मानव सीडी 8 + T सेल सक्रियण में सह-एगोनिज्म की जांच करने के लिए एकल श्रृंखला एमएचसी प्रौद्योगिकी का उपयोग

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February 28th, 2019

DOI :

10.3791/59126-v

February 28th, 2019

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Xiang Zhao¹, Maryam Hamidinia¹, Joanna Ai Ling Choo¹, Chien Tei Too^1,2, Zi Zong Ho³, Ee Chee Ren⁴, Antonio Bertoletti³, Paul A. MacAry^1,2,5, Keith G. Gould⁶, Joanna Brzostek¹, Nicholas R.J. Gascoigne^1,2,5

¹Department of Microbiology and Immunology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, ²Immunology Programme, Life Sciences Institute, National University of Singapore, ³Emerging Infectious Diseases Program, Duke-NUS Graduate Medical School, ⁴Singapore Immunology Network, A*STAR, ⁵NUS Graduate School for Integrative Sciences and Engineering (NGS), National University of Singapore, ⁶Department of Immunology, Wright-Fleming Institute, Imperial College London

Chapters

Transcript

नॉनस्टिमुलेटरी पेप्टाइड एमएचसी कॉम्प्लेक्स टी सेल्स को एक्टिवेट नहीं करते हैं लेकिन एगॉनिस्ट पेप्टाइड एमएचसी के लिए टी सेल प्रतिक्रियाओं को बढ़ा सकते हैं । यह प्रोटोकॉल मानव सीडी 8 टी सेल सक्रियण के दौरान सह-पीड़ा की जांच करने के लिए एक प्रयोगात्मक प्रणाली का वर्णन करता है। हम MHC अणुओं को सहसंयोजक-संबद्ध भारी श्रृंखला, बीटा-2-माइक्रोग्लोबुलिन और पेप्टाइड के साथ एकल-जंजीर वाले परिसरों के रूप में व्यक्त करते हैं ।

यह पूर्व निर्धारित पेप्टाइड्स पेश MHC अणुओं में उत्परिवर्तन शुरू करने की अनुमति देता है । यह प्रोटोकॉल मानव सीटीएन क्लोन का उपयोग करता है, जो हेपेटाइटिस बी वायरस के एपिटोप के लिए एक विशिष्ट है। हेपेटाइटिस के खिलाफ टी सेल प्रतिक्रियाओं के दौरान सह-पीड़ा के तंत्र को समझना इस वायरल संक्रमण के खिलाफ इम्यूनोट्रोपिक्स के विकास में योगदान दे सकता है।

प्रस्तुत तरीकों ज्ञात पेप्टाइड MHC विशिष्टता के साथ मानव टी सेल सिस्टम में टी सेल सक्रियण के अनुसंधान और अन्य बुनियादी पहलुओं में इस्तेमाल किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल एकल श्रृंखला मानव MHC वर्ग मैं अणुओं का उपयोग करता है, जिसमें सिग्नल अनुक्रम, ब्याज के पेप्टाइड, लिंकर, मानव बीटा-2-माइक्रोग्लोबुलिन लिंकर और एमएचसी भारी श्रृंखला शामिल हैं। हेपेटाइटिस बी से E1A3 पेप्टाइड का उपयोग एगोनिस्ट पेप्टाइड के रूप में किया जाता है।

एचआईवी से गैग का उपयोग गैर-उत्तेजक पेप्टाइड के रूप में किया जाता है। एकल श्रृंखला मानव MHC अणुओं एक हम्सटर सेल लाइन टेट्रासाइक्लिन दमनकारी युक्त में व्यक्त कर रहे हैं । एगोनिस्ट सिंगल-चेन एमएचसी को टेट्रासाइक्लिन-अशिक्षित प्लाज्मिड का उपयोग करके व्यक्त किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप टेट्रासाइक्लिन के अभाव में बहुत कम अभिव्यक्ति का स्तर होता है, और टेट्रासाइक्लिन की उपस्थिति में उच्च अभिव्यक्ति का स्तर होता है।

एगोनिस्ट पेप्टाइड एमएचसी के निम्न स्तर को व्यक्त करने वाली चो कोशिकाएं संविल्टर रूप से व्यक्त गैर-उत्तेजक पेप्टाइड एमएचसी से संक्रमित होती हैं। इस प्रायोगिक प्रणाली का उपयोग गैर-उत्तेजक पेप्टाइड एमएचसी की उपस्थिति या अनुपस्थिति में एगॉनिस्ट पेप्टाइड एमएचसी के लिए टी सेल प्रतिक्रियाओं की तुलना करने की अनुमति देता है। इस प्रक्रिया को शुरू करने के लिए, टी-75 फ्लास्क में चो कोशिकाओं की खेती करें, जैसा कि पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित है।

टी सेल एक्टिवेशन एक्सपेरिमेंट से पहले दिन फ्लास्क में कोशिकाओं को पीबीएस से धो लें। पीबीएस में 05% ट्राइप्सिन और 2% ईडीटीए युक्त समाधान जोड़ें, और कमरे के तापमान पर पांच से दस मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। एक हल्के माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, कोशिकाओं का निरीक्षण करने के लिए सुनिश्चित करें कि वे अलग है ।

फिर ट्राइपसिनाइजेशन को रोकने के लिए फ्लास्क में पूरा F12 जोड़ें। सेल निलंबन को 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें। पांच मिनट के लिए 400G पर सेंट्रलाइज, और या तो पाइपिंग या डिकैंटिंग द्वारा सुपरनेट को हटा दें।

पूर्ण F12 के पांच मिलीलीटर में सेल गोली को फिर से निलंबित करें। कोशिकाओं की गिनती करने के लिए एक हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करें, और CF12 में प्रति मिलीलीटर 200, 000 कोशिकाओं के लिए कोशिका एकाग्रता को समायोजित करें। एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में एगोनिस्ट पीएएमएचसी वर्ग I अभिव्यक्ति की उच्च मात्रा को प्रेरित करने के लिए एगोनिस्ट-केवल नमूनों में टेट्रासाइक्लिन के मिलीलीटर प्रति 50 से 60 नैनोग्राम जोड़ें।

इसके बाद, चो कोशिकाओं को या तो भंवर या पिपटिंग करके मिलाएं। एक यू-बॉटम 96-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में सेल निलंबन के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट ।

प्रयोग से एक दिन पहले, अपकेंद्रित्र सीटीएलएस कोशिकाओं को ४०० बार जी पर और पांच मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर । कोशिकाओं की गिनती करने के लिए एक हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करें, और उन्हें साइटोकिन्स या पीएचए के बिना पूर्ण मानव टी सेल मीडिया में प्रति मिलीलीटर दस लाख कोशिकाओं के घनत्व पर फिर से निलंबित करें। सीटीएलएस को रात भर 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें ।

अगले दिन, 400 बार जी पर और पांच मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर टी कोशिकाओं अपकेंद्रित्र। सुपरनेट को त्यागें, और पूर्ण सीरम-मुक्त मीडिया के 2 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। टी कोशिकाओं की गिनती करने के लिए एक हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करें, और पूर्ण मानव टी सेल मीडिया में मिलीलीटर प्रति दस लाख जीवित कोशिकाओं के लिए उनके घनत्व को समायोजित करें।

एक से 100 कमजोर पड़ने पर एंटी-ह्यूमन सीडी107ए एंटीबॉडी जोड़ें, और एक से 1000 कमजोर पड़ने पर ब्रेफेल्डिन ए। इसके बाद, चो कोशिकाओं युक्त ९६-अच्छी तरह से थाली को पुनः प्राप्त करें । एक ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करना, चो कोशिकाओं से मीडिया को एस्पिरेट करें।

प्रत्येक अच्छी तरह से टी सेल निलंबन के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें। सह संस्कृति तीन से चार घंटे के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर चो कोशिकाओं के साथ टी कोशिकाओं । सह-संस्कृति के अंत में, ४०० बार जी और पांच मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर ९६-अच्छी थाली अपकेंद्रित्र ।

एस्पिरेशन या फ्लिकिंग करके सुपरनेट निकालें। फिर पीबीएस में 5% बीएसए के 50 माइक्रोलीटर में सीडी 3 एंटीबॉडी के 2.5 माइक्रोलीटर और सीडी 8 एंटीबॉडी के 2.5 माइक्रोलीटर जोड़ें, सेल सतह एंटीजन धुंधला के लिए, और पिपटिंग द्वारा मिश्रण करें। नमूनों को अंधेरे में, और बर्फ पर, 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।

इसके बाद, नमूनों को धोने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से वॉश बफर के 150 माइक्रोलीटर जोड़ें। नमूनों को ४०० बार जी और पांच मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रलाइज करें । एस्पिरेशन या फ्लिकिंग करके सुपरनेट निकालें।

एक निर्धारण/पारमेबिलाइजेशन किट निर्धारित करें, और प्रत्येक कुएं में निर्धारण/पारमेबिलाइजेशन समाधान के १०० माइक्रोलीटर जोड़ें, और मिश्रण करने के लिए पिपेट । 20 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट। इसके बाद पांच मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर ४०० बार जी पर थाली को सेंट्रलाइज करें ।

सुपरनेट को छोड़ दें और प्रत्येक कुएं में 1X पेर्म/वॉश बफर के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें। इस प्रक्रिया को एक बार पर्सेंट/वॉश बफर जोड़कर सेंट्रलाइजेशन से दोहराएं। इसके बाद, 3 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर की एकाग्रता पर एंटी-इंटरफेरॉन-गामा युक्त पेर्म/वॉश बफर के ५० माइक्रोलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें ।

30 मिनट के लिए अंधेरे में बर्फ पर इनक्यूबेट। इसके बाद, 1X पेर्म/वॉश बफर के 150 माइक्रोलीटर जोड़ें। पांच मिनट के लिए 400G, चार डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रलाइज ।

सुपरनेट निकालें और 1X पेर्म/वॉश बफर के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें। पांच मिनट के लिए 400 बार जी, चार डिग्री सेल्सियस पर फिर से प्लेट को अपक्रेस करें, और एस्पिरेशन या फ्लिकिंग करके सुपरनेट को हटा दें। वॉश बफर के 200 माइक्रोलीटर में नमूना फिर से निलंबित करें और साइटोमेट्रिक विश्लेषण के साथ आगे बढ़ें।

प्रयोग से एक दिन पहले, चो कोशिकाओं को या तो भंवर या पिपटिंग द्वारा मिलाएं। इसके बाद 12-अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं में सेल निलंबन का एक मिलीलीटर जोड़ें। 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट ।

प्रयोग के दिन, प्रत्येक कुएं के नीचे से चो कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक सेल स्क्रैपर का उपयोग करें। प्रत्येक अच्छी तरह से कोशिकाओं से FACS ट्यूबों के लिए युक्त मीडिया के एक मिलीलीटर स्थानांतरित करें। ४०० बार जी पर सेंट्रलाइज और पांच मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर ।

वॉश बफर में पतला एंटी-एचएलए एंटीबॉडी के 100 माइक्रोलीटर में फिर से निलंबित करें। 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट। फिर प्रत्येक चो नमूने में वॉश बफर का एक मिलीलीटर जोड़ें।

४०० बार जी पर और पांच मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र, और सुपरनैंट त्यागें । वॉश बफर के 3 मिलीलीटर में प्रत्येक नमूने को फिर से निलंबित करें, और साइटोमेट्री विश्लेषण प्रवाह के लिए आगे बढ़ें। इस अध्ययन में, मानव सीडी 8 सकारात्मक टी सेल सक्रियण के दौरान आणविक बातचीत की जांच के लिए एक मजबूत उपकरण प्रस्तुत किया जाता है।

एक इंजीनियर ज़ेनोजेनिक प्रणाली उत्पन्न होती है जो सह-agonist pMHC की उपस्थिति या अनुपस्थिति में अगोनिस्ट पीएएमएचसी के निम्न स्तर को प्रस्तुत करता है। इन इंजीनियर एपीसीएस तो एक E183-विशिष्ट मानव सीडी 8 सकारात्मक टी सेल क्लोन को प्रोत्साहित करने के लिए उपयोग किया जाता है । असंक्रमित चो कोशिकाएं, और चो कोशिकाएं जो गैर-उत्तेजक एकल-श्रृंखला गैग-एमएचसी परिसर को व्यक्त करती हैं, सक्रियण को प्रेरित नहीं करती हैं।

एगोनिस्ट एकल-श्रृंखला E183-MHC परिसर के उच्च स्तर की अभिव्यक्ति, जो सकारात्मक नियंत्रण है, बहुत कुशल इंटरफेरॉन-गामा उत्पादन, और degranulation को प्रेरित करने के लिए देखा जाता है, यह प्रदर्शित करता है कि एकल श्रृंखला E183 निर्माण को टी सेल प्रभावकार कार्यों को सक्रिय करने के लिए एक विशिष्ट टीसीआर द्वारा मान्यता दी जा सकती है। एकल श्रृंखला E183-MHC परिसर के निम्न स्तर की अभिव्यक्ति इंटरफेरॉन-गामा उत्पादन और degranulation के निचले स्तर को प्रेरित करती है, जिसे एक गैर-उत्तेजक गैग-एमएचसी परिसर की उपस्थिति से बढ़ाया गया था। ध्यान दें कि एंटीजेनिक पीएसएचसी के निम्न स्तर के जवाब में भी CD107a+ टी कोशिकाओं का बहुत अधिक प्रतिशत मनाया जाता है, जो पिछले अध्ययनों के अनुरूप है।

हालांकि, गैर-उत्तेजक गैग-एमएचसी कॉम्प्लेक्स की उपस्थिति CD107a एमएफआई को बढ़ाती है। इस प्रक्रिया के दौरान, एगोनिस्ट पेप्टाइड एमएचसी अभिव्यक्ति को नियंत्रित करना महत्वपूर्ण है ताकि गैर-उत्तेजक पेप्टाइड के साथ या उसके बिना समान एगोनिस्ट प्रस्तुति सुनिश्चित की जा सके। प्रत्येक प्रयोग में टीसीआर जैसे एंटीबॉडी का उपयोग करके एगोनिस्ट पेप्टाइड एमएचसी अभिव्यक्ति की मात्रा निर्धारित करना महत्वपूर्ण है।

एक वैकल्पिक दृष्टिकोण समर्थित लिपिड बाइलेयर्स, या मोतियों का उपयोग करना है, जो गैर-उत्तेजक पेप्टाइड एमएचसी की उपस्थिति में एगोनिस्ट पेप्टाइड एमएचसी की निश्चित मात्रा पेश करता है। उन प्रायोगिक प्रणाली को सह-पीड़ा के लिए कई गैर-उत्तेजक पेप्टाइड दृश्यों के परीक्षण की अनुमति नी चाहिए । एकल श्रृंखला MHC प्रौद्योगिकी सीडी 4 टी सेल सक्रियण में आणविक बातचीत की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, साथ ही गैर शास्त्रीय MHC अणुओं की जांच करने के लिए ।

यह प्रोटोकॉल मानव रक्त और मानव कोशिकाओं का उपयोग करता है। रक्तजनित रोगों के संचरण के जोखिम को कम करने के लिए मानव रक्त के साथ काम करते समय सभी आवश्यक सावधानियों का पालन करें।

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