El uso de este protocolo para eliminar la variación entre muestras puede ofrecer información sobre la regulación diferencial de las macromoléculas basadas en las discrepancias intramuestras entre el ARNm y los niveles de proteína. Usar la misma muestra para aislar el ADN, el ARN y la proteína es un intento de reducir la variabilidad, mejorar la reproducibilidad y facilitar la interpretación. Los beneficios incluyen tiempo y recursos ahorrados en el momento de la recolección de muestras y análisis transversal de muestras valiosas y limitadas.
Para empezar, sembra 1.000 huevos de gusano en una placa de 10 centímetros con condiciones de crecimiento adecuadas. Incubar a 20 grados centígrados durante 72 horas. A continuación, lave la placa con 5 mililitros de tampón M9 y transfiera 1.000 gusanos adultos a un tubo.
Centrifugar los gusanos a 1.000 g durante un minuto, desechar el sobrenadante y transferir los gusanos peletados, con un mililitro de tampón M9, a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Centrifugar de nuevo a 845 g durante un minuto y desechar la mayor parte del sobrenadante. Almacene los gusanos peletados a menos 80 grados Centígrados durante más de cuatro horas.
A continuación, retire cualquier sobrenadante del pellet descongelado. Añadir un mililitro de reactivo GTCP frío, mezclar bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo y colocar la muestra sobre hielo durante 10 minutos. A continuación, agregue 200 microlitros de cloroformo frío.
Agitar el tubo vigorosamente durante 15 segundos y dejarlo a temperatura ambiente durante tres minutos. A continuación, centrifugar el tubo a 13,500 g a cuatro grados Centígrados durante 15 minutos. Con una microtubo, transfiera la capa superior transparente a un nuevo tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitros sin RNase.
Transfiera la capa interfase blanca turbia a un nuevo tubo etiquetado como B2 y transfiera la capa rosa, del pellet restante, a un nuevo tubo etiquetado como B y colóquelo en hielo. Separar claramente las tres capas puede ser difícil. Recomiendo transferir la capa de interfase turbia a su propio tubo en lugar de precipitar el ADN de esta capa desde la capa orgánica o rosa.
Para aislar el ARN, primero agregue 500 microlitros de 100%isopropanol al tubo A para precipitar el ARN. Luego, incubar el tubo a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de la incubación, centrifugar el tubo a 13,500 g a cuatro grados centígrados durante 10 minutos.
A continuación, deseche el sobrenadante y agregue un mililitro de 75% de etanol al tubo A para lavar el pellet. Centrifugar el tubo a 5.300 g a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y deje que el pellet se seque durante cinco a 10 minutos.
Añadir 50 microlitros de agua libre de RNase para reconstituir el pellet de ARN e incubar el pellet a 55 a 60 grados Celsius durante 10 minutos para disolverlo. Por último, utilice un espectrofotómetro para medir la concentración del ARN aislado a 260 nanómetros e identificar cualquier impureza a 230 y 280 nanómetros. Para aislar el ADN, primero agregue 300 microlitros de 100%etanol a la fase orgánica en el tubo B y a la capa blanca turbia en el tubo B2 para precipitar el ADN, mezclar por inversión y dejar los tubos a temperatura ambiente durante dos a tres minutos.
Luego, los tubos centrífugos B y B2 a 376 g a cuatro grados Celsius durante cinco minutos para el ADN de pellet. Combine el sobrenadante de los tubos B y B2 en un nuevo tubo de dos mililitros etiquetado como C y déjelo en hielo para el posterior aislamiento proteico. A continuación, lave el pellet de ADN en el tubo B2 con un mililitro de citrato sódico molar 0,1 en 10%etanol durante 30 minutos.
Tubo centrífuga B2 a 376 g a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Repita el paso de lavado y luego vuelva a suspender el pellet en 1,5 mililitros de 75% de etanol y déjelo a temperatura ambiente durante 20 minutos. A continuación, centrifugar el tubo B2 a 376 g a cuatro grados Centígrados durante cinco minutos y luego deseche el sobrenadante y deje que el pellet se seque durante cinco a 10 minutos.
Disolver el pellet en 150 microlitros de hidróxido de sodio de ocho mililitros. Luego, centrifuga la muestra a 376 g a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Finalmente, con una micropipeta, transfiera el sobrenadante que contiene el ADN a un tubo nuevo.
Utilizar un espectrofotómetro para medir la concentración del ADN aislado a 260 nanómetros e identificar cualquier impureza a 230 y 280 nanómetros. Para precipitar la proteína, primero agregue hasta 1,5 mililitros de 100%isopropanol al sobrenadante rosado en el tubo C, mezcle invirtiendo varias veces e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego, centrifugar el tubo C a 13,500 g a cuatro grados Celsius durante 10 minutos.
Deseche el sobrenadante y lave el pellet con dos mililitros de 0,3 molar de clorhidrato de guanidina en 95%etanol durante 20 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar el tubo de nuevo a 5, 300 g a cuatro grados Celsius durante cinco minutos y repita el paso de lavado como antes. Transfiera el pellet proteico a un nuevo tubo de 1,5 mililitros con la etiqueta C2 y agregue hasta 1,5 mililitros de 95% de etanol, vórtice, y déjelo reposar a temperatura ambiente durante 20 minutos.
Centrifugar el tubo a 5.300 g a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y deje que el pellet se seque a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego, disuelva el pellet en 300 microlitros de 5%SDS a 50 grados Celsius durante 60 minutos.
Finalmente, centrifugar el tubo a 13,500 g a 17 grados Celsius durante 10 minutos. Y transfiera el sobrenadante que contiene la proteína a un tubo nuevo. Para realizar una transcripción inversa cuantitativa PCR.
En primer lugar, utilice un nanograma del ARN aislado para preparar el ADNc mediante transcripción inversa. Para hacer una placa de almacenamiento de ADNc, agregue 100 microlitros de una a 100 diluciones de cada muestra de ADNc a pozos individuales de una placa de 96 pozos, incluya controles adecuados, como pozos solo de agua y muestras diluidas en serie, para establecer la eficiencia de imprimación para cada gen. Para hacer una mezcla maestra para cada conjunto de imprimaciones, agregue hasta siete microlitros de agua, un tinte de cianuro intercalante de ADN y cinco micro-molares cada uno de imprimadores hacia adelante y hacia atrás.
Añadir siete microlitros de la mezcla maestra a los pozos apropiados de una placa RT-qPCR. A continuación, añada tres microlitros del ADNc de la placa de stock y ejecute la placa utilizando un protocolo RT-qPCR adecuado para las imprimaciones que se utilizan. Se realizó un análisis RT-qPCR de ARN aislados a partir de cuatro muestras independientes de tres cepas de gusanos para confirmar los objetivos identificados por el ensayo de ARN seq.
El gen F07C4.12 fue regulado al ras en ambos ensayos en gusanos eat-2, pero su regulación ascendente en los gusanos rsks-1 no fue detectada por el ensayo RT-qPCR. Además, el RNA seq detectó cambios de expresión de mrp-1 en los gusanos eat-2 y rsks-1 fueron confirmados a través del análisis RT-qPCR.
La comparación de la proteína de GTCp frente a la proteína extraída por RIPA en gusanos separados por la página SDS y manchados con coomassie blue mostró una calidad similar con una mejor resolución de proteínas más grandes para las proteínas extraídas por GTCp. El análisis de manchas occidentales mostró niveles de proteínas similares en la mayoría de los casos;sin embargo, las proteínas de más de 75 kilodalton mostraron niveles más bajos en la proteína extraída por RIPA. La comparación entre los objetivos de ARNm y los niveles de proteína de cuatro muestras individuales de tres cepas de gusano mostró una baja variabilidad de los niveles de ARNm con mayor variabilidad a nivel proteico.
En el contexto del aislamiento del ADN, el rendimiento depende en gran medida del dominio para recuperar la capa interfase turbia de la capa orgánica o rosa. Para mejorar la solubilización de las proteínas del pellet puede ser necesario aumentar el volumen de tampón de resolubilización o añadir otros detergentes además de SDS. El uso de este método puede ayudar a identificar correctamente los casos en los que la traducción del ARNm a la proteína no es coreltiva y puede conducir a una investigación más profunda de los mecanismos reguladores post-transcripción y post-traduccional bajo diversas condiciones.
En nuestro laboratorio, este protocolo se ha utilizado para conservar muestras de núcleo valiosas y de tiempo limitado. Además, puedo imaginar que este sería un protocolo útil para adoptar en el campo del ritmo circadiano. El reactivo GCTP y los disolventes utilizados en el aislamiento de ARN son riesgos y deben utilizarse con precaución.
