Nos gustaría agradecer la financiación de los Institutos Nacionales de Salud (R15-03 GM065444 a LB) y el Programa de Investigación Intramural del Instituto Nacional de Salud (NIH) y el Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales (KO). Un premio NSF (DBI-0923402) financió la adquisición de un microscopio confocal LSM700. También nos gustaría agradecer la asistencia general y comentarios sobre el manuscrito del Dr. Andy oro. El crédito va para toda la comunidad de C. elegans para compartir recursos, protocolos, y las ideas.

1. Culturas nematodo <ol><li> Obtener la adecuada C. elegans cepa de la Genética Caenorhabditis Stock Center (CGC) o de un colega. </li><li> Crecen los nematodos en placas de agar NGM sembrado con césped OP50 bacteriana (3). Para el análisis de las buenas prácticas agrarias crecimiento cepas a 25 ° C se recomienda. </li><li> El día antes de su experimento microscopio, recoger al menos 40 larvas L4 en placas de semillas y colocar las placas a 25 ° C durante la noche. Estos gusanos se los adultos jóvenes para el experimento. </li></ol> 2. Inyecciones Si se desea ver la estructura, tales como los lisosomas o las mitocondrias, los adultos pueden ser inyectadas con colorante fluorescente antes de su visualización. <ol><li> Prepare seca almohadillas de inyección de agarosa. (Esto se puede hacer uno a varios días de antelación) <ol><li> Prepare fundido agarosa al 2% en agua. Con una pipeta Pasteur colocar 2 gotas en un cubreobjetos 22X54 mm. Coloque otro cubreobjetos en cruz en la parte superior de la gota. A fin de lograr el espesor adecuado, pulse sobre el cubre la parte superior hasta el diámetro de la almohadilla es de alrededor de 1,5 cm. Deje reposar durante 5-10 minutos. </li><li> Quitar cubreobjetos encima. Deshidratar el pad de agarosa al colocarlo en un horno de 80 º C durante 1 hora o permitir que se sientan en mesa de trabajo durante la noche. </li></ol></li><li> Prepare Mitotracker o solución LysoTracker. <ol><li> Diluir agente fluorescente en tampón de huevo. Por lo general utilizan una dilución de 1:10 de Mitotracker o LysoTracker. </li><li> La aguja de inyección se hace de un vaso capilar 1,2 OD. Saque la aguja de la inyección con un extractor de aguja. </li><li> Use una pipeta Pastuer tiró para llenar de nuevo la aguja con el colorante diluido. </li><li> Lugar de la punción con una luz libre, cámara húmeda hasta su uso. </li></ol></li><li> Pre-inyección: Configuración del microscopio y la aguja. <ol><li> Monte la aguja de inyección en un aparato de inyección. Nuestro aparato es un micromanipulador Narishige de transmisión directa montado en el escenario de un microscopio Nikon TE200 invertido equipado con capacidad de imagen DIC. </li><li> Conecte la aguja a un tubo de 1,2 mm de identificación que se conecta al regulador de presión. Ya sea con aire comprimido o nitrógeno puede ser utilizado como una fuente de presión externa. Ajuste el regulador a 20-25 psi. </li><li> Coloque 2 gotas de aceite mineral pesado (aceite de parafina) en la almohadilla de la inyección. </li><li> Coloque la almohadilla de la inyección en el microscopio y bajar la aguja en el aceite. Verifique para asegurarse de que el líquido fluye libremente de la aguja cuando se aplica presión. Aplique una presión de inyección y observar si el líquido fluye fuera de la aguja. Si no, tendrá que romper suavemente la punta de la aguja. La aguja puede ser roto por conducir con suavidad la punta en un pequeño fragmento de cubreobjetos rotos colocados en la plataforma de inyección. Después de que la aguja está fluyendo, pasar a la siguiente etapa. </li></ol></li><li> Inyección. <ol><li> Aproximadamente una hora antes de la visualización de embriones, la transferencia de los gusanos adultos jóvenes en la gota de aceite en la plataforma de inyección. Realizar la transferencia con el microscopio de disección. Utilice un alambre de platino recoger gusano con una punta afilada para la transferencia de los gusanos. </li><li> Organizar 3 a 10 gusanos para que se extiende directamente en la plataforma. Para la inyección, es más fácil si los gusanos se alinean paralelas entre sí y un poco menos de un largo gusano de distancia. Una vez que los gusanos están en la plataforma de inyección, es importante trabajar de forma rápida y completa el proceso de inyección antes de morir que los gusanos de la desecación. </li><li> Coloque el cubreobjetos con gusanos en la platina del microscopio del microscopio de la inyección. Centrarse en la parte central (raquis) del tubo de las gónadas distal. A continuación, utilice el micromanipulador para mover la punta de la aguja en el mismo plano focal. Mover el escenario horizontalmente, de modo que el gusano se pincha con la aguja. Una vez que la punta de la aguja se encuentra dentro del raquis, de ejercer presión y permitir que la gónada para llenar con la mezcla de tinte. Inyectar los dos brazos de las gónadas de los gusanos en la plataforma de inyección. </li><li> Después de la inyección, use un tira pipeta Pasteur para entregar alrededor de 0,5 ml de tampón de huevo a los gusanos. Esto evitará que mueran a causa de la deshidratación y les permiten recuperarse del procedimiento de la inyección. </li><li> Permitir a los gusanos a recuperar durante 1-2 horas a temperatura ambiente con una luz libre de cámara húmeda. </li></ol></li></ol> 3. Agarosa almohadilla para ver los embriones <ol><li> Prepare fundido agarosa al 2% en tampón de huevo. </li><li> Con una pipeta de Pasteur, poner 3 gotas de agarosa fundida sobre un portaobjetos limpio. </li><li> Lugar de diapositivas entre dos diapositivas otros que tienen una capa de cinta de etiquetado que los cubre. Estos sirven como separadores que se asegurará de que su plataforma de agarosa es el espesor correcto. </li><li> Coloque una segunda placa de microscopio limpio perpendicularmente hacia abajo sobre las gotas de agarosa. Presione hacia abajo hasta carro superior se basa en la cinta a partir de diapositivas guía. </li><li> Justo antes de que esté listo para montar embriones para la observación, quitar el carro superior. </li></ol><ol><li> Si los gusanos no se han inyectado, siga los dos pasos siguientes. De lo contrario les pase. <ol><li> Elija los gusanos adultos jóvenes de la placa que se ha preparado el día anterior. Usted debe ser capaz de ver los embriones en el interior de los adultos jóvenes. </li><li> Elige 05.20 gusanos en una placa de NGM cabeza de serie. Permitir a los gusanos a arrastrarse por la placa de cabeza de serie por unos minutos para que los gusanos se perderá la mayor parte de las bacterias que se pega a ellos. </li></ol></li><li> Obtener embriones jóvenes de los gusanos adultos <ol><li> Coloque una gota 50-20 l de buffer de huevo en el centro de un cubre objetos de vidrio de 18 mm 2 (un espesor de 1,5 cubreobjetos es preferible). </li><li> Se mueven los gusanos de la placa de cabeza de serie o una almohadilla de inyección dentro de la gota de tampón de huevo. </li><li> Cortar los gusanos abrir con una aguja hipodérmica de calibre 26. A cielo abierto, el gusano cerca de la vulva. Usted debe ver los embriones se derrame fuera de la lombriz. </li></ol></li><li> Montaje en portaobjetos de microscopio <ol><li> Invertir el portaobjetos de microscopio que se preparó con la plataforma de agarosa y se baja en el cubre con embriones. </li><li> Si lapso de tiempo prolongado es necesario, utilizar vaselina para sellar los bordes del cubreobjetos para evitar la desecación. </li></ol></li></ol> 5. Microscopía <ol><li> Encontrar los embriones adecuados. <ol><li> Lugar se deslizan sobre platina del microscopio. Escaneado con lente de 10X para encontrar embriones. </li><li> Para encontrar embriones en fase inicial, la búsqueda de los embriones que se encuentran en proceso de completar la meiosis materna. Embriones meiótica se pueden distinguir a partir de embriones después, porque no han sufrido reducción. (Después de embriones ha completado la meiosis, se puede ver una brecha importante entre la membrana celular y la cáscara del huevo en el extremo anterior.) </li><li> Una vez que haya identificado una adecuada etapas del embrión, se mueven a una lente de aumento mayor para la grabación de la embriogénesis. </li></ol></li><li> Imágenes <ol><li> En este ejemplo, estamos imaginando embriones que expresan la mCherry:: GFP y H2B:: Ub proteínas etiquetadas. Estamos usando el Zeiss LSM700 microscopio de barrido láser convencionales. </li><li> Las imágenes son recolectados a través de la lente 1.4NA 63X. Los 488 y 555 se utilizan láseres con un mínimo de potencia del láser y la máxima ganancia. AZ pila se recoge cada 10-15 segundos. Dependiendo de la extensión de photobleaching, 30-60 puntos de tiempo se recogen. Imágenes Z pila se desplomó en una imagen de la proyección máxima para la final de lapso de tiempo de vídeo. </li></ol></li></ol> 6. Los resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2852/2852fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Fecundación hasta la primera mitosis en C. elegans. <img src="/files/ftp_upload/2852/2852fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Procedimiento de microinyección. Vídeo suplementario un lapso de tiempo de vídeo de la GFP:.. Azul ubiquitina más LysoTracker en un embrión de meiótica <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2852/2852fig3.avi">Haga clic aquí para ver el vídeo.</a>

<ol>
	<li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection.">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. (18), e833-e833 (2008).</li><li>Hochbaum, D., Ferguson, A. A., Fisher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Transgenic+C.+elegans+by+Biolistic+Transformation.">Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation.</a> J Vis Exp. (42), e2090-e2090 (2010).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genetics+of+Caenrohabditis+elegans.">The Genetics of Caenrohabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li><li>Oegema, K., Hyman, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+division+WormBook.">Cell division WormBook.</a> , (2006).</li><li>McNally, K. L., McNally, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+initiates+the+transition+from+anaphase+I+to+metaphase+II+during+female+meiosis+in+C.+elegans.">Fertilization initiates the transition from anaphase I to metaphase II during female meiosis in C. elegans.</a> Dev Biol. 282, 218-230 (2005).</li><li>Sato, K., Sato, M., Audhya, A., Oegema, K., Schweinsberg, P., Grant, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+regulation+of+caveolin-1+trafficking+in+the+germ+line+and+embryo+of+Caenorhabditis+elegans.">Dynamic regulation of caveolin-1 trafficking in the germ line and embryo of Caenorhabditis elegans.</a> Mol Biol Cell. 17, 3085-3094 (2006).</li><li>Stitzel, M. L., Pellettieri, J., Seydoux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+DYRK+Kinase+MBK-2+Marks+Oocyte+Proteins+for+Degradation+in+Response+to+Meiotic+Maturation.">The C. elegans DYRK Kinase MBK-2 Marks Oocyte Proteins for Degradation in Response to Meiotic Maturation.</a> Curr Biol. 16, 56-62 (2006).</li><li>Schetter, A., Askjaer, P., Piano, F., Mattaj, I., Kemphues, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleoporins+NPP-1,+NPP-3,+NPP-4,+NPP-11+and+NPP-13+are+required+for+proper+spindle+orientation+in+C.+elegans.">Nucleoporins NPP-1, NPP-3, NPP-4, NPP-11 and NPP-13 are required for proper spindle orientation in C. elegans.</a> Dev. Biol. 289, 360-371 (2006).</li><li>Samuel, A. D., Murthy, V. N., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dynamics+during+fertilization+in+C.+elegans.">Calcium dynamics during fertilization in C. elegans.</a> BMC Dev Biol. 1, (2001).</li><li>Badrinath, A. S., White, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+patterns+of+mitochondrial+redistribution+in+the+early+lineages+of+Caenorhabditis+elegans+and+Acrobeloides+sp.+PS1146.">Contrasting patterns of mitochondrial redistribution in the early lineages of Caenorhabditis elegans and Acrobeloides sp. PS1146.</a> Dev. Biol. 258, 270-275 (2003).</li><li>Johnston, W. L., Krizus, A., Dennis, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eggshell+is+required+for+meiotic+fidelity,+polar-body+extrusion+and+polarization+of+the+C.+elegans+embryo.">The eggshell is required for meiotic fidelity, polar-body extrusion and polarization of the C. elegans embryo.</a> BMC Biol. 4, 35-35 (2006).</li><li>Parry, J. M., Velarde, N. V., Lefkovith, A. J., Zegarek, M. H., Hang, J. S., Ohm, J., Klancer, R., Maruyama, R., Druzhinina, M. K., Grant, B. D., Piano, F., Singson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGG-4+and+EGG-5+Link+Events+of+the+Oocyte-to-Embryo+Transition+with+Meiotic+Progression+in+C.+elegans.">EGG-4 and EGG-5 Link Events of the Oocyte-to-Embryo Transition with Meiotic Progression in C. elegans.</a> Curr Biol. 19, 1752-1757 (2009).</li><li>Centonze, V. E., White, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+excitation+provides+optical+sections+from+deeper+within+scattering+specimens+than+confocal+imaging.">Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging.</a> Biophys J. 75, 2015-2024 (1998).</li><li>Zinselmeyer, B. H., Dempster, J., Wokosin, D. L., Cannon, J. J., Pless, R., Parker, I., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+microscopy+and+multidimensional+analysis+of+cell+dynamics.">Two-photon microscopy and multidimensional analysis of cell dynamics.</a> Methods Enzymol. 461, 349-378 (2009).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Después de la fusión con el espermatozoide, el cigoto sufre una serie de eventos dinámicos. Estos eventos transformar el ovocito de una célula relativamente estable en el embrión en rápido desarrollo. En muchos organismos, reordenamientos citoplasmática son fundamentales para el establecimiento de la polaridad de embrionario y para la activación del huevo. El C. embrión elegans es una excelente oportunidad para la observación de estos primeros eventos de la activación del huevo y la embriogénesis. El embrión es transparente y se producen los eventos tempranos de desarrollo relativamente rápido después de la fecundación. C. elegans investigadores han generado muchas tensiones útil transgénicos que expresan proteínas marcadas con fluorescencia que participan en el desarrollo temprano. El uso de estas cepas, junto con RNAi o mutantes proporciona un sistema eficaz para la disección de las vías moleculares que subyacen al desarrollo de un organismo multicelular (5, 6, 7, 8). En este artículo de vídeo presenta un enfoque práctico a la utilización de estas herramientas y técnicas para registrar los acontecimientos durante la embriogénesis temprana en C. elegans. La madurez C. ovocito elegans es detenido en la profase de la meiosis I y se fertiliza en la espermateca de la hermafrodita adulto. Después de la fecundación, el óvulo avanza a través del resto de la meiosis I y II. Estas etapas se pueden observar con la etiqueta fluorescente histona H2B (5). Durante la finalización de la meiosis materna, el ADN de los espermatozoides se mantiene condensada (ver Figura 1). Tras la finalización de la meiosis, el ADN materno y paterno se convierte en la forma y decondensed dos pronúcleos. El pronúcleo materno migra hacia el pronúcleo paterno y se unen cerca del centro del embrión. Mitosis rápidamente sobreviene después de la reunión pronuclear. Todos estos eventos se producen en menos de una hora. Por lo tanto, time-lapse microscopía de esta secuencia de eventos puede llevar a cabo fácilmente. La realización de esta técnica requiere cierta facilidad en el cultivo de nematodos, así como conocimientos básicos de microscopía, además de acceso a un microscopio confocal. El ejemplo que aquí se presenta utiliza un transgénico C. elegans cepa que expresa dos proteínas fluorescentes, GFP:: ubiquitina y mCherry:: H2B. Un microscopio láser confocal de barrido se utiliza para observar la localización dinámica de estas dos proteínas. Además, mostramos que la inyección de LysoTracker etiqueta fluorescente se puede utilizar para seguir el destino de los lisosomas en el embrión tras la fecundación. La inyección de un rastreador de la etiqueta también se puede realizar para la visualización de las concentraciones de calcio mitocondrial o local (9). En teoría, el protocolo de la inyección podría ser usado para ver cualquier tipo de molécula marcada con fluorescencia en el embrión. Esto puede incluir la etiqueta de pequeñas moléculas, proteínas, lípidos, etc En algunos casos, puede que no sea necesario inyectar en realidad seguidores etiquetados como los gusanos fácilmente captación algunos colorantes como MitoTracker (10). Sin embargo, hemos probado las dos remojo y la inyección de LysoTracker y han encontrado mejores resultados con la inyección para la visualización en los embriones. Consideraciones técnicas: Los problemas técnicos planteados con este procedimiento incluyen la técnica de microinyección, así como la dificultad en las imágenes de embriones muy tempranos. En cuanto a las microinyecciones, el espesor de la plataforma de inyección de agarosa es fundamental para el éxito de las inyecciones. Si la superficie es demasiado gruesa, los gusanos se dessicate y mueren rápidamente. Si la superficie es muy delgada, los gusanos no se adhieren a la plataforma durante el proceso de inyección. Los embriones pueden ser sensibles a las condiciones ambientales como la temperatura y las condiciones de amortiguación. Embriones de tipo salvaje debe iniciar descondensación del ADN de los espermatozoides y la migración pronuclear en un minuto o menos para completar la meiosis II (4). A los 20 minutos, el primero debe empezar la citocinesis. Si los embriones son expuestos a la intensidad del láser muy alta o se sobrecalienta o se ha roto durante el montaje, este proceso puede ser interrumpido. Embriones detendrá el desarrollo. Si esto ocurre, el experimento debe ser repetido con la disminución de la potencia del láser o una gruesa almohadilla de agarosa. Embriones de C. elegans no secretan su cáscara de huevo hasta que poco después de la fecundación. Durante el corto período de tiempo entre la fertilización y la secreción de la cáscara del huevo, los embriones no son viables fuera de la madre (11). Algunos laboratorios han evitado este desafío mediante la imagen embriones en el útero (5, 12). En el útero de imagen ofrece ciertas ventajas, como la capacidad de capturar eventos que ocurren durante o justo después de la fecundación. Sin embargo, esta técnica requiere el uso de un sistema de microscopía que permite obtener imágenes de tejidos profundos. Sistemas como el de dos fotones o múltiples fotones son especialmente adecuados para ello (13, 14). Cuando se utiliza un láser convencionales de detección de giro o microscopio confocal de disco, las mejores imágenes se obtienen de embriones que hahan sido cortados de los gusanos adultos como se describe aquí. Consideraciones sobre el sistema de imagen: El tipo de sistema de imagen confocal utiliza depende de las necesidades de los usuarios. En general, los sistemas de escaneo láser se recomienda si se desea obtener imágenes con la mayor resolución posible. Por otro lado, haciendo girar los sistemas de disco son más adecuados para los procesos de formación de imágenes muy dinámicas como la adquisición de la imagen es relativamente rápida y photobleaching / fototoxicidad se reduce. Los parámetros de imagen específico variará en función del diseño experimental y el sistema de imagen confocal emplea. En imágenes multidimensionales, es necesario considerar el número de canales, planos focales, y el tiempo de puntos recogidos. Debido a los efectos limitantes de photobleaching y fototoxicidad, un número finito de imágenes pueden ser adquiridos en cualquier experimento dado. Por lo tanto, si decide aumentar el número de canales que se adquirió, es probable que la necesidad de reducir el número de planos focales y / o puntos de tiempo y viceversa. El número total de imágenes que pueden ser adquiridos se verá influenciada por la intensidad de la fluoróforo se va a examinar, así como la sensibilidad de la microscopía confocal se utiliza. Fluoróforos más intenso y más instrumentos sensibles se requieren tiempos de exposición y por lo tanto producen menos photobleaching y fototoxicidad. Un gran número o sistemas de imágenes están disponibles. Vamos a dar detalles sobre los sistemas que se han utilizado en nuestros propios laboratorios. Para los embriones del gusano de imagen haciendo girar la microscopía confocal de disco, se utiliza un microscopio Nikon TE2000U invertida equipada con un objetivo 60X/1.4 NA Plan de Apo. El microscopio está conectado a una unidad de Yokogawa CSU10 disco giratorio, una Hamamatsu C9100-13 EM CCD de la cámara, y una espectral de Investigación Aplicada LMM5 módulo láser fusión con cuatro láseres de estado sólido con salida a 405, 491, 561 y 655 nm. El uso de este sistema podemos capturar uno o dos canales, entre seis y doce aviones de coordinación, y 25 a 50 puntos de tiempo (de 30 a 60 segundos de intervalo). Un tiempo de exposición típica es de 100 a 200 milisegundos. Para los embriones de imágenes con microscopía confocal de barrido láser, se utiliza un Zeiss LSM700 equipado con dos canales y cuatro láseres de estado sólido (405, 488, 555 y 635 nm). Este sistema está conectado a un microscopio Zeiss Axio Observador invertido con un Plan de Apo-objetivo 63X/1.4NA utiliza para obtener imágenes del embrión. El sistema utiliza el software Zeiss ZEN para la adquisición de imágenes, que también provee el procesamiento de imágenes y análisis limitados. Cuando la imagen con dos fluorocromos, por lo general se reúnen 1-5 planos focales (~ 0,5 m de distancia) y cobrar una pila Z cada 15 segundos. Las colecciones se continuó hasta photobleaching significativo se ha producido. Para generar la final de lapso de tiempo de vídeo, imágenes Z stack se consolidan mediante la herramienta de máxima proyección en el software de ZEN. Los vídeos son exportados desde el software como archivos AVI.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Composición </th></tr><tr><td> Huevo Buffer </td><td></td><td></td><td> Hepes pH 7,2 5 mM, NaCl 110 mm, 4 mm de acetato de KCl, Mg 5 mM, 5 mM de CaCl2 </td></tr><tr><td> Mitotracker </td><td> Invitrogen </td><td> M-7512 </td><td></td></tr><tr><td> LysoTracker </td><td> Invitrogen </td><td> L-7525 </td><td></td></tr><tr><td> Inyección capilar pipeta </td><td> Harvard Apparatus, Kent, Reino Unido </td><td> GC120F-10 </td><td></td></tr><tr><td> Extractor de agujas </td><td> Kopf </td><td> Modelo 700C </td><td></td></tr><tr><td> Microinyector aparato </td><td> Tritech Investigación </td><td> Minj-1 regulador de microinyección </td><td></td></tr></tbody></table>

time-lapse microscopy of early embryogenesis in caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans ha sido utilizada a menudo como un sistema modelo en estudios de los primeros procesos de desarrollo. La transparencia de los embriones, los recursos genéticos, y la relativa facilidad de transformación, son cualidades que hacen de C. elegans es un modelo excelente para la embriogénesis temprana. Basada en el láser microscopía confocal y las etiquetas de marcado con fluorescencia permiten a los investigadores de atenerse a las estructuras celulares y las proteínas del embrión en desarrollo. Por ejemplo, se puede seguir orgánulos específicos, tales como los lisosomas o las mitocondrias, el uso de tintes marcados con fluorescencia. Estos colorantes pueden ser entregados a los primeros embriones por medio de microinyección en la gónada de adultos. Además, la localización de las proteínas específicas se pueden seguir usando etiquetas fluorescentes de proteínas. Algunos ejemplos se presentan a continuación demuestran el uso de un colorante fluorescente lisosomales, así como marcado con fluorescencia proteínas histonas y ubiquitina. La histona etiqueta se utiliza para visualizar el ADN y así identificar la fase del ciclo celular. GFP-etiquetados ubiquitina revela la dinámica de las vesículas ubiquitinadas en el embrión temprano. Las observaciones de los lisosomas etiquetados y GFP:: ubiquitina puede ser usado para determinar si existe colocalización entre las vesículas ubiquitinated y lisosomas. Una técnica para la microinyección del colorante lisosomales se presenta. Técnicas para la generación de cepas transgenenic se presentan en otras partes (1, 2). Para las imágenes, los embriones se cortan de los nematodos adultos hermafroditas y montado en un 2% de agarosa almohadillas seguido por microscopía lapso de tiempo en un láser estándar microscopio confocal de barrido o de un microscopio confocal de disco giratorio. Esta metodología ofrece para la visualización de alta resolución de la embriogénesis temprana.

Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

En este artículo se describe una técnica para la visualización de los primeros eventos de la embriogénesis en el nematodo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt;.

Time-lapse microscopía de embriogénesis temprana en Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

time-lapse-microscopy-of-early-embryogenesis-in-caenorhabditis-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

17.9K vistas.  University of Alabama in Huntsville. En este artículo se describe una técnica para la visualización de los primeros eventos de la embriogénesis en el nematodo Caenorhabditis elegans.

Video: Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Okay, so what I'd like to do today is to show you how to construct a flow chamber, a fusion chamber for imaging on an upright microscope. What then I then do is I create two spaces using film. So what I do is I take the para film, I cut it into small strips.Next I'm going to, this will basically form the channels for the, the walls, and I dry them with a tilted air. I put the cover slip on top of the para, And here's the finished. Then I heat it on a heat block to melt the param and basically create a seal.So what this is, is the, the cover glass here, and then on top of the cover glass is two layers of phim as you see right here. And then on top of this, again, there's a, it's a 22 by two two mil meter cover slip. This one right here, which I pressed against the param to fall the seal.Okay, so the liquid goes in in one direction here and I can suck it out with a filter paper here in this direction. And I'll show you how to do that in a bit. So what I like to do is I like to put it in a humidified chamber, which is very simple.Take two kind of elevated strips and have a filter of paper underneath. And to keep it noisy as I, I put the cover, cover slip on the flow chamber on. Now the way you introduce a solution to the chamber is that you just put the pipet tip at the entrance of the chamber and you just split.Now what I do is I incubate the chamber with the lid closed for 10 minutes. What I usually do to suck the liquid out from the other side is to use it, get a filter paper and cut it into thin strips like this. And I take one of these thin strips and I simultaneously apply the solution into the entrance while putting the filter paper at the exit to suck the exchange, the solution.So you'll see the liquid flowing through the solution. And then I wait for five minutes for the mid close. Now what I'm ready to do is to actually put that the actin it and the actin, I actually have to polymerize, I polymerize inside the flow chamber and it's just the same procedures before.So because like this, and then now that the action is polymerized, I wash out all the un excess un polymerized action using a large volume of just buffer. So here I have about a hundred microliters and it's a few reaction chamber volumes worth of buffer. Just, you know, when the filter paper becomes saturated, I have to change the direction.Okay?And so I'm ready to do imaging with this. So perfusion chamber with actin attached to it. Now I take the slide, mount it under the microscope, and since I'm imaging with an oil objective, I'm gonna put some immersion oil on the top surface of the cover, grass touch, such so assess solution or protein or anything on acting inside.So what I do is I can actually exchange the solution side while I'm doing the time lapse imaging. As such.

Monitoreo de actina desmontaje con la Microscopía de Time-lapse

Investigación

Biología

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Time-lapse de imágenes de mitosis después de la transfección de siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

El aislamiento y la In vitro La activación de Caenorhabditis elegans El esperma

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During directional migration, cells move rapidly in response to an extracellular chemotactic signal, or in response to intrinsic cues 3 provided by the basic motility machinery. Random migration occurs when a cell possesses low intrinsic directionality, allowing the cells to explore their local environment.
Cell migration is a complex process, in the initial response cell undergoes polarization and extends protrusions in the direction of migration 2. Traditional methods to measure migration such as the Boyden chamber migration assay is an easy method to measure chemotaxis in vitro, which allows measuring migration as an end point result. However, this approach neither allows measurement of individual migration parameters, nor does it allow to visualization of morphological changes that cell undergoes during migration.
Here, we present a method that allows us to monitor migrating cells in real time using video - time lapse microscopy. Since cell migration and invasion are hallmarks of cancer, this method will be applicable in studying cancer cell migration and invasion in vitro. Random migration of platelets has been considered as one of the parameters of platelet function 4, hence this method could also be helpful in studying platelet functions. This assay has the advantage of being rapid, reliable, reproducible, and does not require optimization of cell numbers. In order to maintain physiologically suitable conditions for cells, the microscope is equipped with CO2 supply and temperature thermostat. Cell movement is monitored by taking pictures using a camera fitted to the microscope at regular intervals. Cell migration can be calculated by measuring average speed and average displacement, which is calculated by Slidebook software.

This method allows monitoring of cells in real time and quantitative measurements of different cell migration parameters such as speed, displacement, and velocity. Unlike the traditional methods, this real time approach is not based on endpoint quantitative migration measurements; instead it allows monitoring and calculating different parameters continuously.

Análisis cuantitativo de la migración desordenada de las células mediante microscopía de Time-lapse vídeo

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos de sincronización y de observación

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

El uso de microscopía lapso de tiempo para Visualizar anoxia inducida animación suspendida en<em&gt; C. elegans</em&gt; Los embriones

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

Extracción y análisis de prostaglandina en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

Visualización de Desarrollo Craneofacial en los SOX10: Kaede pez cebra transgénico Línea Usando Time-lapse microscopía confocal

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and several essential mitochondrial polypeptides. Mitochondrial nucleoids divide and distribute within the dynamic mitochondrial network that undergoes fission/fusion and other morphological changes. High resolution live fluorescence microscopy is a straightforward technique to characterize a nucleoid&#39;s position and motion. For this technique, nucleoids are commonly labeled through fluorescent tags of their protein components, namely transcription factor a (TFAM). However, this strategy needs overexpression of a fluorescent protein-tagged construct, which may cause artifacts (reported for TFAM), and is not feasible in many cases. Organic DNA-binding dyes do not have these disadvantages. However, they always show staining of both nuclear and mitochondrial DNAs, thus lacking specificity to mitochondrial nucleoids. By taking into account the physico-chemical properties of such dyes, we selected a nucleic acid gel stain (SYBR Gold) and achieved preferential labeling of mitochondrial nucleoids in live cells. Properties of the dye, particularly its high brightness upon binding to DNA, permit subsequent quantification of mitochondrial nucleoid motion using time series of super-resolution structured illumination images.

The protocol describes specific labeling of mitochondrial nucleoids with a commercially available DNA gel stain, acquisition of time lapse series of live labeled cells by super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM), and automatic tracking of nucleoid motion.

Etiquetado específico de nucleoides mitocondriales para microscopía de iluminación estructurada de lapso de tiempo

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits obesity and many associated diseases including cardiovascular disorders, type II diabetes, and cancer. To advance the current understanding of lipid metabolic regulation, quantitative methods to precisely measure in vivo lipid storage levels in time and space have become increasingly important and useful. Traditional approaches to analyze lipid storage are semi-quantitative for microscopic assessment or lacking spatio-temporal information for biochemical measurement. Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology that enables rapid and quantitative detection of lipids in live cells with a subcellular resolution. As the contrast is exploited from intrinsic molecular vibrations, SRS microscopy also permits four-dimensional tracking of lipids in live animals. In the last decade, SRS microscopy has been widely used for small molecule imaging in biomedical research and overcome the major limitations of conventional fluorescent staining and lipid extraction methods. In the laboratory, we have combined SRS microscopy with the genetic and biochemical tools available to the powerful model organism, Caenorhabditis elegans, to investigate the distribution and heterogeneity of lipid droplets across different cells and tissues and ultimately to discover novel conserved signaling pathways that modulate lipid metabolism. Here, we present the working principles and the detailed setup of the SRS microscope and provide methods for its use in quantifying lipid storage at distinct developmental timepoints of wild-type and insulin signaling deficient mutant C. elegans.

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows selective, label-free imaging of specific chemical moieties and it has been effectively employed to image lipid molecules in vivo. Here, we provide a brief introduction to the principle of SRS microscopy and describe methods for its use in imaging lipid storage in Caenorhabditis elegans.

Imágenes Libres De Etiquetas De La Dinámica De Almacenamiento De Lípidos En Caenorhabditis elegans Usando Microscopía De Dispersión Raman Estimulada

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...

Time-lapse microscopía de embriogénesis temprana en Caenorhabditis elegans

Resumen

Explorar más videos

Capítulos en este video