Los autores desean agradecer MICINN (programa de apoyo a la PTA de Montserrat Porta de la Riva), AGAUR (Doctorado de Becas a Laura Fontrodona), Instituto de Salud Carlos III (Miguel Servet programa de apoyo a Julián Cerón), y Marie Curie GRI, ISCIII y el IDIBELL para la financiación el laboratorio.

1. Protocolo A: El cultivo de gusanos de blanqueo 11 Las grandes poblaciones de C. elegans puede obtenerse mediante el cultivo de ellos, ya sea en medios líquidos o en medios sólidos en placas. Por lo general se cultiva en sólidos NGM (medios de comunicación de crecimiento de nematodos) y alimentados con E. bacteria E., que se añade a las placas ya sea vivos o muertos (muerto por UV 12, por el calor o por frío 13 14). El procedimiento más común utiliza en vivo E. OP50 coli, que es defectuoso en la síntesis de uracilo y no puede crecer más en una capa gruesa que oscurecen los gusanos. <ol><li> Mezclar 3 g de NaCl, 17 g de agar y 2,5 g de peptona y añadir 975 ml de H 2 O. Autoclave durante 50 min. </li><li> Enfriar a 55 ° C. </li><li> Añadir 1 ml de 1 M CaCl 2, 1 ml de 5 mg / ml de colesterol en etanol, 1 ml de 1 M MgSO 4 y 25 ml de 1 M KPO 4 tampón (todos ellos, pero el colesterol previamente Autoclaved). </li><li> El uso de procedimientos estériles dispensar la solución NGM en placas de Petri, placas de relleno hasta 2/3 de su volumen. </li><li> Una vez seco, es conveniente dejar las placas a temperatura ambiente durante 2-3 días antes de su uso para la detección de contaminantes. Preparar una racha de OP50 E. coli de un stock de glicerol (OP50 puede obtenerse desde el Centro de Caenorhabditis genética). </li><li> Elija una sola colonia y crecer en LB durante la noche a 37 ° C con agitación. </li><li> Permitir el exceso de humedad se evapore de las placas mediante la eliminación de la tapa en el flujo laminar y añadir OP50 al centro de las placas con una pipeta Pasteur estéril. </li><li> Deje que el E. OP50 césped coli para crecer durante la noche a temperatura ambiente oa 37 ° C durante 8 horas. </li><li> Añadir la cantidad deseada de los gusanos a las placas (si se incuban a 37 ° C las placas deben enfriarse a temperatura ambiente antes de su uso). </li></ol> CONSEJOS: <ul><li> El vertido de la misma cantidad de mediosen las placas con una pipeta o un dispensador de bomba asegura el mismo volumen de agar para las placas y se facilita el desplazamiento de la placa sin necesidad de reorientar el microscopio estereoscópico. </li><li> Placas tanto sin semillas y sin sembrar con bacterias) se pueden utilizar varias semanas después de preparado cuando se almacena en un recipiente a temperatura ambiente o 4 ° C. </li><li> Evitar placas las bacterias hasta el borde de la placa. Si el césped se extiende a los bordes de la placa de los gusanos puede arrastrarse por los lados, se secan y mueren. </li><li> Los gusanos viven más tiempo si las bacterias en las placas sembradas ya 15 muertos. </li></ul> 2. Protocolo B: El tratamiento con solución de hipoclorito alcalino (&quot;blanqueo&quot;) 11 La técnica de blanqueo se utiliza para sincronizar C. elegans culturas en la primera etapa larval (L1). El principio del método reside en el hecho de que los gusanos son sensibles a la lejía, mientras que la cáscara del huevo protege embryos de ella. Después del tratamiento con solución de hipoclorito alcalino, los embriones se incuban en medios líquidos sin alimentos, lo que permite incubar pero impide un mayor desarrollo. <ol><li> Deje que los gusanos de crecer hasta la etapa adulta. </li><li> Recuperar los adultos grávidas en tubos de 15 ml por lavado placas con tampón M9. </li><li> Pellets gusanos por centrifugación durante 2 minutos a 400xg (~ 1500 rpm en una centrífuga de mesa estándar) a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante. </li><li> Realizar lavados de 1-3 hasta que el buffer aparece libre de bacterias. </li><li> Añadir la solución deseada de blanqueo (Tabla I) y agitar durante unos minutos (destrucción del tejido adulto deben ser monitoreados bajo el microscopio de disección y la reacción se detuvo cuando los rastros de los adultos son todavía visibles, que suele durar entre 3 y 9 minutos, dependiendo de varios cuestiones, tales como el volumen de gusano de pellets, mencionado en la discusión) (Fig. 3). </li><li> Detener la reacción añadiendo M9 buffer para llenar el tubo. </li><li> Centrifugar rápidamente (ya que el tratamiento todavía puede ser activo) durante 1 minuto a 400 xg y desechar el sobrenadante. </li><li> Lavar pellet más tres veces llenando el tubo con tampón M9. </li><li> Añadir 1 ml de buffer M9 de la pastilla, o poner los huevos a las placas de NGM no cabezas de serie, y se incuba a la temperatura deseada con una suave agitación. Aireación adecuada debe ser suministrada (Fig. 4). </li></ol> CONSEJOS: <ul><li> Existen diferentes soluciones blanqueadoras, elegir la que funciona mejor en sus manos (Tabla 1, Fig. 1). </li><li> Los huevos ya establecidos en las placas pueden ser recuperados por el desguace de la superficie del agar con un material blando tal como un trozo de una película de rayos-X. </li><li> Demasiados restos de los animales adultos puede afectar a la sincronización, ya que constituyen una fuente de alimento para las larvas recién eclosionadas. </li><li> Las altas temperaturas ligeramente acelerar el desarrollo, que es un inconveniente if cualquier salta gusano de sincronización debido a la diferencia en el desarrollo entre los gusanos sincronizados y sin sincronizar será mayor a temperaturas más altas. </li><li> Solución de blanqueo debe realizarse justo antes de su uso. Además, el cloro pierde su potencia después de haber sido abierta por un tiempo, en parte debido a su fotosensibilidad. Sugerimos alícuota de cada nueva botella en botellas de color ámbar pequeños para evitar tal pérdida y minimizar la exposición a la luz. </li></ul> 3. Protocolo C: Revestimiento Gusano <ol><li> Esperar entre 12 y 24 horas (tiempo para completar el desarrollo embrionario depende de la temperatura) después del blanqueo se realizó y recuperar gusanos por centrifugación (2 minutos a 400 xg). </li><li> Descartar el sobrenadante, las semillas de gusanos en las placas necesarias y dejar que el líquido residual seco. </li><li> Colocar las placas a la temperatura requerida. </li></ol> CONSEJOS: <ul><li> Larvas L1 en M9 tampón puede mantenerse a 15 ° C balanceo al menos durante una semana wiThout alteraciones evidentes. </li><li> tenga cuidado en el cálculo de los gusanos que servirán para comenzar porque muchos se agotan los alimentos más rápido de lo esperado y la ruina de su experimento. Aproximadamente 500 L1 puede llegar a la edad adulta en una placa de 55 mm sin el funcionamiento de los alimentos. </li></ul> 4. Protocolo D: C. elegans Observación D.1 Nomarski la observación Interferencia diferencial microscopía de contraste es una técnica de microscopía óptica de iluminación utilizado para mejorar el contraste en muestras no teñidas transparentes. La palabra se refiere a Nomarski el prisma utilizado, el nombre de su inventor. Mediante la observación de los animales vivos que son capaces de estudiar la fisiología del animal con las únicas alteraciones derivadas de la inmovilización. Además, como fijador se añade, marcadores fluorescentes se puede observar en vivo. Este hecho y la posibilidad de marcadores fluorescentes a la fusión de un gen de interés que sea factible para seguir los procesos en which la proteína de estudio pueden estar involucrados. Mediante el uso de la técnica descrita en este protocolo, no sólo gusanos vivos se puede observar, pero también pueden ser recuperados y se colocaron de nuevo. Agar preparación de la almohadilla (justo antes de su uso): <ol><li> Preparar agarosa al 2% en agua y se funden. Mantenga funde a 65 ° C. </li><li> Coloque dos diapositivas con un trozo de cinta en ellos a ambos lados de una tercera diapositiva, limpio. </li><li> Utilizando una pipeta Pasteur lugar una caída de agar sobre la superficie limpia. </li><li> Cubrir el agar con otro portaobjetos limpio colocado en la parte superior de las tres diapositivas perpendicularmente. </li><li> Presione suavemente por lo que la caída de agar se aplana al grosor de los separadores de cinta. </li><li> Una vez que el agar se solidifica, tire suavemente de las diapositivas pegados y separar las dos diapositivas restantes deslizando una respecto a la otra. </li></ol> Montaje animales vivos <ol start="7"><li> Azida Ponga una gota (10 l), 1 mM de levamisol o sodio 10-30 mM en tl Centro de la almohadilla. </li><li> Trasladar a los animales dentro de la gota con una selección de gusano. </li><li> Con suavidad, coloque un cubreobjetos sobre los animales y fijarlo a ambos lados con un poco de esmalte de uñas o de silicona. </li></ol> CONSEJOS: <ul><li> Mantener las alícuotas de agarosa al 2% a 4 ° C. </li><li> Agarosa fundida puede mantenerse a 65 ° C durante al menos un día. </li><li> Nota: El levamisol es un agonista del receptor nicotínico que provoca parálisis muscular espástica 16. </li><li> Tenga cuidado, azida de sodio es extremadamente tóxico! </li></ul> D.2 etanol fijación y DAPI El protocolo descrito aquí representa una forma rápida de teñido con DAPI gusanos, sin embargo, debido a la desecación del gusano algunas estructuras pueden presentar alguna alteración. Hay varios otros métodos para fijar los gusanos anteriores a DAPI tales como la fijación con solución de Carnoy o formaldehído que conservar mejor la integridad del gusano 17. La fijación de etanol (modificado a partir de 18) <ol><li> Lugar ~ 10 l de tampón M9 (o agua) en un portaobjetos de microscopio. </li><li> El uso de un gusano de escoger cuidadosamente la transferencia 10-25 gusanos a la caída. </li><li> El uso de papel de filtro o una micro-pipeta eliminar tampón M9 tanto como sea posible sin quitar los gusanos o dejando que se sequen. </li><li> Añadir aproximadamente 10 l de etanol al 90% y dejar secar. </li><li> Repita el paso 4 una o dos veces. </li></ol> 4 &#39;,6-diamino-2-phenylindole (DAPI) tinción <ol start="6"><li> Mezclar DAPI con los medios de montaje deseada a una concentración final de 2 ng / l. </li><li> Una vez que el etanol se ha evaporado por completo, añadir 7 l de la DAPI: mezcla de medios de montaje. </li><li> Coloque un cubreobjetos y fijarlo a ambos lados con un poco de esmalte de uñas o de silicona. Las diapositivas estará listo para la observación de aproximadamente 5 minutos después de la adición de DAPI. </li></ol> CONSEJOS: <ul><li> El montaje de medicinaentre otras cosas contiene glicerol, por lo que una pequeña cantidad es suficiente para cubrir toda la preparación. </li><li> Existe una amplia variedad de medios de comunicación comerciales de montaje (Fluoromount o prolongar, por ejemplo), su calidad y el precio dependerá de cuánto tiempo desea almacenar la muestra. </li><li> Tenga cuidado, DAPI es un mutágeno conocido que se une fuertemente a regiones ricas en AT en el ADN. </li></ul> Recetas Nematodo medio de crecimiento (NGM) 1,7% (w / v) de agar 50 mM de NaCl 0,25% (w / v) peptona 1 mM de CaCl 2 5 ug / ml de colesterol 25 mM de KPO 4 1 mM de MgSO 4 M9 de amortiguación 22mm KH 2 PO 4 42 mM Na 2 HPO 4 86 mM de NaCl 1 mM de MgSO 4 Soluciones para blanquear a prueba <table border="1"><tbody&gt; <tr><td></td><td> Receta # 1 </td><td> Receta # 2 </td><td> Receta # 3 </td><td> Receta # 4 </td><td> Receta # 5 </td></tr><tr><td> agua (ml) </td><td> 2,75 </td><td> 3.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> hidróxido de sodio (ml) </td><td> 1,25 (1M) </td><td> 0,5 (5M) </td><td> 2,5 (1M) </td><td> 2,5 (2M) </td><td> 2,5 (1M) </td></tr><tr><td> ~ de hipoclorito de sodio al 4% (ml) </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> total (ml) </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr></tbody></table> Tabla I. Diferentes recetas de blanqueo de soluciones probadas para este artículo. Recetas # 3 y # 4 son 2x, y debe ser añadido al mismo volumen de M9. Recetas para el # 1, # 2 y # 5 han sido previamente reportados 2, 11, 19. Las concentraciones finales: # 1 de NaOH 0,25 M, ~ de hipoclorito de sodio al 0,8%<html> , N º 2 de NaOH 0,5 M, NaOCl ~ 0,8%, n º 3 de NaOH 0.625M, NaOCl ~ 1%, n º 4 de NaOH 1 M, NaOCl ~ 1,6%, n º 5 de NaOH 0,5 M, NaOCl ~ 0,8%. 5. Los resultados representativos <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Comparación de los cinco diferentes soluciones de blanqueo en dos diferentes tiempos de incubación. Gusanos N2 se lavó dos veces con M9 se dividieron en cinco tubos de 15 ml cónicos que contienen cada una solución de blanqueo. Los tubos se agitaron vigorosamente y 1 ml transfirió a un tubo nuevo con M9 para detener la reacción después de que el tiempo especificado. Después de decoloración de los gusanos procedimiento se incubaron con 1 ml de M9 a 20 ° C durante 24 horas. En cada caso, inferior fotografía fue tomada justo después del blanqueo, fotografía superior 24 horas después. _upload/4019/4019fig2.jpg &quot;alt =&quot; Figura 2 &quot;/&gt; Figura 2. Temperatura de solución de blanqueo afecta a la eficacia del tratamiento. Volúmenes iguales de gusanos N2 se blanquearon con la misma solución de blanqueo ya sea previamente enfriada en hielo durante 20 minutos o se mantiene a 25 ° C durante el mismo tiempo. Las dos columnas de las imágenes muestran a la izquierda justo después del blanqueamiento. Después de gusanos de tratamiento se incubaron en tubos cónicos de 15 ml con 1 ml de M9 a 20 ° C durante 24 horas. Las columnas en los cuadros de la exhibición correctas las 24 horas posteriores. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. El gusano relación sedimento: tiempo de incubación hipoclorito alcalino afecta a la eficacia del tratamiento l 50, 100, 250 y 500 de gusano sedimento se incubaron con 2 ml de solución de blanqueo # 3 minutos para 3, 6 y 9.. Sombreadas L1, embriones muertos y restos de fragmentos adultos fueron cuantificados después de incubación a 20 ° C durante 2<html> 4 horas en tubos de 15 ml cónicos con 1 ml de tampón de M9. Aproximadamente tres placas confluentes de 55 mm con gusanos adultos son necesarias para obtener una pastilla 100 l gusano. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Ventilación adecuada es necesaria para la eclosión y la supervivencia de C. embriones elegans. Un pellets 100 l de gusanos N2 se blanquearon durante 6 minutos y se incubaron en tubos cónicos de 15 ml con 1 ml, 5 o 10, según se especifica, de M9 a 20 ° C durante 24 horas. La parte superior de la figura muestra fotografías de los cultivos después de 24 horas, donde las flechas indican los huevos que no eclosionan. En la parte inferior, hay un gráfico que representa la cantidad de larvas (gris claro) y los embriones muertos (gris oscuro) 48 horas después de la decoloración en las condiciones establecidas. tp_upload/4019/4019fig5.jpg &quot;alt =&quot; Figura 5 &quot;/&gt; Figura 5. Ciclo de vida de C. elegans. una. Duración aproximada de los gusanos en las diferentes etapas. Horas requerida para alcanzar cada etapa en función de la temperatura (modificado de 20). B. Nomarski (arriba) y DAPI (hacia abajo) imágenes de gusanos diferentes en las etapas de desarrollo indicadas. Las características más significativas de cada fase se multiplican L1: la flecha indica que los precursores de la gónada somáticas y la línea germinal temprana L4: negro flecha (Nomarski) indica que el desarrollo de la vulva; flechas blancas (DAPI) indican que los dos brazos gonadales Medio... finales de L4: La flecha indica la vulva en desarrollo en la etapa de árbol de los llamados jóvenes adultos: la Navidad. flecha de color negro indica un embrión dentro del útero, punta de flecha apunta a la espermateca, flecha blanca indica un ovocito grávidas adultos:. punta de flecha (DAPI) señala embriones fecundados. Flecha en DAPI imagen indica espermateca. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Vulva morfología en L3, L4 y etapas adultas. En la etapa L3 sólo un lumen pequeño donde se forma la vulva puede ser observado. En L4, esta luz se expande formando el llamado &quot;árbol de Navidad&quot;. En el adulto la vulva ya está cerrado. Las líneas amarillas indican la localización de la vulva en estas tres etapas. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig7.jpg" alt="Figura 7" /> Figura 7. DAPI en L3, L4 temprana, las etapas finales de L4 y adultos. En L3, línea germinal es alargada. A nivel L4, las gónadas de armas presentes en forma de U morfología. En los espermatozoides última etapa-L4 se puede observar en la parte distal de la gónada. Los adultos jóvenes presentan ovocitos. La línea germinal de adultos presenta ovocitos y embriones. Las líneas amarillas delimitar las líneas germinales en THe las distintas etapas establecidas. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig8.jpg" alt="Figura 8" /> Figura 8. C. desarrollo elegans a los 15 y 25 ° C. gusanos N2 se blanquearon, se incubaron durante la noche en M9 y agitación a 15 ° C, se transfirió a placas y se cultivaron los tiempos indicados en las temperaturas indicadas.

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No tenemos nada que revelar.

Sincronización de los nematodos Varias soluciones de blanqueo se han descrito. Probamos cinco recetas diferentes (Tabla I) y, en nuestras manos, no muestran diferencias significativas en la sincronización de las poblaciones de gusano (Fig. 1). Sin embargo, nuestros experimentos mostraron que los parámetros tales como temperatura (Fig. 2), la solución de blanqueo relación: volumen de gusanos (Fig. 3) y el volumen de M9 con ...

basic caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation

La investigación sobre la biología molecular y del desarrollo de los nematodo Caenorhabditis elegans se inició en los años setenta por Sydney Brenner y desde entonces ha sido utilizado ampliamente como un organismo modelo 1. C. elegans posee atributos clave tales como la simplicidad, la transparencia y el corto ciclo de vida que han hecho un adecuado sistema experimental para estudios biológicos fundamentales desde hace muchos años 2. Los descubrimientos en este nematodo tener amplias implicaciones debido a que muchos procesos celulares y moleculares que controlan el desarrollo evolutivo de los animales son conservadas 3. C. elegans ciclo de vida pasa por una fase embrionaria y cuatro estadios larvarios antes que los animales alcanzan la edad adulta. El desarrollo puede tomar de 2 a 4 días dependiendo de la temperatura. En cada una de las varias etapas rasgos característicos pueden ser observadas. El conocimiento de su linaje celular completo, junto con el 4,5 annotat profundaión de su genoma convertir este nematodo en un gran modelo en campos tan diversos como la neurobiología 6, el envejecimiento de 7,8, 9 biología de células madre y la biología de la línea germinal 10. Una característica adicional que hace C. elegans un modelo atractivo para trabajar con la posibilidad de la obtención de las poblaciones de gusanos sincronizados en una etapa específica a través de un protocolo relativamente fácil. La facilidad de mantenimiento y propagación de este nematodo añadido a la posibilidad de sincronización proporcionar una poderosa herramienta para obtener grandes cantidades de gusanos, que pueden ser utilizados para una amplia variedad de experimentos pequeños o de alto rendimiento, tales como pantallas de RNAi, micromatrices, secuenciación masiva, inmunotransferencia o la hibridación in situ, entre otros. Debido a su transparencia, C. estructuras elegans pueden distinguirse bajo el microscopio de interferencia diferencial utilizando microscopía de contraste, también conocido como micros Nomarskicopiar. El uso de un ligante de ADN fluorescente, DAPI (4 &#39;,6-diamino-2-fenilindol), por ejemplo, puede conducir a la identificación específica y localización de las células individuales, así como las estructuras subcelulares y defectos asociados a ellos.

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Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

La facilidad de mantenimiento y propagación del nematodo<em&gt; C. elegans</em&gt; Lo convierten en un organismo modelo agradable trabajar con él. La posibilidad de que los gusanos de sincronización permite el trabajo con una gran cantidad de temas en la misma etapa de desarrollo, lo que facilita el estudio de un proceso en particular en muchos animales.

Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos de sincronización y de observación

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

46.5K vistas.  Bellvitge Institute for Biomedical Research. La facilidad de mantenimiento y propagación del nematodo C. elegans Lo convierten en un organismo modelo agradable trabajar con él. La posibilidad de que los gusanos de sincronización permite el trabajo con una gran cantidad de temas en la misma etapa de desarrollo, lo que facilita el estudio de un proceso en particular en muchos animales.

Video: Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Standardized Methods for Measuring Induction of the Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans

The heat shock response (HSR) is a cellular stress response induced by cytosolic protein misfolding that functions to restore protein folding homeostasis, or proteostasis. Caenorhabditis elegans occupies a unique and powerful niche for HSR research because the HSR can be assessed at the molecular, cellular, and organismal levels. Therefore, changes at the molecular level can be visualized at the cellular level and their impacts on physiology can be quantitated at the organismal level. While assays for measuring the HSR are straightforward, variations in the timing, temperature, and methodology described in the literature make it challenging to compare results across studies. Furthermore, these issues act as a barrier for anyone seeking to incorporate HSR analysis into their research. Here, a series of protocols is&#160;presented for measuring induction of the HSR in a robust and reproducible manner with RT-qPCR, fluorescent reporters, and an organismal thermorecovery assay. Additionally, we show that a widely used thermotolerance assay is not dependent on the well-established master regulator of the HSR, HSF-1, and therefore should not be used for HSR research. Finally, variations in these assays found in the literature are discussed and best practices are proposed to help standardize results across the field, ultimately facilitating neurodegenerative disease, aging, and HSR research.

Standardized Methods for Measuring Induction of the Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans

Here, standardized protocols are presented to assess induction of the heat shock response (HSR) in Caenorhabditis elegans using RT-qPCR at the molecular level, fluorescent reporters at the cellular level, and thermorecovery at the organismal level.

Métodos estandarizados para medir la inducción de la respuesta de choque térmico en Caenorhabditis elegans

The heat shock response (HSR) is a cellular stress response induced by cytosolic protein misfolding that functions to restore protein folding homeostasis, ...

Investigación

Medio ambiente

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many historical and contemporary studies have identified thousands of lifespan-altering paradigms, including genetic mutations, transgenic gene expression, and hormesis, a beneficial, low-grade exposure to stress. With its many advantages, including a short lifespan, easy and low-cost maintenance, and fully sequenced genome with homology to almost two-thirds of all human genes, C. elegans has quickly been adopted as an outstanding model for stress and aging biology. Here, several standardized methods are surveyed for measuring lifespan and healthspan that can be easily adapted into almost any research environment, especially those with limited equipment and funds. The incredible utility of C. elegans is featured, highlighting the capacity to perform powerful genetic analyses in aging biology without the necessity of extensive infrastructure. Finally, the limitations of each analysis and alternative approaches are discussed for consideration.

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans serve as an excellent model system with robust and low-cost methods for surveying healthspan, lifespan, and resilience to stress.

Encuesta de métodos de bajo costo para medir la esperanza de vida y la salud en Caenorhabditis elegans

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many ...

Genética

<meta charset="utf8"></head><body>Extracción y cuantificación de respuestas de feromonas sexuales volátiles en C. elegans

Volatile Sex Pheromone Extraction and Chemoattraction Assay in Caenorhabditis elegans

Chemical communication is vital in organismal health, reproduction, and overall well-being. Understanding the molecular pathways, neural processes, and computations governing these signals remains an active area of research. The nematode Caenorhabditis elegans provides a powerful model for studying these processes as it produces a volatile sex pheromone. This pheromone is synthesized by virgin females or sperm-depleted hermaphrodites and serves as an attractant for males.
This protocol describes a detailed method for isolating the volatile sex pheromone from several C. elegans strains (WT strain N2, daf-22, and fog-2) and C. remanei. We also provide a protocol for quantifying the male chemotaxis response to the volatile sex pheromone. Our analysis utilizes measurements such as chemotaxis index (C.I.), arrival time (A.T.), and a trajectory plot to compare male responses under various conditions accurately. This method allows for robust comparisons between males of different genetic backgrounds or developmental stages. Furthermore, the experimental setup outlined here is adaptable to investigating other chemoattraction chemicals.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor destacado: Examinando la influencia de las feromonas sexuales volátiles en el comportamiento de los machos de C. elegans

This protocol establishes methods for extracting and quantifying responses to the volatile sex pheromone in C. elegans, providing tools to study chemical communication and navigation trajectory.

Extracción de feromonas sexuales volátiles y ensayo de quimioatracción en Caenorhabditis elegans

Chemical communication is vital in organismal health, reproduction, and overall well-being. Understanding the molecular pathways, neural processes, and ...

Comportamiento

<meta charset="utf8"></head><body>Seguimiento del calcio en las primeras fases de desarrollo de C. elegans

In Vivo Visualization of Calcium Transients during Fertilization and Early Development in C. elegans

Calcium is an important signaling molecule during the oocyte-to-embryo transition (OET) and early embryogenesis. The hermaphroditic nematode Caenorhabditis elegans provides several unique advantages for the study of the OET as it is transparent and has an ordered gonad that produces one mature oocyte every ~23 min at 20 &#176;C. We have modified the genetically encoded calcium indicator jGCaMP7s to fluorescently indicate the moment of fertilization within a living organism. We have termed this reporter &#34;CaFE&#34; for Calcium during Fertilization in C. elegans. The CaFE reporter was&#160;engineered into a safe harbor locus in single copy, has no significant impact on physiology or fecundity, and produces a robust signal upon fertilization. Here, a series of protocols is presented for utilizing the CaFE reporter as an in vivo tool for dissecting the OET and embryogenesis. We include methods to synchronize worms, examine the effects of RNAi knockdown, mount worms for imaging, and to visualize calcium in oocytes and embryos. Additionally, we present the generation of additional worm strains to aid in this type of analysis. Demonstrating the utility of the CaFE reporter to visualize the timing of fertilization, we report that double ovulation occurs when ipp-5 is targeted by RNAi and that only the first oocyte undergoes immediate fertilization. Furthermore, the discovery of single-cell calcium transients during early embryogenesis is reported here, demonstrating that the CaFE reporter persists into early development. Importantly, the CaFE reporter in worms is simple enough to use for incorporation into course-based undergraduate research (CURE) laboratory classes. The CaFE reporter, coupled with the ordered gonad and ease of RNAi in worms, facilitates inquiry into the cell-cell dynamics required to regulate internal fertilization and early embryogenesis.

<meta charset="utf8"></head><body>Visualización in vivo de transitorios de calcio durante la fertilización y el desarrollo temprano en C. elegans

Here, we present protocols and tools for visualizing calcium during fertilization and early embryogenesis using a genetically encoded calcium reporter expressed in the germline of the model nematode C. elegans.

Visualización in vivo de transitorios de calcio durante la fertilización y el desarrollo temprano en C. elegans

Calcium is an important signaling molecule during the oocyte-to-embryo transition (OET) and early embryogenesis. The hermaphroditic nematode ...

Biología del Desarrollo

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous system and muscle. Consistent with this, mitochondrial dysfunction has been associated with a myriad of neurodegenerative diseases and aging in general. Caenorhabditis elegans have been a powerful model system for elucidating the many intricacies of mitochondrial function. Mitochondrial respiration is a strong indicator of mitochondrial function and recently developed respirometers offer a state-of-the-art platform to measure respiration in cells. In this protocol, we provide a technique to analyze live, intact C. elegans. This protocol spans a period of ~7 days and includes steps for (1) growing and synchronization of C. elegans, (2) preparation&#160;of compounds to be injected and hydration of probes, (3) drug loading and cartridge equilibration, (4) preparation of worm assay plate and assay run, and (5) post-experiment data analysis.

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondrial respiration is critical for organismal survival; therefore, oxygen consumption rate is an excellent indicator of mitochondrial health. In this protocol, we describe the use of a commercially available respirometer to measure basal and maximal oxygen consumption rates in live, intact, and freely-motile Caenorhabditis elegans.

Medición de las tasas de consumo de oxígeno en intacto Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Biología

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and physiology. Thus, organisms have evolved targeted and specific stress responses dedicated to repair damage and maintain homeostasis. These mechanisms include the unfolded protein response of the endoplasmic reticulum (UPRER), the unfolded protein response of the mitochondria (UPRMT), the heat shock response (HSR), and the oxidative stress response (OxSR). The protocols presented here describe methods to detect and characterize the activation of these pathways and their physiological consequences in the nematode, C. elegans. First, the use of pathway-specific fluorescent transcriptional reporters is described for rapid cellular characterization, drug screening, or large-scale genetic screening (e.g., RNAi or mutant libraries). In addition, complementary, robust physiological assays are described, which can be used to directly assess sensitivity of animals to specific stressors, serving as functional validation of the transcriptional reporters. Together, these methods allow for rapid characterization of the cellular and physiological effects of internal and external proteotoxic perturbations.

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Here, we characterize cellular proteotoxic stress responses in the nematode C. elegans by measuring the activation of fluorescent transcriptional reporters and assaying sensitivity to physiological stress.

Mediciones de las respuestas fisiológicas de estrés en C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

Básico

Resumen

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Extracción de feromonas sexuales volátiles y ensayo de quimioatracción en Caenorhabditis elegans

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Visualización in vivo de transitorios de calcio durante la fertilización y el desarrollo temprano en C. elegans

Visualización in vivo de transitorios de calcio durante la fertilización y el desarrollo temprano en C. elegans

Visualización in vivo de transitorios de calcio durante la fertilización y el desarrollo temprano en C. elegans

Medición de las tasas de consumo de oxígeno en intacto Caenorhabditis elegans

Mediciones de las respuestas fisiológicas de estrés en C. Elegans