A membrana Chorioalantoica Chick in vivo modelo para avaliar invasão perineural em câncer de cabeça e pescoço

Este protocolo permite o estudo in vivo das interações precoces entre células tumorais e nervos e o estudo de vias moleculares de invasão nervosa no câncer. As principais vantagens dessa técnica são o curto tempo experimental com potencial para estudar a invasão perineural e outros fenótipos de câncer no mesmo experimento. Antes de experimentar esta técnica pela primeira vez, recomendamos praticar a perfuração comercial de ovos não fertilizados e a colheita da gânglio raiz dorsal para otimizar sua técnica para ambos os procedimentos.

Demonstrando o procedimento será Min Liu, um pesquisador associado do meu laboratório. Comece incubando seis ovos fertilizados livres de patógenos comerciais por grupo experimental em uma incubadora umidificante de óvulos a 38 graus Celsius e 54% de umidade no primeiro dia pós-fertilização por oito dias com rotação horária. No oitavo dia, limpe a pele dorsal de um rato eutanizado com 70% de etanol e use uma tesoura para remover a coluna.

Separe as regiões cervical, torácica e lombar e coloque as seções da coluna vertebral em um prato de cultura de 10 centímetros com PBS para manter as amostras de tecido hidratadas. Utilizando uma delicada tesoura óssea, abra os ossos vertebrais torácicos e cervicais nos aspectos dorsal e ventral para separar a coluna vertebral em duas metades laterais e colocar as seções de tecido em um prato limpo de 10 centímetros com PBS fresco. Usando fórceps, desprende suavemente a medula espinhal dos ossos vertebrais para visualizar os gânglios de raiz dorsal.

Colocando as pontas de um par de fórceps finos mantidos sob cada gânglio, segure o tecido e puxe-o da cavidade óssea em que está alojado. Imediatamente após a colheita, coloque cada gânglio no meio de cultura DMEM suplementado com penicilina de 2%e estreptomicina ou Pen-Strep e 10% de bovino fetal ou FBS para ajudar a prevenir a contaminação bacteriana dos tecidos nervosos. Quando todos os gânglios tiverem sido colhidos, transfira os tecidos para um novo prato de cultura contendo meio de cultura DMEM fresco complementado com 2%Pen-Strep mais 10% FBS e 1,2 microgramas por mililitro de corante fluorescente vermelho para uma incubação de uma hora na incubadora de cultura celular.

Para preparar os ovos para o enxerto de gânglio raiz dorsal, diminua a luz em um armário de fluxo laminar e segurando o ovo com o saco de ar natural em direção à fonte de luz, transilluminar cada ovo para verificar a viabilidade do filhote e a fase embrionária. Identifique a fixação do embrião em desenvolvimento à membrana corioallantóica como um vaso móvel escuro ligado à membrana do ovo e use um lápis para marcar o apego para evitar intervenções nesta região. Desenhe uma região de 1,5 centímetro em uma área bem vascularizada a pelo menos dois centímetros do anexo do embrião para atuar como uma área de janela de operação e desenhar um quadrado de 0,5 centímetros em uma área menos vascularizada a aproximadamente um centímetro da janela de operação.

Em seguida, marque o centro da região do saco de ar. Em seguida, use uma ferramenta rotativa e uma broca de gravura com uma broca de três milímetros de diâmetro para perfurar cuidadosamente a casca de ovo dentro do quadrado marcado. Use fórceps contundentes para remover a casca de ovo sem remover a membrana de casca de ovo branca sob a casca.

Use a broca para fazer cuidadosamente uma perfuração de broca de ponto na cruz marcada na área do saco de ar para permitir o fluxo de ar no ovo sem quebrar ou danificar a casca e adicionar 30 microliters de HBSS à abertura quadrada sobre a membrana de casca de ovo exterior intacta. Usando uma agulha de calibre 30, faça uma perfuração na membrana externa dentro da área quadrada. Em seguida, segure o ovo até a fonte de luz para visualizar o saco de ar e aplique pressão em uma lâmpada de borracha conta-gotas.

Coloque a lâmpada conta-gotas sobre a pequena perfuração dentro do saco de ar e solte a pressão sobre a lâmpada até que uma separação da membrana externa e membranas corioallantóicas dentro da área da janela de operação seja observada repetindo esta etapa até que uma separação completa das membranas seja alcançada. Quando todos os ovos forem modificados da mesma forma, fure a janela de operação circular em um ovo, tomando cuidado para não romper a membrana externa da casca de ovo e use o lado pegajoso de um pedaço de fita adesiva para remover quaisquer partículas soltas da casca. Usando fórceps contundentes, remova a casca de ovo da área perfurada seguida pela membrana externa da casca de ovo, tomando cuidado para não introduzir pequenas partículas de casca dentro do ovo para minimizar a contaminação.

Quando a casca de ovo e a membrana externa tiverem sido removidas como demonstrado, cubra os ovos com uma membrana de cera de parafina e coloque os ovos de volta na incubadora de ovos sem rotação até que a gânglio raiz dorsal esteja pronta para enxerto. Para enxerto de um gânglio raiz dorsal na membrana corioallantónica, use fórceps finos estéreis para agarrar cuidadosamente um gânglio no prato de cultura e lavar suavemente o tecido em um recipiente de HBSS fresco. Coloque o gânglio sobre a membrana corioallantóica de um ovo tomando cuidado para não perfurar a membrana e cobrir todas as aberturas de ovos com curativos de filme transparentes estéreis.

Quando todos os ovos tiverem sido enxertados, devolva-os à incubadora de ovos umidificadores por dois dias sem rotação. No final da incubação, transfira os ovos para o armário de fluxo laminar e use tesouras e fórceps para abrir o curativo transparente do filme. Em seguida, adicione 0,5 a um milhão de células tumorais fluorescentes rotuladas em cinco microlitrais de HBSS na membrana corioallantóica de cada ovo cerca de dois milímetros de cada gânglio raiz dorsal mantendo uma distância uniforme entre os gânglios e as células.

Em seguida, cubra os ovos com um novo curativo de filme e devolva os ovos à incubadora de ovos por sete dias sem rotação. No final da incubação, coloque os ovos no topo do banco do laboratório. Use uma seringa para perfurar o curativo de filme de cada ovo e aplique cerca de 300 microliters de 4% de paraformaldeído sobre cada membrana corioallantónica para endurecer ligeiramente o tecido para facilitar o processo de colheita.

Com uma tesoura, remova a metade superior da casca de ovo com a membrana corioallantóica anexada. Reduza o tamanho da casca para aproximadamente três centímetros de diâmetro mantendo a porção da membrana corioallantóica onde gânglio raiz dorsal e células tumorais foram enxertados no centro do fragmento da concha. Em seguida, segure a membrana corioallantóica com fórceps finos e desprende o tecido da casca de ovo para transferência em um poço de uma placa de seis poços contendo dois mililitros de 4% paraformaldeído por gânglio raiz dorsal bem e lado da célula tumoral para cima.

A integração da gânglio raiz dorsal na membrana corioallantónica é importante, pois a membrana corioallantóica fornece nutrição ao tecido gânglio raiz dorsal durante o experimento. Microscopicamente, o gânglio raiz dorsal é observado dentro do tecido conjuntivo da membrana corioallantóica e os vasos sanguíneos são frequentemente vistos dentro do tecido gânglio raiz dorsal sugerindo que o suprimento de sangue da membrana corioallantóica está nutrindo o tecido enxertado. Tumores implantados também são identificados na membrana corioallantórica por hematoxilina e eosina.

Dependendo da quantidade de invasão presente, os tumores podem apresentar não a numerosas ilhas tumorais que invadem o tecido conjuntivo. Neste experimento representativo, imagens com análise de fluorescência de fusão revelaram uma invasão crescente do gânglio raiz dorsal em membranas corioallantóicas enxertadas com células tumorais sobre a expressão do receptor de galanin 2 em comparação com tumores de controle. Este modelo in vivo útil e econômico de invasão perineural pode ser replicado até mesmo por laboratórios com recursos limitados.