Agradecemos a los metabolómica dirigida UAB y Laboratorio de Proteómica, que ha sido apoyado en parte por el Centro de Investigación de Enfermedades UAB Skin (P30 AR050948 Elmets a C.), el Centro de Lesiones de O&#39;Brien Renal Aguda UAB-UCSD (P30 DK079337 a A. Agarwal ) y el Centro de Salud Pulmonar UAB (HL114439 R01, R01 HL110950 de JE Blalock). Soporte para el espectrómetro de masas era de una subvención compartida Instrumentación CNRR (S10 RR19261 de S. Barnes). También queremos agradecer a Ray Moore para soporte técnico. C. elegans cepas fueron proporcionados por el Centro de Genética Caenorhabditis, que es financiado por el NIH. Este trabajo fue apoyado por el NIH (R01GM085105 al MAM, incluyendo un suplemento administrativa ARRA).

El protocolo que se describe a continuación se divide en tres secciones: cultura gusano, la extracción de la prostaglandina, y el análisis de la prostaglandina. Como se ha señalado, hay varios puntos cuando las muestras se pueden almacenar temporalmente a -80 ° C o -20 ° C. 1. Gusano Cultura Recomendamos aproximadamente 6 g de gusanos mixtos etapa para LC-MS/MS integrales. Esto debería proporcionar suficiente material para la detección de al menos seis inyecciones separadas. Para la cuantificación de los PGs conocidos por MRM en una sola inyección o dos, 1-2 g son suficientes. El análisis de extractos de cultivos sincronizados que consisten en una etapa específica también es posible. Hasta 4 cepas diferentes pueden ser cultivadas simultáneamente. Por ejemplo, un control de tipo salvaje y tres cepas mutantes diferentes. <ol><li> Preparar 65 X-grandes (16 cm) NGM placas y bacterias concentradas de alimentación suplementaria. Utilice NA22 bacterias para la siembra. Para que las bacterias concentradas de alimentación suplementaria, grow al menos cuatro litros de NA22 en medio LB durante 16-24 horas. Centrifugar, eliminar el sobrenadante y volver a suspender las bacterias en 100 ml de tampón M9. Puede ser requerido de 200 a 400 ml de esta solución bacteriana concentrada para cada cepa gusano. Almacenar a 4 ° C. </li><li> Iniciar culturas gusano en 5 X-grandes placas. Crecer gusanos de aproximadamente 3 a 4 generaciones hasta platos están llenos de adultos grávidas. Bacterias concentradas deben añadirse a las placas para evitar el hambre, según sea necesario (~ 1 ml / placa y dejar que se seque por completo antes de volver a la tapa). </li><li> Lave grávidas hermafroditas en platos con tampón M9 y recoger los gusanos en un ml tubo cónico de polipropileno 50. </li><li> Permitir hermafroditas grávidas se depositen en la parte inferior (por lo general alrededor de 3-5 min). Aspirar el sobrenadante, incluyendo bacterias, huevos y gusanos etapa larval. Volver a suspender en 15 ml de tampón M9 y mezclar suavemente. </li><li> Transferir 200 l de suspensión de tornillo sin fin a cada una de 60 placas sembradas NGM. Dispersar los gusanos a través de las placas. Mantenga solución gusano mezcladosasí hasta que todos los platos se han sembrado para asegurarse de que reciben aproximadamente el mismo número de gusanos. </li><li> Suplemento por bacterias concentradas según sea necesario (~ 1 hr período ml/plate/12 a 24) para evitar el hambre. Permitir platos se sequen al aire antes de volver a las tapas. Gusanos crecer durante 2-4 generaciones, dependiendo de la cantidad original de gusanos cabezas de serie, o hasta que las placas están llenas de adultos grávidas. </li><li> Placas gusano cosecha una cepa a la vez. Lavar los gusanos de las placas con tampón de M9 y recoger en tubos de polipropileno de 50 ml (por ejemplo, 6 tubos). Utilice M9 buffer para lavar un plato, a continuación, transferir el tampón gusano lleno a la siguiente placa. Después de lavar un número (por ejemplo,. 10 º) de las placas, la transferencia de la memoria intermedia de gusano lleno al tubo de 50 ml. Llenar el tubo hasta el tope con tampón M9. Repetir el lavado para el resto de las placas. </li><li> Como los adultos grávidas se depositan en la parte inferior en 5-6 min, eliminar el sobrenadante (~ 35 ml) y consolidar en uno o dos tubos. Llenar los tubos de 50 ml con frM9 buffer esh, deje reposar durante 3 a 5 minutos, y retirar el sobrenadante dejando adultos grávidas. Repita 3 veces o hasta que el líquido sobrenadante transparente. </li><li> El uso de un gran pipeta Pasteur de boquilla, como la transferencia de muchos gusanos como sea posible para dos tubos cónicos de 15 ml de polipropileno. Centrifugar a 1.000 FCR (~ 3500 rpm en CentraSL2) durante 5 min en una centrífuga clínica. Aspirar el sobrenadante y repetir hasta que todos los gusanos se transfieren y se sedimentaron en el mismo tubo. Retire tanto sobrenadante como sea posible y gusanos almacenar a -80 ° C. Repita el procedimiento para todas las cepas. </li></ol> 2. Extracción prostaglandina Los reactivos necesarios para la extracción se muestran a continuación. El método se modificó a partir de la de Golovko y Murphy 17 e incluye extracción con acetona seguida por la purificación líquido-líquido, lo que mejora la sensibilidad LC-MS/MS. Una bala mezclador 5 de homogeneizador se utiliza en el procedimiento, aunque los resultados similares se pueden obtener con un homogeneizador Dounce. Hydroxytolue Butylatedne (BHT) y la evaporación bajo nitrógeno (N 2) de gas se utiliza para evitar la oxidación. Toda la cristalería debe ser siliconado (Sigmacote) para reducir la unión de lípidos. La extracción con disolventes orgánicos se debe realizar en una campana química. <ol><li> Pesar un tubo cónico de 50 ml de polipropileno. Transferir aproximadamente 6,0 g de gusanos congelados desde el tubo cónico de 15 ml se almacenó a -80 ° C por el corte a través del tubo con una hoja de afeitar caliente cerca de la marca de 6,5 ml. Una espátula de metanol-purificada puede usarse para eliminar el gusano de pellets congelados de la parte inferior del tubo. Al cortar a través de la pastilla para recuperar la parte inferior, las larvas de gusano menos densas y las bacterias residuales desde la parte superior de la pastilla se quedan atrás. </li><li> Transfiera los gusanos congelados al tubo cónico de 50 ml previamente pesado. Si se están procesando muestras múltiples, utilice la misma cantidad (6,0 g) de tejido para estudios comparativos. Como los gusanos deshielo hasta formar una pasta, añadir o eliminar los gusanos con la espátula para obtener la masa deseada. Opcional: add 1,00 ng de PGF estándar 2α-d4 como un control interno para la eficiencia de la extracción. </li><li> Añadir 12 ml de hielo-acetona fría 02:01 / solución salina con 0,005% de BHT a la suspensión gusano y mezclar bien con un vórtex. Dispensar 1,5 ml de la suspensión de gusano a cada uno de los doce tubos de plástico de 5 ml autoportantes para uso en la Batidora bala. </li><li> Añadir 0,7-0,8 ml de 0,5 mm de diámetro ceria estabilizada perlas de óxido de circonio a cada tubo 5 ml. Cierre las tapas bien y cargar los 12 tubos en el Bullet mezclador 5 homogeneizador. Ejecutar la batidora durante 3 min a velocidad 8-9 y colocar los tubos en hielo. Asegúrese de cerrar las tapas muy bien o el contenido podría derramarse. Consulta 10 l de homogeneizado de un tubo en un portaobjetos utilizando un estereoscopio. Debe haber muy pocos gusanos intactos restantes. Repita a la misma velocidad durante un minuto, si es necesario. </li><li> Uniformemente transferir los homogeneizados de cuatro tubos de vidrio cónico de 10 ml con un 9 &quot;pipeta Pasteur. Evite cuentas de transferencia. Lavar las perlas de tres tubos Sequéntially con 1 ml de 1:2 de acetona / solución salina que contiene BHT. Repita el proceso para otros tubos hasta que se lavan todas las bolas. Transferir la solución restante (~ 4 ml) a los tubos de vidrio de 10 ml y se colocan en hielo. </li><li> Centrifugar los tubos de vidrio de 10 ml a 4 ° C en una centrífuga clínica a ~ 1.000 xg durante 10 min. Transferir el sobrenadante de cada tubo a un tubo cónico de 10 ml de vidrio limpio. </li><li> En una campana química, añadir un volumen igual de hexano a cada tubo de vidrio de 10 ml. Por ejemplo, añadir 3,5 ml de hexano a 3,5 ml de acetona / solución salina. Vortex a velocidad máxima durante 30 segundos. </li><li> Centrifugar los tubos de vidrio de 10 ml a 4 ° C en una centrífuga clínica a ~ 1.000 xg durante 10 min. Desechar la fase superior que contiene hexano y los lípidos de carga neutra. </li><li> Se acidifica la fase inferior a pH 3,5 con ácido fórmico al 2 M (aproximadamente 100 a 150 l). Prueba de pH con tiras de pH. </li><li> Añadir un volumen igual de cloroformo a cada tubo. Vórtice a la máxima velocidad durante 30 segundos y centrifugar los tubos a 4 º C ina centrífuga clínica a ~ 1.000 xg durante 10 min. </li><li> Retire y deseche la fase acuosa superior. Introduzca la punta de la pipeta a través de cualquier interfase lechosa residual de la fase inferior de cloroformo, evitando la interfase. Recoger la fase inferior de cada uno de los 4 tubos de 15 ml a un tubo cónico de vidrio limpio. Incubar a -20 ° C durante al menos 24 horas. En este punto, el extracto puede ser almacenado a -20 ° C durante hasta dos semanas. </li><li> Tome el extracto del congelador y desechar la capa superior acuosa lechosa restante, si está presente. Transferir la fase de cloroformo a un vial de vidrio de ½ Dram marcado recubierto de teflón con una nueva pipeta Pasteur. En una campana química, se evapora la fracción soluble en cloroformo hasta sequedad bajo un flujo suave de gas N 2. El extracto seco se puede almacenar a -20 ° C durante hasta 2 semanas. Un esquema general utilizado para la extracción y el análisis de PG se muestra en la Figura 1. </li></ol> 3. Análisis prostaglandina <ol><li> Prepare Stocksoluciones de prostaglandinas de referencia individuales, tales como PGF 2α o PGF 2 α-d4 (1 g / ml) en metanol y diluir con metanol: agua (08:02 v / v) para obtener una solución de trabajo. Preparar una serie de diluciones (100, 10, 1, 0,1, 0,01 ng / ml) para generar una curva estándar. </li><li> Añadir 200 l de metanol: agua (08:02 v / v) a la C. seca elegans extracto lipídico (s) y mezclar bien. Si se extrajo menos de 6 g de tejido sin fin, el extracto seco se debe resuspendió en menos volumen de metanol: solución de agua. </li><li> Preparar la fase móvil que consta de 0,1% de ácido fórmico en agua [A] y acetonitrilo que contiene ácido fórmico al 0,1% [B]. </li><li> Configure el inyector automático a 4 ° C y colocar los viales de muestra en un 70-count 1.5 bastidor ml frasco. </li><li> Equilibrar la Sinergia hidro columna RP-C18 con 0,1% de ácido fórmico a una velocidad de flujo de 0,2 ml / min durante aproximadamente 5 min. </li><li> Inyectar la muestra (20-50 l) en la columna. Realizar gradiente de elución de inicioING con 10% de B y va hasta el 80% de B 0-11 min, 80-100% de B 11-14 min, y volviendo de nuevo a 10% de B en 16 min. El tiempo de ejecución total es de 20 min. Los tiempos de retención de 13 patrones auténticos se muestran en la Tabla 1 para la referencia 3. </li><li> Introducir el efluente de la columna en el espectrómetro de masas usando una interfaz ESI operativo en el modo de iones negativos. El nitrógeno se usa como un nebulizador y gas de cortina (CUR = 10). El gas de colisión, la energía de colisión, y la temperatura se fijó en 10, -35 eV y 600 ° C, respectivamente. Desagrupación potencial (DP), la energía de colisión (CE), y el potencial de salida de la célula (CXP) se fijó en -90, -35 y -10, respectivamente. </li><li> En las exploraciones de la encuesta (scans Q1), utilice el modo de iones negativos en el rango de masa de m / z 315 a 360 para la mayoría de PGs (Figura 2). El rango puede ser alterada, dependiendo de la masa del compuesto (s) de interés. Extraer iones de corriente de iones totales (TIC) de LC-MS cromatogramas de iones y determinar si la extracciónted iones corresponden a los iones desprotonados o aducto, o a los fragmentos de iones. </li><li> Para los experimentos de GRM, la transición de masas m / z 355/311 se utiliza para detectar la clase F1, m / z 353/193 se utiliza para la clase F2, y m / z 351/193 o 351/191 se utiliza para la clase F3 (Figura 3). MRM también se utiliza para detectar el patrón interno (por ejemplo, m / z 357/197 para la PGF 2α-d4) y para generar la curva estándar. Ver Murphy et al. Para obtener información adicional en la página transiciones de masa 18. </li><li> Para los experimentos de MS / MS, usar m / z 355 para la clase F1, m / z clase F2 353for, y m / z 351for F3 PGs clase. C. elegans datos de MS / MS para PGs de la serie F está disponible en la figura 4 y en la Tabla 2 3,16. Datos de MS / MS de eicosanoides mamíferos está disponible en <a href="http://www.lipidmaps.org" target="_blank">www.lipidmaps.org</a> . </li><li> Procesar los datos analíticos que utilizan Analyst de software (Versión 1.4.2, Applied Biosystems). </li></ol>

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Los autores no tienen ningún conflicto de intereses.

Se describe un procedimiento para la extracción y el análisis de los eicosanoides, centrándose en PGs de la serie F. Hay varias partes del procedimiento que puede ser problemático. En primer lugar, es fundamental que los cultivos de gusanos no mueren de hambre, como el hambre puede alterar el metabolismo PG. Para la alimentación complementaria, se recomienda NA22 bacterias en lugar de los OP50 bacterias más comúnmente utilizadas por NA22 alcanza una mayor densidad. Sin embargo, la cepa NA22 carece de resistencia a los antibióticos y es más susceptible a la contaminación. En segundo lugar, los gusanos sintetizar isómeros PG individuales en abundancia bajo en relación con los tejidos de mamíferos. Esto puede ser debido, en parte, a la redundancia entre los numerosos isómeros. Recomendamos unos 6 g de tejido para análisis completo y señales más fuertes. Menos tejido (1-2 g) se puede utilizar si el extracto seco se resuspendió en menos metanol: solución de agua para aumentar la concentración de PG. Sin embargo, se pueden realizar sólo una o dos inyecciones. El límite de detección de nuestro sistema de LC-MS/MS es de aproximadamente 10 pgPGF 2α / ml. Un ml de densas gusanos etapa mixta (aproximadamente 1 g) se obtiene más o menos 25-50 pg de CePGF2. Sistemas de espectrometría de masas más sensibles pueden reducir la cantidad de tejido necesario para el análisis del gusano. En tercer lugar, las diferencias en la eficiencia de extracción PG entre las muestras pueden provocar resultados variables. Hemos encontrado que la eficiencia de extracción es muy similar cuando los tejidos se extraen en paralelo. Para determinar la eficiencia, añadir 1,0 ng de PGF 2α-d 4 en la etapa de homogeneización como un control interno. MRM con la transición de masa m / z 357/197 se utiliza para medir la concentración de PGF 2α-d4 relación a un 1 ng / ml solución estándar. Luego se calcula el importe de PGF 2α-d4 perdido durante la extracción. Los parámetros de cromatografía y transiciones de masa que incluimos pueden ser alterados para detectar otras PGs y eicosanoides. A pesar de considerables esfuerzos, no hemos sido capaces de identificar la serie D o E-sers PGs en los extractos 17. Por otra parte, no hemos detectado 8-iso PGF 2α y 8-iso PGE2 que son característicos de la libre peroxidación iniciada por radicales, que genera una mezcla selectiva de PG estereoisómeros 19. Ya sea que los gusanos sintetizan otros tipos PG no se conoce. Los endocannabinoides y diversos epoxi e hidroxi metabolitos de los ácidos araquidónico y eicosapentaenoico se han encontrado en C. elegans extrae 5,7,20,21. Se recomienda el uso de ambos MRM y MS / MS en comparación con patrones auténticos para la cuantificación e identificación, respectivamente. Para nuevos eicosanoides, estos análisis se deben combinar con un estudio comparativo de los mutantes de grasa, que son deficientes en la síntesis de PUFA enzimas 22, así como un ensayo funcional, si es posible. Una advertencia para el análisis de mutantes de grasa es que pequeñas cantidades de PUFAs presentes en los gusanos son suficientes para la síntesis de PG. Por ejemplo, la grasa-2 (wa17) mutantestener una pequeña cantidad de la actividad desaturasa D12 (~ 5% de tipo salvaje 22) y estos mutantes todavía producen PGs 6. grasa-3 (WA22) y grasa-4 (WA14) mutantes no pueden sintetizar las PGs derivadas de los ácidos araquidónico y eicosapentaenoico 16 . También hemos encontrado que los mutantes de grasa para compensar la pérdida de clases por AGPI hasta la regulación de la síntesis de PG de las clases restantes. Por ejemplo, grasa-3 (WA22) mutantes no pueden sintetizar la mayoría de las PGs derivadas de PUFA 20-carbono. En cambio, parece que hasta de regular PGs nuevos derivados de 18 carbonos PUFAs 16. Hasta la fecha, no hemos identificado una C. elegans cepa que es completamente deficiente en la síntesis de PG. Es posible que las PGs son esenciales para el crecimiento o el desarrollo.

Las prostaglandinas (PGs) son una clase importante de hormonas de lípidos que se han investigado e implicado en la regulación de la reproducción, la inmunidad, y el desarrollo en una amplia gama de organismos 12-14 ampliamente. PGs son ideales para sistemas completos análisis de biología, ya que comprenden una serie de lípidos derivados de un precursor común (s). El nematodo C. elegans es uno de los organismos modelo más utilizado para abordar las cuestiones fundamentales de la genética y la biología de sistemas. Hemos demostrado que C. elegans sintetiza PGs de la serie F que guían espermatozoides móviles de los ovocitos 3,6,16. PGs de la serie F derivadas de PUFA de 20 carbonos con tres, cuatro, y cinco dobles enlaces, que comprende la F1, F2, F3 y clases, respectivamente, se han identificado 3,16. Estos PGs se sintetizan independiente de las enzimas ciclooxigenasa, sin embargo, estereoisómeros PGF 2α 1α y PGF son todavía GEnerated. Para los análisis cualitativos y cuantitativos de C. elegans PGs, LC-MS/MS es un potente y sensible técnica analítica. Antes de realizar este análisis, es importante desarrollar un método de extracción optimizado debido a que el rendimiento del proceso analítico depende en gran medida de la calidad del extracto. La cromatografía líquida y espectrometría de masas sólo pueden proporcionar masa anticipado a carga (m / z), así como la forma de pico deseable y tiempo de retención del ion primario PG. Perfiles metabólicos de las PGs en C. elegans es una tarea difícil que requiere diferentes estrategias de adquisición de MS. Escaneo o exploración completa encuesta CL-EM (Q1 escaneado) tiene la ventaja de asegurar que las PGs más ionizables generarán una respuesta de espectrometría de masas. Si bien la exploración encuesta proporciona información útil en el perfil total de PGs en relación con el de tipo salvaje y mutante C. elegans, la detección de PGs menores se ve comprometida debido a la baja sensibilidad. Neverthemenos, escaneo CL-EM encuesta puede dar una visión global de las PGs y es particularmente útil para el análisis de mutantes predichos para afectar el metabolismo de una población PG grande. En la identificación de metabolitos, el análisis LC-MS/MS de normas PG síntesis química se lleva a cabo primero para obtener su espectro de iones producto como compuestos de referencia. Estos espectros se puede comparar con el espectro de un metabolito desconocido. El modo de monitorización de reacción múltiple (MRM) se usa para mejorar la sensibilidad y la especificidad. Un experimento MRM se lleva a cabo mediante la especificación de la de iones / iones de producto padre transición masa de un compuesto. Al conocer la masa y la estructura de los analitos diana, es posible predecir transiciones de MRM teóricos para muchos metabolitos desconocidos. Un método LC-MS/MS optimizado para perfilar PGs isómeros en C. No se ha informado elegans. A continuación se describe la extracción y el enfoque integrado de espectrometría de masas consiste en LC-MS y LC-MS / MS métodos para detectar, cuantificar, y la investigación de C. elegans metabolitos PG. Este enfoque se puede aplicar a otros eicosanoides.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-large (16 cm) plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0875714</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain NA22</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>NA22</td>
			<td><a href="http://www.cgc.cbs.umn.edu" target="_blank">http://www.cgc.cbs.umn.edu</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone, 399.5%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A928-4</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butylated Hydroxytoluene</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>101162</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane, HPLC grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H302-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid, 399%</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC27048-0010</td>
			<td>Available through Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform, HPLC grade</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC26832-0010</td>
			<td>Available through Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGF2&alpha;-d4</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>316010</td>
			<td>Cayman has a wide array of standards available for purchase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile screw cap self-standing 5 ml tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-222-651</td>
			<td>For use with Bullet Blender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mm zirconium oxide beads</td>
			<td>Next &gt;&gt;&gt; Advance</td>
			<td>ZrOB05</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml glass conical heavy-duty graduated centrifuge tubes</td>
			<td>Kimble Kimax</td>
			<td>45200-10</td>
			<td>Available through Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml glass conical tubes</td>
			<td>Corning Pyrex</td>
			<td>8082-15</td>
			<td>Available through Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigmacote (Siliconizing reagent)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SL2-100ML</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon lined capped 1/2 Dram glass vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>V1235C-TFE</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CentraSL2 Clinical Centrifuge</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>2517N92-TS</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender 5 blue homogenizer</td>
			<td>Next &gt;&gt;&gt; Advance</td>
			<td>BBY5MB</td>
			<td>A 40 ml Dounce homogenizer can be used as an alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergi 4 &mu;m Hydro-RP 80 &Aring; LC Column 250 x 2.0 mm</td>
			<td>Phenomenenex</td>
			<td>00G-4375-B0</td>
			<td>HPLC Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SecurityGuard Cartridges AQ C18 4 x 2.0 mm</td>
			<td>Phenomenenex</td>
			<td>AJ0-7510</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SecurityGuard Guard Cartridges Kit</td>
			<td>Phenomenenex</td>
			<td>KJ0-4282</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shimadzu Prominence HPLC with refrigerated auto sampler</td>
			<td>Shimadzu Scientific Instruments, Inc.</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Any standard HPLC system coupled to a triple quadrupole mass spectrometer should be sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>API 4000 triple quadrupole mass spectrometer</td>
			<td>Applied Biosystems/MDS SCIEX</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>
			<table border="1">
				<tbody>
					<tr>
						<td colspan="2">M9 buffer recipe (4 liter)</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>12 g</td>
						<td>KH2PO4</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>24 g</td>
						<td>Na2HPO4</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>20 g</td>
						<td>NaCl</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Up to 4 liter</td>
						<td>Deionized water</td>
					</tr>
					<tr>
						<td colspan="2">Aliquot to eight 1 liter bottles. Autoclave and cool.</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>0.5 ml/bottle</td>
						<td>1 M MgSO4</td>
					</tr>
				</tbody>
			</table>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

prostaglandin extraction and analysis in caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans se está convirtiendo en un modelo animal de gran alcance para estudiar la biología de los lípidos de 1-9. Las prostaglandinas son una clase importante de los eicosanoides, que son señales de lípidos derivados a partir de ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs) 10-14. Estas moléculas de señalización son difíciles de estudiar debido a su baja abundancia y la naturaleza reactiva. El rasgo característico de las prostaglandinas es una estructura de anillo de ciclopentano situado dentro de la estructura de ácido graso. En los mamíferos, las prostaglandinas se pueden formar a través de la ciclooxigenasa enzima dependiente de las vías independientes-y 10,15. C. elegans sintetiza una amplia gama de prostaglandinas independientes de las ciclooxigenasas 6,16,17. Una gran clase de prostaglandinas de la serie F ha sido identificado, pero el estudio de los eicosanoides se encuentra en una fase temprana, con un amplio espacio para nuevos descubrimientos. Aquí se describe un procedimiento para la extracción y el análisis de las prostaglandinas y otros eicosanoides. Lípido cargados se extraen a partir de cultivos de gusano de masas utilizando una técnica de extracción líquido-líquido y se analizaron por cromatografía líquida acoplada a la ionización por electrospray y espectrometría de masas en tándem (LC-ESI-MS/MS). La inclusión de análogos deuterados de prostaglandinas, tales como PGF 2 α-d 4 como se recomienda un patrón interno para el análisis cuantitativo. Control de la reacción múltiple o MRM se pueden utilizar para cuantificar y comparar los tipos de prostaglandinas específicas entre los animales de tipo salvaje y mutante. Descomposición inducida por colisión o MS / MS se pueden utilizar para obtener información sobre características estructurales importantes. La cromatografía líquida espectrometría de masas (LC-MS) rastreos de reconocimiento de un rango de masas seleccionado, tales como m / z 315 a 360 se puede utilizar para evaluar los cambios globales en los niveles de prostaglandina. Proporcionamos ejemplos de los tres análisis. Estos métodos proporcionan a los investigadores un conjunto de herramientas para el descubrimiento de nuevos eicosanoides y delinear sus vías metabólicas.

Preparación de la muestra se llevó a cabo por extracción líquido-líquido adaptado de Golovko y Murphy 17. Es siempre una excelente recuperación del patrón interno (PGF 2α-d4). El esquema general para la extracción de PG de C. elegans se muestra en la Figura 1. Se optimizaron las condiciones cromatográficas para proporcionar la separación inicial de&gt; 30 normas eicosanoides (Tabla 1 muestra 13 de las normas). Una columna Hydro-RP (250 x 2,0 mm ID) con agua y acetonitrilo que contiene ácido fórmico al 0,1%, siempre que la mejor separación y la sensibilidad. Análisis de la encuesta de extractos mutantes de tipo salvaje y sin grasa 3 muestran en la Figura 2 niveles globales de documentos de iones dentro del rango de masas de 315 a 360 unidades de masa atómica. Grasa 3 (WA22) mutantes que carecen de PUFAs más de 20 carbonos. Se resalta una clase PG F3. En la Figura 3, los análisis de GRM de un extracto de tipo salvaje muestran múltiples isómeros PG de la F1 (Figura 3A </stro<html> ng&gt;), (Figuras 3C y 3D) clases F2 (Figura 3B), y F3. La clase F3 puede ser detectado con cualquiera de las dos transiciones de masa, m / z 351/193 o m / z 351/191. CePGF2 está predominantemente compuesta por la PGF 2α enantiómero. CePGF1 es probable que sea PGF 1α o su enantiómero. Figura 4 muestra la descomposición inducida por colisión de CePGF2 (RT = 11,8) en comparación con el estándar de PGF2 α (RT = 11,8). Probablemente pequeñas diferencias de iones producto se deben a la baja abundancia CePGF2 y compuestos que eluyen en el extracto. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig1.jpg" /> Figura 1. Diagrama esquemático de C. elegans PGs extracción y análisis LC-MS. Tenga en cuenta que la acetona / solución salina y cloroformo ambos tienen 0,005% de BHT para reducir al mínimo la oxidación de lípidos. Consulte el texto para más detalles.https://www.jove.com/files/ftp_upload/50447/50447fig1large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver más grande la figura. <img alt="La figura 2" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50447/50447fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig2.jpg" /> Figura 2. Análisis de la encuesta de m / z 315-360 de extractos mutantes de tipo salvaje y sin grasa 3 (WA22). Tiempo de retención cromatografía líquida (RT) se muestran en el panel [A]. Iones extraídos a TA = 11.3 se muestran para los de tipo salvaje [B] y grasa 3 (WA22) [C] extractos. Se resalta una PG clase F3 con masa m / z 351. Cps, cuentas / segundo; amu, unidad de masa atómica. <img alt="Figura 3" fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50447/50447fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig3.jpg" /> HigoUre 3. Análisis MRM de extractos de tipo salvaje. PGs clase F1 se detectan con la transición de masa m / z 355/311 [A]. Observe que también se detectan varios compuestos hidrófobos (RT&gt; 14 min), que son poco probable que sea PGs, con esta transición. PGs clase F2 se detectan con la transición de masa m / z 353/193 [B]. PGs clase F3 se detectan, ya sea con la transición de masa m / z 351/193 [C] o m / z 351/191 [D]. Tenga en cuenta que los extractos contienen múltiples isómeros PG de cada clase. Los números corresponden a las PGs que se muestran en la Tabla 2. La concentración de CePGF2 es 1,8 ng / ml. RT, tiempo de retención; cps, cuentas / segundo. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50447/50447fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig4.jpg" /> La Figura 4. Descomposición inducida por colisión de synth químicamenteesized PGF 2α y CePGF2. Las flechas en el panel [A] indican iones producto o fragmentación compartidos entre PGF 2α y CePGF2 (RT = 11,8). Los iones producto de m / z 309 y m / z 193 se generan a partir de los sitios de escisión indicados (marcados A y B), corresponden a las estructuras que se muestran y son característicos de PGs de la serie F [B]. Cps, recuentos / seg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50447/50447fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Estándar </td><td> RT (min) </td><td> [MH] - m / z </td><td> Iones producto clave en MS / MS </td></tr><tr><td> 20-hidroxi PGE 2 </td><td> 9.43 </td><td> 367 </td><td> 349, 331, 287, 234, 189, 129, 109 </td></tr&gt; <tr><td> PGF 3 - </td><td> 11.26 </td><td> 351 </td><td> 333, 307, 289, 271, 245, 219, 209, 193, 191, 171, 165, 111 </td></tr><tr><td> El tromboxano B 2 </td><td> 11.66 </td><td> 369 </td><td> 289, 191, 177, 169, 151 </td></tr><tr><td> PGF 2 - </td><td> 11.80 </td><td> 353 </td><td> 335, 309, 291, 273, 263, 247, 235, 209, 193, 171, 165, 111 </td></tr><tr><td> PGF 1 - </td><td> 11.79 </td><td> 355 </td><td> 337, 319,311, 301, 293, 275, 265, 237, 211, 195 </td></tr><tr><td> Lipoxina B 4 </td><td> 12.38 </td><td> 351 </td><td> 201, 191,189, 165, 155, 115, 107, 71, 59 </td></tr><tr><td> PGD ​​2 </td><td> 12.56 </td><td> 351 </td><td> 315, 271,203, 189 </td></tr><tr><td> 5 (S), 6 (R) - lipoxina A 4 </td><td> 12.83 </td><td> 351 </td><td> 235, 217, 189, 144, 135, 115, 99, 59 </td></tr><tr><td> PGA 2 </td><td> 14.02 </td><td> 333 </td><td> 315, 297, 271, 235, 191, 189, 175, 163, 137, 113, 109 </td></tr><tr><td> Δ12-PGJ 2 </td><td> 14.20 </td><td> 333 </td><td> 271, 189, 123 </td></tr><tr><td> Leucotrieno B4 </td><td> 14.73 </td><td> 335 </td><td> 181, 109, 93, 71, 69, 59, 57 </td></tr><tr><td> 15d-Δ 12,14-PGJ 2 </td><td> 16.80 </td><td> 315 </td><td> 297, 271, 217, 203, 158 </td></tr><tr><td> 5 (S)-HPETE </td><td> 17.88 </td><td> 335 </td><td> 97, 83, 81, 57 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Los tiempos de retención e iones de productos clave de 13 niveles de eicosanoides el método LC-MS/MS 3. Se utilizaron más de 30 normas para desarrollar el programa LC-MS/MS. Los tiempos de retención cromatográficos (RTs) son diferentes, incluso entre PGs muy similares. Una excepción es 2α 1α y PGF PGF. Sin embargo, estas PGs son distinguished por sus masas de iones padres ([MH] - m / z) y colisión inducida por espectros de descomposición (MS / MS). <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Clase de prostaglandina </td><td> No. En la Figura 3 </td><td> [MH] - m / z </td><td> Iones producto clave en MS / MS </td></tr><tr><td> F1 (CePGF1) </td><td> 1 </td><td> 355 </td><td> 319, 301, 311, 293, 275, 265, 237, 223, 211, 195, 157 </td></tr><tr><td> F1 </td><td> 2 </td><td> 355 </td><td> 311, 301, 293, 275, 265, 211, 195, 167, 157 </td></tr><tr><td> F2 (CePGF2) </td><td> 3 </td><td> 353 </td><td> 309, 291, 273, 263, 247, 209, 193, 171, 165, 127 </td></tr><tr><td> F2 </td><td> 4 </td><td> 353 </td><td> 309, 291, 273, 263, 255, 247, 219, 209, 193, 171, 113 </td></tr><tr><td> F3 </td><td> 5 </td><td> 351 </td><td> 315, 307, 289, 275, 249, 205, 193, 191, 167, 153, 139 </td></tr><tr><td> F3 </td><td> 6 </td><td> 351 </td><td> 333, 289, 271, 261, 245, 223, 193, 191, 163 </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Iones producto de descomposición inducida por la colisión de varios de los principales C. elegans F1, F2, F3 y PGs muestran en la Figura 3. MS / MS de otros isómeros menos abundantes no se muestran. Estos datos provienen de múltiples análisis y no todos los iones producidos pueden ser visibles en un plazo determinado. Dada la complejidad de los extractos, algunos iones de productos menos abundantes pueden derivar de otro ion progenitor con el tiempo de retención similar o resultado de la interferencia. Pico 2 es probable que un estereoisómero de CePGF1 y el pico 4 es probable que un estereoisómero de CePGF2. Ver Edmonds, et al. (2010) para obtener datos adicionales 3.

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Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

En este trabajo se describe un procedimiento optimizado para la extracción y el análisis de las prostaglandinas y otros eicosanoides de<em&gt; C. elegans</em&gt; Usando LC-MS/MS.

Extracción y análisis de prostaglandina en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

prostaglandin-extraction-and-analysis-in-caenorhabditis-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

19.4K vistas.  University of Alabama at Birmingham. En este trabajo se describe un procedimiento optimizado para la extracción y el análisis de las prostaglandinas y otros eicosanoides de C. elegans Usando LC-MS/MS.

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Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

El aislamiento y la In vitro La activación de Caenorhabditis elegans El esperma

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Investigación

Biología

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide range of species, including mammals. It also causes a decrease in body weight and fertility, as well as lower levels of plasma glucose, insulin, and IGF-1 in these animals. This treatment is often referred to as dietary restriction (DR) or caloric restriction (CR). The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as an important model organism for studying the biology of aging. Both environmental and genetic manipulations have been used to model DR and have shown to extend lifespan in C. elegans. However, many of the reported DR studies in C. elegans were done by propagating animals in liquid media, while most of the genetic studies in the aging field were done on the standard solid agar in petri plates. Here we present a DR protocol using standard solid NGM agar-based plate with killed bacteria.

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Here we present a protocol for performing solid plate-based dietary restriction in C. elegans with killed bacteria.

Placa Sólida basado en la restricción dietética Caenorhabditis elegans</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Time-lapse microscopía de embriogénesis temprana en Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos de sincronización y de observación

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we know about C. elegans is limited to laboratory cultivation of the nematodes that may not necessarily reflect the environments they normally inhabit in nature. Cultivation of C. elegans in a 3D habitat that is more similar to the 3D matrix that worms encounter in rotten fruits and vegetative compost in nature could reveal novel phenotypes and behaviors not observed in 2D. In addition, experiments in 3D can address how phenotypes we observe in 2D are relevant for the worm in nature. Here, a new method in which C. elegans grows and reproduces normally in three dimensions is presented. Cultivation of C. elegans in Nematode Growth Tube-3D (NGT-3D) can allow us to measure the reproductive fitness of C. elegans strains or different conditions in a 3D environment. We also present a novel method, termed Nematode Growth Bottle-3D (NGB-3D), to cultivate C. elegans in 3D for microscopic analysis. These methods allow scientists to study C. elegans biology in conditions that are more reflective of the environments they encounter in nature. These can help us to understand the overlying evolutionary relevance of the physiology and behavior of C. elegans we observe in the laboratory.

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

We present a simple method to construct 3D nematode cultivation systems called NGT-3D and NGB-3D. These can be used to study nematode fitness and behaviors in habitats that are more similar to natural Caenorhabditis elegans habitats than the standard 2D laboratory C. elegans culture plates.

El cultivo de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; En tres dimensiones en el Laboratorio

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture a full picture of the multiple levels of molecular processing and changes between different conditions. This protocol presents the method of isolating DNA, RNA, and protein from the same sample of the nematode Caenorhabditis elegans to remove the variation introduced when these biomolecules are isolated from replicates of similarly treated but ultimately different samples. Nucleic acids and protein are extracted from the nematode using the acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction method, with subsequent precipitation, washing, and solubilization of each. We show the successful isolation of RNA, DNA, and protein from a single sample from three strains of nematode and HeLa cells, with better protein isolation results in adult animals. Additionally, guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform-extracted protein from nematodes improves the resolution of larger proteins, with enhanced detectable levels as observed by immunoblotting, compared to the traditional RIPA extraction of protein.
The method presented here is useful when investigating samples using a multiomic approach, specifically for the exploration of the proteome and transcriptome. Techniques that simultaneously assess multiomics are appealing because molecular signaling underlying complex biological phenomena is thought to occur at complementary levels; however, it has become increasingly common to see that changes in mRNA levels do not always reflect the same change in protein levels and that the time of collection is relevant in the context of circadian regulations. This method removes any intersample variation when assaying different contents within the same sample (intrasample.)

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for the isolation of RNA, DNA, and protein from the same sample, in an effort to reduce variation, improve reproducibility, and facilitate interpretations.

Nucleótido y extracciones de proteínas de Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous system and muscle. Consistent with this, mitochondrial dysfunction has been associated with a myriad of neurodegenerative diseases and aging in general. Caenorhabditis elegans have been a powerful model system for elucidating the many intricacies of mitochondrial function. Mitochondrial respiration is a strong indicator of mitochondrial function and recently developed respirometers offer a state-of-the-art platform to measure respiration in cells. In this protocol, we provide a technique to analyze live, intact C. elegans. This protocol spans a period of ~7 days and includes steps for (1) growing and synchronization of C. elegans, (2) preparation&#160;of compounds to be injected and hydration of probes, (3) drug loading and cartridge equilibration, (4) preparation of worm assay plate and assay run, and (5) post-experiment data analysis.

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondrial respiration is critical for organismal survival; therefore, oxygen consumption rate is an excellent indicator of mitochondrial health. In this protocol, we describe the use of a commercially available respirometer to measure basal and maximal oxygen consumption rates in live, intact, and freely-motile Caenorhabditis elegans.

Medición de las tasas de consumo de oxígeno en intacto Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular vesicles (EVs) function outside the cell to regulate global physiological processes by transferring proteins, nucleic acids, metabolites, and lipids between tissues. EVs reflect the physiological state of their cells of origin. EVs are implicated to have fundamental roles in virtually every aspect of human health. Thus, EV protein and genetic cargos are being increasingly analyzed for biomarkers of health and disease. However, the EV field still lacks a tractable invertebrate model system that permits the study of EV cargo composition. C. elegans is well suited for EV research because it actively secretes EVs outside of its body into its external environment, permitting facile isolation. This article provides all the necessary information for generating, purifying, and quantifying these environmentally secreted C. elegans EVs including how to work quantitatively with very large populations of age-synchronized worms, purifying EVs, and a flow cytometry protocol that directly measures the number of intact EVs in the purified sample. Thus, the large library of genetic reagents available for C. elegans research can be tapped into for investigating the impacts of genetic pathways and physiological processes on EV cargo composition.

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

This article presents methods for generating, purifying, and quantifying Caenorhabditis elegans extracellular vesicles.

Purificación y análisis de las vesículas extracelulares de Caenorhabditis elegans

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their detrimental effects on the human life quality and the healthcare system, the majority of human neurodegenerative disorders still remain incurable and non-preventable. Therefore, the development of novel therapeutic interventions against such maladies is becoming a pressing urgency. Age-associated deterioration of neuronal circuits and function is evolutionarily conserved in organisms as diverse as the lowly worm Caenorhabditis elegans and humans, signifying similarities in the underlying cellular and molecular mechanisms. C. elegans is a highly malleable genetic model, which offers a well-characterized nervous system, body transparency and a diverse repertoire of genetic and imaging techniques to assess neuronal activity and quality control during ageing. Here, we introduce and describe methodologies utilizing some versatile nematode models, including hyperactivated ion channel-induced necrosis (e.g., deg-3(d) and mec-4(d)) and protein aggregate (e.g., &#945;-syunclein and poly-glutamate)-induced neurotoxicity, to monitor and dissect the cellular and molecular underpinnings of age-related neuronal breakdown. A combination of these animal neurodegeneration models, together with genetic and pharmacological screens for cell death modulators will lead to an unprecedented understanding of age-related breakdown of neuronal function and will provide critical insights with broad relevance to human health and quality of life.

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Here, we introduce and describe widely accessible methodologies utilizing some versatile nematode models, including hyperactivated ion channel-induced necrosis and protein aggregate-induced neurotoxicity, to monitor and dissect the cellular and molecular underpinnings of age-associated neurodegenerative diseases.

Modelar enfermedades neurodegenerativas asociadas a la edad en Caenorhabditis elegans

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This increased attention has called for the diversification and improvement of animal models capable of reproducing disease phenotypes observed in humans with PCDs. Though murine models have proven invaluable, they are expensive and are associated with laborious, low-throughput methods. Use of the Caenorhabditis elegans nematode model to study PCDs has been justified by its relative ease of maintenance, low cost, and rapid generation time, which allow for high-throughput applications. Additionally, high conservation between the C. elegans and human genomes makes this model an invaluable discovery tool. Nematodes that express fluorescently tagged tissue-specific polyglutamine (polyQ) tracts exhibit age- and polyQ length-dependent aggregation characterized by fluorescent foci. Such reporters are often employed as proxies to monitor changes in proteostasis across tissues. Manual aggregate quantification is time-consuming, limiting experimental throughput. Furthermore, manual foci quantification can introduce bias, as aggregate identification can be highly subjective. Herein, a protocol consisting of worm culturing, image acquisition, and data processing was standardized to support high-throughput aggregate quantification using C. elegans that express intestine-specific polyQ. By implementing a C. elegans-based image processing pipeline using CellProfiler, an image analysis software, this method has been optimized to separate and identify individual worms and enumerate their respective aggregates. Though the concept of automation is not entirely unique, the need to standardize such procedures for reproducibility, elimination of bias from manual counting, and increase throughput is high. It is anticipated that these methods can drastically simplify the screening process of large bacterial, genomic, or drug libraries using the C. elegans model.

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

The following protocol describes the development and optimization of a high-throughput workflow for worm culturing, fluorescence imaging, and automated image processing to quantify polyglutamine aggregates as an assessment of changes in proteostasis.

Automatización de la cuantificación agregada en Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...