एकल श्रृंखला mhc) के रूप में पूर्व निर्धारित पेप्टाइड्स पेश अणुओं व्यक्त करके सह-agonism की जांच करने के लिए वर्णन करता है । हमने एकल श्रृंखला mhcs को शर्तों के तहत व्यक्त किया जहां एगोनिस्ट सिंगल चेन पी-एमएचसी परिसरों और गैर-उत्तेजक एकल श्रृंखला पी-एमएचसी परिसरों के उच्च स्तर के निम्न स्तर व्यक्त किए गए थे । इस प्रायोगिक प्रणाली का उपयोग हमें गैर-उत्तेजक pmhc की उपस्थिति या अनुपस्थिति में एगोनिस्ट pmhc के लिए सीडी 8 + T सेल प्रतिक्रियाओं की तुलना करने की अनुमति दी । प्रोटोकॉल एकल श्रृंखला mhc constructs, स्थिर सेल लाइनों की पीढ़ी, हेपेटाइटिस बी वायरस-विशिष्ट मानव सीडी 8 + टी कोशिकाओं और टी सेल सक्रियण प्रयोगों के साथ सेल लाइन ट्रांसफक्शन का वर्णन एक साथ साइटोकाइन उत्पादन बढ़ाता और विकणीकरण. प्रस्तुत तरीके ज्ञात पेप्टाइड mhc विशिष्टता के साथ मानव टी सेल सिस्टम में सीडी 8 + टी सेल सक्रियण के विभिन्न पहलुओं पर अनुसंधान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Use of Single Chain MHC Technology to Investigate Co-agonism in Human CD8+ T Cell Activation

मानव सीडी 8 + T सेल सक्रियण में सह-एगोनिज्म की जांच करने के लिए एकल श्रृंखला एमएचसी प्रौद्योगिकी का उपयोग

यह प्रोटोकॉल मानव सीडी 8 + t सेल सक्रियण में आणविक बातचीत की जांच करने के लिए एकल श्रृंखला mhc वर्ग I परिसरों के उपयोग का वर्णन करता है: इंजीनियर antigen की पीढ़ी के एकल श्रृंखला व्यक्त कोशिकाओं का निर्माण, मानव सीडी 8 + टी सेल क्लोन की संस्कृति और टी सेल सक्रियण प्रयोगों ।

Non-stimulatory self peptide MHC (pMHC) complexes do not induce T cell activation and effector functions, but can enhance T cell responses to agonist ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

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