Apoiado por um subprojeto do NIH conceder P20 RR16440 e uma subvenção ponte entre o Ocidente de Correios Universidade Virginia de Pesquisa e Pós-Graduação em S. Weed. Assistência técnica de L. Lopez-Skinner durante as fases iniciais do desenvolvimento do projeto é reconhecido agradecimento. Os autores também são gratos pela assistência técnica e OSC19 células de J. Myers e Younes M. (Departamento de Cirurgia de Cabeça e Pescoço, MD Anderson Cancer Center, Houston, TX); P. Turner e K. Secrest (West Virginia University Departamento de Patologia Banco de Tecidos) para processamento histológico e procedimentos, R. Wysolmerski (West Virginia University, Departamento de Neurobiologia e Anatomia) para a construção LifeAct-mCherry e Bear J. (University of North Carolina) para o vetor pLL7.0 lentiviral. O uso da Universidade de West Virginia Facilidade de imagens de microscopia (apoiado pelo NIH conceder P20 RR16440 ea Mary Babb Randolph Cancer Center) e sua não-linear de laboratório de microscopia óptica (NLOM; apoiado por uma colaboração conjunta entre a West Virginia University Center for Neuroscience e da West Virginia University Departamento de Física / West Virginia Nanociência Initiative) também é reconhecido agradecimento. O NLOM é apoiado em parte pelo NIH conceder P30 RR031155 para o Centro de Neurociências.

1. Linhas de celular, Construção Vector e Produção Lentivirus <ol><li> Cabeça humana e células pescoço tumor linhas (OSC19 ou UMSCC1) foram cultivados em meio completo composto por DMEM (Cellgro gato # 50-003-PB) suplementado com 10% de soro fetal bovino FBS (Hyclone # cat SH30070.03), penicilina 1% / estreptomicina (Cellgro gato # 30-002-CI), e 1% não-aminoácidos essenciais (Cellgro gato # 25-025-CI). </li><li> Para transferir a seqüência LifeAct-mCherry codificação no vetor pLL7.0 lentiviral, o sítio de reconhecimento Sbf1 na mCherry pai cDNA foi alterado pela introdução de três mutações em silêncio na seqüência de reconhecimento usando mutagênese sítio-dirigida (Stratagene cat # 200518-5). O resultado modificado seqüência LifeAct-mCherry foi então PCR amplificados com acompanhamento EcoR1/Sbf1 sites e subclonado em pLL7.0 para gerar a construção pLL7.0-LifeAct-mCherry. </li></ol> 2. pLL7.0-LifeAct-mCherry Produção Virus <ol><li> Produção viral foi conduzido de acordo com a Expressão Lentivirus Sistemas manual (versão do sistema Bioscience 2-051018). </li><li> A linhagem celular embalagem 293T/17 células (ATCC # cat CRL-11268) foi cultivado a confluência de 40% na mesma mídia utilizada para completar linhas CECP. </li><li> As células foram transfectadas com o pLL7.0-LifeAct-mCherry, psPAX2 e pVSV-G vetores em uma proporção de 03:02:01, respectivamente usando CalPhos (Clontech cat # 631312). </li><li> Após 24 horas, a mídia inicial do transfecção foi substituído com a mídia fresco. </li><li> Mídia foi coletado e reabastecidos a cada 12 horas para 72 horas e armazenadas a 4 ° C. </li></ol> 3. Produção de Cabeça e Pescoço linhagens de células com expressão LifeAct mCherry-Stable <ol><li> A mídia coletado foi centrifugado a 2000 rpm por 10 minutos a 4 ° C. </li><li> Um ml de mídia esclareceu que contenham vírus foi adicionado diretamente OSC19 ou UMSCC1 células por 12 horas. As células foram então lavadas, e um adicional de um mL de vírus foi adicionado por um novo período de 12 horas. </li><li> Células foram tratadas com a mídia contendo puromicina 200mg/ml durante duas semanas para selecionar colônias resistentes. </li><li> Clones sobreviventes foram examinados visualmente para LifeAct-mCherry expressão por microscopia de fluorescência. Individuais colônias positivas foram typsinized usando discos estéreis clonagem 3mm (Fisher cat # 0790710A). </li><li> Células positivas foram mantidas em meios contendo puromicina 200mg/ml até congelados para trás ou utilizadas para a injeção ortotópico. </li></ol> 4. Formação Xenoenxerto ortotópico Tumor <ol><li> Todos os procedimentos com animais foram conduzidos de acordo com um protocolo (09-0821), aprovado pelo Animal Care West Virginia University e do Comitê Use. </li><li> LifeAct-mCherry células tumorais que expressam foram tripsinizados, centrifugado e 2,5 x 10 4 células foram ressuspendidas em 50 mL de mídia completo. </li><li> Células tumorais foram carregados para uma seringa ml um ligado a uma agulha de calibre 27 ½. </li><li> Feminino atímicos fox1 nu / nu ratos de 8 semanas de idade (Harlan Laboratories) foram anestesiados com a combinação de 80mg/kg de ketamina e 10mg/kg de xilazina. Ratos anestesiados foram mantidos entre 37-40 ° C em uma almofada de aquecimento. </li><li> Utilizando uma pinça estéril, a ponta da língua foi gentilmente agarrou e cuidadosamente retirado da cavidade oral. </li><li> As células foram injetadas lentamente em um lado de cada língua para criar uma massa bulbosa no centro da língua, evitando as artérias lingual. </li><li> Camundongos foram injetados com ioimbina 2.1mg/kg e voltou para a almofada de aquecimento, onde foram monitorados por 2-3 horas durante a recuperação da anestesia. </li><li> Uma vez reviveu, os camundongos foram colocados em gaiolas estéreis, contendo uma dieta massa macia transgênicos (Bioserve cat # S3472). </li><li> Camundongos foram pesados ​​a cada 2-3 dias e monitorada visualmente para o surgimento do tumor. </li></ol> 5. Preparação de Línguas do mouse para Ex-vivo de imagens <ol><li> Camundongos portadores de tumores em momentos diferentes (tipicamente 2-4 semanas após a injecção) foram sacrificados por inalação de dióxido de carbono. </li><li> As línguas foram extraídas, lavadas com PBS 1X e anexado a um lado de uma cassete convencional parafina tecido (StatLab Cat # H104), utilizando linhas de costura de monofilamento de uma loja local do passatempo e um tamanho de agulha de costura 8. </li><li> Uma vez que as línguas foram imobilizados, o conjunto de cassetes inteira foi colocada em um prato de 30 milímetros de cultura de tecidos e imerso em 1X PBS. </li><li> Línguas processadas foram imediatamente utilizados para dois fótons de microscopia de excitação. </li></ol> 6. Imagem de Tumores Tongue com dois fótons Microscopia <ol><li> Cassetes língua foram submersas em um prato de 60 milímetros contendo 1X PBS garantido em um suporte personalizados em um braço cantilever retrátil (Câmara Shuttle, Siskiyou instrumentos) posicionada no âmbito do objectivo de um microscópio vertical (Microscópio móveis (MOM); Instruments Sutter). </li><li> A água 40X/0.8NA lente objetiva de imersão foi colocada diretamente ou sobre tum visívelou lesões. Línguas foram fotografadas ao microscópio de dois fotões com o Ti: safira laser (Mira, Coherent) de intensidade de 60 mW e comprimento de onda de entrada de 755 nm para otimizar o sinal mCherry. </li><li> Serial 1 milímetro digitalização de imagens a laser foram coletadas em profundidades de 1 mícron incremental em uma profundidade de tecido total entre 15 e 100 mm (dependendo do volume do tumor). As imagens foram capturadas scanimage, um programa de código aberto baseado na plataforma MATLAB, que foi desenvolvido pela Svoboda Karel laboratório (Janelia Farms, HHMI). Scanimage gera uma saída de dois canais de padrões raster scan para controlar a x / y espelhos galvanométricos scan, e ao mesmo tempo, capta um sinal de entrada máxima de quatro canais simultaneamente a partir de tubos fotomultiplicadores (PMTs) através de uma placa de aquisição de dados (PCI-6610S , National Instruments). A PMT sinais são amplificados por amplificadores de baixo ruído de corrente (SR570, Stanford Research System) antes da alimentação na placa NI-DAQ para exibição na tela do monitor. Scanimage coleta z-stack imagens por meio do controle do eixo z do objectivo e coleta de lapso de tempo imagens em um único modo ou de bicicleta. As imagens foram salvas em um único arquivo TIFF com 16 bits de profundidade. </li></ol> 7. Análise de imagem usando Amira Software <ol><li> Amira imagem para a quantificação do tumor: Em software Aimra, abra o arquivo TIFF que contém o conjunto de z-stack imagens. </li><li> Realce o nome do arquivo, selecionar e aplicar a função Voltex para gerar um rendering tridimensional. A imagem primária grande tumor com vários menores, dissociada grupos invasiva (IG) de células coletivamente invadido é tipicamente evidente na imagem processada (Figura 6A). </li><li> Para selecionar a massa do tumor primário, selecione &quot;Open Data&quot;, então &quot;rotulagem&quot;, então &quot;Campo Label&quot;. </li><li> Limiarização do tumor primário-selecionar todas as imagens z-stack e percorrer as imagens do z-plano para assegurar a inclusão de apenas massa tumoral primária em três dimensões. Isto é tipicamente a maior imagem de tamanho no campo e muitas vezes aparece segmentado como o imaginado é percorrido através do z-plano. </li><li> Use a função wand / limiar mágico para corrigir fluorescência de fundo e eliminá-la a partir da imagem, sem descartar nenhum dos sinais do tumor. Destacar a &quot;Inside File&quot; etiqueta e clique no botão ⊕. Selecione a opção &quot;Todas as Slices&quot; caixa de seleção. Isso produz uma borda colorida ao redor da área do tumor primário em thresholded cada incremento z-stack. </li><li> Para selecionar IGs, escolha a função &quot;Novo&quot;. Selecione um IG única e garantir que ele não está associado com o tumor primário percorrendo a z-plano. </li><li> Selecione &quot;Todas as Slices&quot; e clique no botão ⊕. Renomeie o arquivo (ex: IG 1) </li><li> Repita o procedimento de limiarização em 7,4 eo passo destacando em 7.5 para o IG determinado. Selecione uma cor de contorno diferente do que a cor usada para designar a massa do tumor primário. </li><li> Repita conforme necessário para cada IG adicionais em toda a imagem, a digitalização através do z-plano para garantir que todos IGs são indicadas. Usando cores diferentes para cada uma identificada IG auxilia na identificação futura sobre a imagem. </li><li> Uma vez que o tumor primário e todos os IGs são selecionados, selecione &quot;segmentação&quot; no menu suspenso, selecione &quot;Estatísticas Material&quot;. Isso proporciona a medição de volume, bem como o X, Y e X núcleo tumor coordenadas para o tumor primário a fim de calcular distâncias de IGs a partir do ponto central do tumor. </li><li> Com os volumes calculados, determine a distância para cada IG a partir do núcleo central do tumor primário. Selecione &quot;segmentação&quot;, depois em &quot;Estatísticas Material&quot;. Este passo calcula todas as medidas em pixels. Converter os pixels para micrômetros com base na calibração da objetiva do microscópio e qualquer aumento adicional na ampliação (ou seja, funções de zoom). Para o microscópio e as configurações utilizadas nesses experimentos, a objetiva de 40X foi usado sem zoom, dando uma calibração de 1 pixel = 0,298 mM. Importar dados para uma planilha do Excel, o que dá parâmetros para o tumor primário em três dimensões (X1, Y1, Z1) e para cada IG (ex: X2, Y2, Z2 para o IG primeiro). </li><li> A distância invadido em microns para cada IG a partir do centro do tumor primário é calculado pela fórmula √ ((X2-X1) 2 + (Y2-Y1) 2 + (Z2-Z1) 2). </li><li> O índice de tumor invasivo (T I) é calculado pela fórmula I = T N T x V x T D T, onde T = N o número total de IGs na imagem, V T = o volume total de todas as IGs, D T = distância total percorrida de todos os grupos invasivos do centro do tumor primário. </li></ol> 8. Três dimensões, com renderings Nikon Software NIS Elements <ol><li> Três representações tridimensionais com maior detalhe topográfico pode ser gerada por meio da importação do original de 16 bits arquivos TIFF monocromático da imagem tumor inteiro para o software Nikon NIS Elementspacote (Nikon, Melville, NY). Selecione &quot;File&quot;, depois em &quot;Key&quot;, depois &quot;Criar arquivo ND da seqüência de arquivo&quot;. Selecione a imagem TIFF pilha z-series e especificar o tamanho do passo adequado. </li><li> Calibrar o documento ND no plano xy. Especificar o tamanho de um pixel usando uma calibração manual. </li><li> Escolha a opção &quot;Ver Volume&quot;. Use o &quot;HQ&quot; função para calcular fatias adicionais no z-plano para maior qualidade. Na seção &quot;Configurações 3D Renderer&quot;, use o &quot;Advanced Renderer&quot; com uma qualidade de &quot;Ultra Alta Detalhes&quot; e &quot;Resolução Full&quot;. Escolha &quot;Alpha Blending&quot; para acentuar as superfícies tumor. </li><li> Otimizar a imagem tridimensional para a apresentação. Dê um zoom no tumor e IGs associados e de culturas, conforme necessário. Rodar a imagem no plano xyz e ajustar o LUTs. </li><li> Capturar a imagem de apresentação. Selecione &quot;Edit-Criar Ver Snapshot (8 bit RGB)&quot;. Nome e salvar o arquivo em conformidade. </li></ol> 9. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Esquemática geral ilustrando passos-chave na produção ortotópico língua tumor in situ e imagens de dois fótons. <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Injeção de LifeAct-mCherry expressar OSC19 células para a língua mouse. <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3 ressecado língua do mouse tumor contendo preparado para duas imagens fóton. <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Orientação de língua tumor contendo na posição em um microscópio dois fótons pronto para geração de imagens. <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Ecrã Representante tiro de scanimage demonstrando aquisição de dados brutos da imagem de dois fótons inicial. <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Análise de Imagens e quantificação de invasão do tumor em um tumor OSC19 ortotópico. Imagens da tela representante tiro de Amira renderização Voltex (A) e um único thresholded z-seção (B) com o tumor primário primário descrito no grupo, roxo invasivos 1 (IG-1) descrito no azul, IG-2 destacados em vermelho e IG -3 delineada em verde como um exemplo do procedimento de identificação. Setas indicam IGs em (A) e (B). Plots C. de volume versus invadiu a distância para oito IGs individuais utilizados para calcular o índice de invasão do tumor (Ti). <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig7.jpg" alt="Figura 7" /> Imagens figura 7. Representante de tumores e invadiu grupos tumor a partir deste protocolo, em relação com imagens de uma abordagem IHC convencionais. A. seção de parafina de uma língua do mouse toda abrigar um tumor UMSCC1 ortotópico. Coloração imuno-histoquímica foi realizada utilizando os procedimentos convencionais com um anticorpo primário contra o CECP específicos de células marcador emmprin (Zymed; cat # 34-5600) a 1:1000 de diluição e visualizados usando o OmniMap DAB anti-Rb detecção kit (Ventana cat # 760 -149), seguido de coloração com hematoxilina de ferro. Imagens englobando a área da língua total foram coletados individualmente com ampliação de 4X em um microscópio Olympus Provis ZX70 com uma câmera CCD MicroFire Optronics e reconstruído usando o pacote de imagens StereoINvestigator (MBF Bioscience). O tumor é evidente na ponta da língua. Uma região alargada mostrando o front invasivo e grupos individuais de células tumorais (setas) é mostrado em (B). Nikon C. renderização NIS-Elementos de um tumor OSC19 representante. Detalhes do contorno aprimorado e visualização clara de IGs (setas) é evidente. Bares em todas as imagens = 100 mm.

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Modelos de ratos ortotópico provaram ser úteis para o estudo de muitos aspectos da cabeça e pescoço 1,2. Nós combinamos um sistema bem estabelecido ortotópico de SCOT 3 com imagens de microscopia de dois fótons de células-mCherry rotulado como um sistema para estudar os eventos iniciais da cabeça e pescoço invasão das células tumorais. Neste procedimento, observamos que as células podem vazar a partir do local da injeção do tumor, especialmente em ratos seis semanas ou mais jovens devido ao tamanho da língua insuficiente. Nós usamos ratos mais velhos para evitar esse problema. O tamanho maior língua com ratos mais velhos também ajuda a evitar a ruptura de uma artéria lingual e hemorragia excessiva da língua. Tirar tumor é muito maior quando a língua incha dramaticamente no local da injeção inicial. Este inchaço desaparece dentro de 1-2 horas, como o fluido injetado é absorvido. O crescimento do tumor parece evidente 1-2 semanas pós-injeção com o número de células injetadas indicado como uma pequena protuberância branca na superfície da língua. Observamos também que na objetiva de 40X utilizado em nossos estudos aqui apresentados, não podemos distinguir células tumorais individuais, mas se identificam IGs como aglomerados de células invasoras que recapitulam o modo típico de invasão CECP. Até o momento este modelo tem sido amplamente utilizada para testar o papel de moléculas específicas, bem como várias drogas anti-tumorais sobre o crescimento SCOT uma invasão, com eficácia medida por metástase de linfonodo cervical monitorados usando IHC ou bioluminescente métodos 4-7. Tumores formados nesta manifestar sistema perto da superfície da língua (Figura 7), permitindo a aplicação de dois fótons de microscopia para tumores imagem inteira in situ como invasivos multi-celular clusters. O procedimento também pode ser utilizada para visualizar a invasão do tumor com resolução de celular. Microscopia de dois fótons foi previamente utilizada para estudar tratamentos experimentais para câncer de cabeça e pescoço em 8,9 ortotópico e xenoenxerto 8,10 modelos. No entanto, existem duas grandes diferenças entre esses relatórios e nosso protocolo. Em primeiro lugar, esses estudos utilize etiquetas extracelular para target / cabeça e identificar células tumorais no pescoço, possivelmente limitando a detecção apenas para células tumorais, com amplo acesso à circulação. Invasão, segundo as células do tumor próximo ao local primário que recapitula provável atividade metastática precoce não foi avaliada como um parâmetro experimental. Nosso protocolo fornece a capacidade de quantificar diretamente a invasão das células tumorais em qualquer ponto durante a progressão do tumor em línguas mouse. Enquanto o método descrito aqui descreve o procedimento usando línguas dissecados, estamos atualmente no processo de adaptar este método para a invasão do tumor em ratos de imagem ao vivo para uso em combinação com a bioluminescência para monitorar simultaneamente a invasão inicial, participação do nó de linfa locais e metástases à distância no mesmo animal. Alterações ao protocolo para in vivo de imagens requerem projeto de uma fase adequada para o posicionamento e manutenção de ratos durante o exame, bem como um sistema prático para irrigar adequadamente na cavidade oral de ratos anestesiados durante o procedimento de imagem. Uma vez otimizado, essas adaptações irá fornecer a capacidade de estudar o papel do potencial pro-invasivo moléculas e os testes anti-invasivo de compostos em invasão local e mais distantes envolvimento metastático em animais em períodos de tempo prolongado.

multi-photon imaging of tumor cell invasion in an orthotopic mouse model of oral squamous cell carcinoma

Loco-regional invasão do câncer de cabeça e pescoço está ligada ao risco metastático e representa um difícil desafio na concepção e implementação de estratégias de manejo do paciente. Modelos de ratos ortotópico de câncer bucal foram desenvolvidos para facilitar o estudo dos fatores que a invasão de impacto e servir como sistema modelo para a avaliação da terapêutica anti-tumor. Nestes sistemas, a visualização de células tumorais disseminadas dentro dos tecidos da cavidade oral tem sido tipicamente conduzida por um ou outro histologia convencional ou com métodos in vivo bioluminescente. A principal desvantagem dessas técnicas é a incapacidade inerente à precisão visualizar e quantificar a invasão de células do tumor inicial decorrente do site principal em três dimensões. Aqui nós descrevemos um protocolo que combina um modelo estabelecido para o carcinoma de células escamosas da língua (SCOT), com imagens de dois fótons para permitir a multi-vectorial visualização de disseminação do tumor lingual. O OSC-19 de cabeça e pescoço linha celular do tumor foi projetado de forma estável para expressar a F-actina LifeAct peptídeo de ligação fundida à proteína fluorescente mCherry (LifeAct-mCherry). Fox1 nu / nu camundongos injetados com essas células de forma confiável formam tumores que permitem a língua para ser visualizado pelo ex-vivo aplicação de dois fótons de microscopia. Esta técnica permite a visualização ortotópico da massa tumoral e localmente invadir as células excisadas em línguas sem interrupção do microambiente do tumor regional. Além disso, este sistema permite a quantificação de invasão das células tumorais, calculando distâncias que invadiu mover células a partir do local do tumor primário. Em geral, este procedimento fornece um sistema modelo avançado para análise dos fatores que contribuem para SCOT invasão e tratamentos terapêuticos adaptados para evitar a invasão local e metástase distante. Este método também tem o potencial para ser, em última análise combinada com outras modalidades de imagem em uma configuração em vivo.

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Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Uma visão abrangente das técnicas envolvidas na geração de um modelo do rato de câncer oral e monitorização quantitativa de invasão tumoral dentro da língua por meio de microscopia multi-fotão de células marcadas é apresentado. Este sistema pode servir como uma plataforma útil para a avaliação molecular e eficácia de drogas anti-invasivos compostos.

Multi-fotão imagem de invasão das células tumorais em um modelo de camundongo ortotópico de carcinoma epidermóide oral

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

multi-photon-imaging-tumor-cell-invasion-an-orthotopic-mouse-model

Research

JoVE Journal

Medicine

18.9K visualizações.  Mary Babb Randolph Cancer Center, West Virginia University. Uma visão abrangente das técnicas envolvidas na geração de um modelo do rato de câncer oral e monitorização quantitativa de invasão tumoral dentro da língua por meio de microscopia multi-fotão de células marcadas é apresentado. Este sistema pode servir como uma plataforma útil para a avaliação molecular e eficácia de drogas anti-invasivos compostos.

Vídeo: Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and subsequent cell adhesion. After their bladders are transurethrally catheterized and drained, animals are again catheterized to permit insertion of a platinum wire into bladders without damaging the urethra or bladder. The catheters are made of Teflon to serve as an insulator for the wire, which will conduct electrical current into the bladder to create a burn injury. An electrocautery unit is used to deliver 2.5W to the exposed end of the wire, burning away extracellular layers and providing attachment sites for carcinoma cells that are delivered in suspension to the bladder through a subsequent catheterization. Cells remain in the bladder for 90 minutes, after which the catheters are removed and the bladders allowed to drain naturally. The development of tumor is monitored via ultrasound. Specific attention is paid to the catheterization technique in the accompanying video.

Bladder tumors are established in female mice in a minimally invasive fashion through catheterization, local cauterization, and subsequent adhesion of carcinoma cells to the burn sites.

Um modelo ortotópico de câncer de bexiga murino

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and ...

Medicina

Combination Radiotherapy in an Orthotopic Mouse Brain Tumor Model

Glioblastoma multiforme (GBM) are the most common and aggressive adult primary brain tumors1. In recent years there has been substantial progress in the understanding of the mechanics of tumor invasion, and direct intracerebral inoculation of tumor provides the opportunity of observing the invasive process in a physiologically appropriate environment2. As far as human brain tumors are concerned, the orthotopic models currently available are established either by stereotaxic injection of cell suspensions or implantation of a solid piece of tumor through a complicated craniotomy procedure3. In our technique we harvest cells from tissue culture to create a cell suspension used to implant directly into the brain. The duration of the surgery is approximately 30 minutes, and as the mouse needs to be in a constant surgical plane, an injectable anesthetic is used. The mouse is placed in a stereotaxic jig made by Stoetling (figure 1). After the surgical area is cleaned and prepared, an incision is made; and the bregma is located to determine the location of the craniotomy. The location of the craniotomy is 2 mm to the right and 1 mm rostral to the bregma. The depth is 3 mm from the surface of the skull, and cells are injected at a rate of 2 &mu;l every 2 minutes. The skin is sutured with 5-0 PDS, and the mouse is allowed to wake up on a heating pad. From our experience, depending on the cell line, treatment can take place from 7-10 days after surgery. Drug delivery is dependent on the drug composition. For radiation treatment the mice are anesthetized, and put into a custom made jig. Lead covers the mouse's body and exposes only the brain of the mouse. The study of tumorigenesis and the evaluation of new therapies for GBM require accurate and reproducible brain tumor animal models. Thus we use this orthotopic brain model to study the interaction of the microenvironment of the brain and the tumor, to test the effectiveness of different therapeutic agents with and without radiation.

The purpose of this article is to describe the use of an orthotopic glioblastoma model for chemoradiation studies. This article will go though cell processing, implanting, and radiotherapy of the mouse using an intracranial model.

Radioterapia em uma combinação ortotópico modelo de tumor de cérebro de camundongos

Glioblastoma multiforme (GBM) are the most common and aggressive adult primary brain tumors1. In recent years there has been substantial progress in the ...

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy tissue is the root cause of disease and death. For other cancers (e.g. breast, lung, etc.), it is the process of metastasis, in which tumor cells move from a primary tumor mass, colonize distal sites and ultimately contribute to organ failure, that eventually leads to morbidity and mortality 3. It has been estimated that invasion and metastasis are responsible for 90&#37; of cancer deaths 4. As a result, there has been intense interest in identifying the molecular processes and critical protein mediators of invasion and metastasis for the purposes of improving diagnosis and treatment 5.
A challenge for cancer scientists is to develop invasion assays that sufficiently resemble the in vivo situation to enable accurate disease modeling 6. Two-dimensional cell motility assays are only informative about one aspect of invasion and do not take into account extracellular matrix (ECM) protein remodeling which is also a critical element. Recently, research has refined our understanding of tumor cell invasion and revealed that individual cells may move by elongated or rounded modes 7. In addition, there has been greater appreciation of the contribution of collective invasion, in which cells invade in strands, sheets and clusters, particularly in highly differentiated tumors that maintain epithelial characteristics, to the spread of cancer 8.
We present a refined method 9 for examining the contributions of candidate proteins to collective invasion 10. In particular, by engineering separate pools of cells to express different fluorescent proteins, it is possible to molecularly dissect the activities and proteins required in leading cells versus those required in following cells. The use of RNAi provides the molecular tool to experimentally disassemble the processes involved in individual cell invasion as well as in different positions of collective invasion. In this procedure, mixtures of fluorescently-labeled cells are plated on the bottom of a Transwell insert previously filled with Matrigel ECM protein, then allowed to invade "upwards" through the filter and into the Matrigel. Reconstruction of z-series image stacks, obtained by confocal imaging, into three-dimensional representations allows for visualization of collectively invading strands and analysis of the representation of fluorescently-labeled cells in leading versus following positions.

Models of tumor cell invasion into three-dimensional extracellular matrix better reflect the in vivo situation than two-dimensional motility assays. Using matrix invasion assays combined with confocal imaging of fluorescently-labeled cells, detailed information on invasion modes and the distinct contributions of leading versus following cells can be obtained.

Modelagem e imagem 3-Dimensional Invasion cela coletiva

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy ...

An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder tumor model. The mouse model is established by urethral catheterization under inhaled general anesthetic. Chemical burn is then introduced to the bladder mucosa using intravesical silver nitrate solution to disrupt the bladder glycosaminoglycan layer and allows cells to attach. Following several washes with sterile water, human bladder cancer KU-7-luc2-GFP cells are instilled through the catheter into the bladder to dwell for 2 hours. Subsequent growth of bladder tumors is confirmed and monitored by in vivo bladder ultrasound and bioluminescent imaging. The tumors are then treated intravesically with saRNA formulated in lipid nanoparticles (LNPs). Tumor growth is monitored with ultrasound and bioluminescence. All steps of this procedure are demonstrated in the accompanying video.

Establishing an orthotopic bladder tumor model to evaluate antitumor effects of intravesically delivered saRNA and monitoring tumor growth by ultrasound and bioluminescent imaging.

Um modelo de tumor de bexiga ortotópico e Avaliação de Tratamento de sarna intravesical

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder ...

An Orthotopic Mouse Model of Anaplastic Thyroid Carcinoma

Several types of animal models of human thyroid carcinomas have been established, including subcutaneous xenograft and orthotopic implantation of cancer cells into immunodeficient mice. Subcutaneous xenograft models have been valuable for preclinical screening and evaluation of new therapeutic treatments. There are a number of advantages to using a subcutaneous model; 1) rapid, 2) reproducible, and 3) tumor establishment, growth, and response to therapeutic agents may be monitored by visual inspection. However, substantial evidence has shed light on the short-comings of subcutaneous xenograft models1-3. For instance, medicinal treatments demonstrating curative properties in subcutaneous xenograft models often have no notable impact on the human disease. The microenvironment of the site of xenographic transplantation or injection lies at the heart of this dissimilarity.
Orthotopic tumor xenograft models provide a more biologically relevant context in which to study the disease. The advantages of implanting diseased cells or tissue into their anatomical origin equivalent within a host animal includes a suitable site for tumor-host interactions, development of disease-related metastases and the ability to examine site-specific influence on investigational therapeutic remedies. Therefore, orthotopic xenograft models harbor far more clinical value because they closely reproduce human disease. For these reasons, a number of groups have taken advantage of an orthotopic thyroid cancer model as a research tool4-7.
Here, we describe an approach that establishes an orthotopic model for the study of anaplastic thyroid carcinoma (ATC), which is highly invasive, resists treatment, and is virtually fatal in all diagnosed patients. Cultured ATC cells are prepared as a dissociated cellular suspension in a solution containing a basement membrane matrix. A small volume is slowly injected into the right thyroid gland. Overall appearance and health of the mice are monitored to ensure minimal post-operative complications and to gauge pathological penetrance of the cancer. Mice are sacrificed at 4 weeks, and tissue is collected for histological analysis. Animals may be taken at later time-points to examine more advance progression of the disease. Production of this orthotopic mouse model establishes a platform that accomplishes two objectives: 1) further our understanding of ATC pathology, and 2) screen current and future therapeutic agents for efficacy in combating ATC.

Generation of an orthotopic mouse model of anaplastic thyroid carcinoma is described here. This technique employs surgical placement of human anaplastic thyroid cancer cells into the thyroid of immunodeficient mice, thus creating a more clinically relevant setting to study disease progression as well as screen innovative therapeutic interventions.

Um modelo de camundongo ortotópico de Carcinoma anaplásico da tiróide

Several types of animal models of human thyroid carcinomas have been established, including subcutaneous xenograft and orthotopic implantation of cancer ...

An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology rely on the injection of a suspension of glioma cells into the brain parenchyma following incision of the dura-mater. Whereas the cells have to be injected superficially to be accessible to intravital two-photon microscopy, superficial injections fail to recapitulate the physiopathological conditions. Indeed, escaping through the injection tract most tumor cells reach the extra-dural space where they expand abnormally fast in absence of mechanical constraints from the parenchyma.
Our improvements consist not only in focally implanting a glioma spheroid rather than injecting a suspension of glioma cells in the superficial layers of the cerebral cortex but also in clogging the injection site by a cross-linked dextran gel hemi-bead that is glued to the surrounding parenchyma and sealed to dura-mater with cyanoacrylate. Altogether these measures enforce the physiological expansion and infiltration of the tumor cells inside the brain parenchyma. Craniotomy was finally closed with a glass window cemented to the skull to allow chronic imaging over weeks in absence of scar tissue development.
Taking advantage of fluorescent transgenic animals grafted with fluorescent tumor cells we have shown that the dynamics of interactions occurring between glioma cells, neurons (e.g. Thy1-CFP mice) and vasculature (highlighted by an intravenous injection of a fluorescent dye) can be visualized by intravital two-photon microscopy during the progression of the disease.
The possibility to image a tumor at microscopic resolution in a minimally compromised cerebral environment represents an improvement of current GBM animal models which should benefit the field of neuro-oncology and drug testing.

We have established a cortical orthotopic glioblastoma model in mice for intravital two-photon microscopy that recapitulates the biophysical constraints normally at play during the growth of the tumor. A chronic glass window replacing the skull above the tumor enables the follow-up of the tumor progression over time by two-photon microscopy.

Um Glioblastoma Rato modelo ortotópico Manter restrições Cérebro parênquima físicas e Adequado para intravital dois fótons Microscopia

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the cornea, which can be caused by trauma, keratoplasty or infectious disease, breaks down the so called &lsquo;angiogenic privilege' of the cornea and forms the basis of multiple visual pathologies that may even lead to blindness. Although there are several treatment options available, the fundamental medical need presented by corneal neovascular pathologies remains unmet. In order to develop safe, effective, and targeted therapies, a reliable model of corneal NV and pharmacological intervention is required. Here, we describe an alkali-burn injury corneal neovascularization model in the mouse. This protocol provides a method for the application of a controlled alkali-burn injury to the cornea, administration of a pharmacological compound of interest, and visualization of the result. This method could prove instrumental for studying the mechanisms and opportunities for intervention in corneal NV and other neovascular disorders.

Neovascularization (NV) of the cornea can complicate multiple visual pathologies. Utilizing a controlled, alkali-burn injury model, a quantifiable level of corneal NV can be produced for mechanistic study of corneal NV and evaluation of potential therapies for neovascular disorders.

Um ferimento Modelo Alkali queima de córnea neovascularização no Rato

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the ...

RNAscope for In situ Detection of Transcriptionally Active Human Papillomavirus in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

The &#39;gold standard&#39; for oncogenic HPV detection is the demonstration of transcriptionally active high-risk HPV in tumor tissue. However, detection of E6/E7 mRNA by quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) requires RNA extraction which destroys the tumor tissue context critical for morphological correlation and has been difficult to be adopted in routine clinical practice. Our recently developed RNA in situ hybridization technology, RNAscope, permits direct visualization of RNA in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue with single molecule sensitivity and single cell resolution, which enables highly sensitive and specific in situ analysis of any RNA biomarker in routine clinical specimens. The RNAscope HPV assay was designed to detect the E6/E7 mRNA of seven high-risk HPV genotypes (HPV16, 18, 31, 33, 35, 52, and 58) using a pool of genotype-specific probes. It has demonstrated excellent sensitivity and specificity against the current &#39;gold standard&#39; method of detecting E6/E7 mRNA by qRT-PCR. HPV status determined by RNAscope is strongly prognostic of clinical outcome in oropharyngeal cancer patients.

RNAscope for In situ Detection of Transcriptionally Active Human Papillomavirus in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

The presence of high-risk HPV in head and neck tumor tissue is associated with favorable outcomes. The recently developed RNA in situ hybridization technique called RNAscope allows direct visualization of HPV E6/E7 mRNA in FFPE tissue sections.

RNAscope para<em&gt; Em situ</em&gt; Detecção de Papilomavírus Humano transcricionalmente ativo em Cabeça e Pescoço Carcinoma de células escamosas

The &#39;gold standard&#39; for oncogenic HPV detection is the demonstration of transcriptionally active high-risk HPV in tumor tissue. However, detection ...

Dynamic Contrast Enhanced Magnetic Resonance Imaging of an Orthotopic Pancreatic Cancer Mouse Model

Dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging (DCE-MRI) has been limitedly used for orthotopic pancreatic tumor xenografts due to severe respiratory motion artifact in the abdominal area. Orthotopic tumor models offer advantages over subcutaneous ones, because those can reflect the primary tumor microenvironment affecting blood supply, neovascularization, and tumor cell invasion. We have recently established a protocol of DCE-MRI of orthotopic pancreatic tumor xenografts in mouse models by securing tumors with an orthogonally bent plastic board to prevent motion transfer from the chest region during imaging. The pressure by this board was localized on the abdominal area, and has not resulted in respiratory difficulty of the animals. This article demonstrates the detailed procedure of orthotopic pancreatic tumor modeling using small animals and DCE-MRI of the tumor xenografts. Quantification method of pharmacokinetic parameters in DCE-MRI is also introduced. The procedure described in this article will assist investigators to apply DCE-MRI for orthotopic gastrointestinal cancer mouse models.

The goal of this protocol is to apply dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging (DCE-MRI) for orthotopic pancreatic tumor xenografts in mice. DCE-MRI is a non-invasive method to analyze microvasculature in a target tissue, and useful to assess vascular response in a tumor following a novel therapy.

Contraste Dinâmico aprimorada Ressonância Magnética de um Modelo de câncer de pâncreas Orthotopic Rato

Dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging (DCE-MRI) has been limitedly used for orthotopic pancreatic tumor xenografts due to severe ...

A "Patient-Like" Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of cancer metastasis are still unclear. Animal models are essential for elucidating the mechanisms and for evaluating novel strategies for the treatment of metastatic cancers. Here, an in-depth description of a &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model for exploring the mechanisms of metastasis of solid organ tumors is provided. The survival surgical implantation of BNL 1ME A.7R.1 mouse hepatocellular carcinoma cells directly into the liver (the organ of origin) of the inbred wild-type immune competent laboratory mouse strain, BALB/c is described. The success and reproducibility of this methodology recommends it for widespread use in elucidating the biological mechanisms of solid organ cancer metastasis.

A &quot;Patient-Like&quot; Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis

The metastatic spread of cancer is the major cause of cancer-related deaths. We provide an in-depth description of our survival surgery methodology for establishing a &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model system for studying the mechanisms of metastasis in solid organ tumors.

A &quot;Patient-Like&quot; Orthotopic Singênico Rato Modelo de carcinoma hepatocelular Metástase

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of ...