Name: a cancer cell spheroid assay to assess invasion in a 3d setting
Uploaded: 2015-11-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 34 s
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Financiado pelo NIH CA051008 subvenções P30 CA009686 e T32 (ATR).

1. Geração de esferóides <ol><li> Prepare a suspensão de células individuais para pendurar culturas gota a separar culturas aderentes de células de cancro de ~ 70% de confluência utilizando uma lavagem com PBS, seguido por exposição a uma solução tripsina-EDTA 0,05%. <ol><li> Neutraliza-se a solução de tripsina com meio de cultura de células e contagem das células, utilizando-se uma alíquota da suspensão de células. Nota: O meio de cultura de células específico dependerá da linha celular a ser testada. Seguir as recomendações da ATCC media, onde o meio de cultura celular é normalmente de DMEM + 10% de FBS. Mais informação pode ser encontrada na Tabela Materiais. </li><li> Efectuar uma diluição para permitir a sementeira de 500-1000 células por 20 ul gota de meio de cultura celular. </li></ol></li><li> Adquirir 10 cm de placa e adicionam-se 5 ml de PBS estéril para o fundo. Nota: Esta etapa protege o enforcamento cai de evaporação. Baixo custo &quot;bacteriológicos&quot; pratos grau pode ser usado em lugar de pratos de grau de cultura de células, como as células não irá contactuar a superfície de cultura. </li><li> Usar uma pipeta multi-canal para transferir gotas de 20 ul da suspensão de células diluída com a superfície interna da tampa. <ol><li> Pipetar 40 gotas (5 linhas de 8 gotas) sobre a tampa da placa de 10 cm. </li></ol></li><li> Inverter a tampa e coloque sobre o prato de cultura. Incubam-se as culturas de gota em suspensão a 37 ° C durante 72 h, para gerar esferóides. <ol><li> Vire a tampa de uma forma confiante, ainda controlada. Nota: Inverter a tampa muito rápido ou muito lento pode causar as gotículas de mudar. Algumas linhas de células podem formar esferóides em 48 horas ou menos, enquanto outros podem exigir mais do que 72 horas para produzir agregados compactos. </li></ol></li></ol> 2. Incorporação de Spheroids em Matrix 3D <ol><li> Descongelar uma aliquota de crescimento reduzida de factor porão materiais de membrana, a 4 ° C durante a noite antes de incorporação dos esferóides. <ol><li> Opcional: poços camada com ECM de antecedência para evitar a interação potencial esferóide com o tecido culture superfície. <ol><li> Pipetar 200 l de ECM por cavidade em uma placa de 24 cavidades. </li><li> Inclinar a placa para assegurar que a ECM cobre toda a superfície dos poços. </li><li> Retirar cuidadosamente o excesso ECM com uma pipeta. </li><li> Incubar a placa até que os poços estão secas: 3 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. </li></ol></li></ol></li><li> Recolher os esferóides inclinando a tampa da placa de cultura de tecidos e de partilha dos meios de comunicação. Transferir os meios de comunicação com os esferóides em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Permitir que 10 min durante os esferóides para assentar no fundo do tubo de microcentrífuga. Esferóides deve ser visível a olho nu. </li><li> Misturar 100 mL de materiais de membrana basal com 100 ul de frio (4 ° C) colagénio do tipo I, em um tubo pré-refrigerada separada. Manter-se a mistura a 4 ° C para evitar qualquer gel solidifique prematuramente. <ol><li> Utilize pontas de pipetas pré-refrigerados se transferir pequenos volumes. </li><li> Dê cuidado aomisturando o material de membrana basal e colágeno tipo I para evitar a formação de bolhas de ar. Nota: As bolhas de ar podem dificultar a imagiologia mais tarde no protocolo de se tornar incorporado no gel. </li></ol></li><li> Aspirar os esferóides a partir da porção inferior 40 ul do tubo de microcentrífuga, e combinar com o material da membrana basal / mistura de colagénio do tipo I. Tenha cuidado para evitar a formação de bolhas de ar quando a mistura. Nota: A solução contendo 100 ul de materiais de membrana basal, 100 ul de colagénio do tipo I, e 40 ul de esferóides criará material suficiente para 4 3D culturas independentes. Isto pode ser escalado para cima ou para baixo. </li><li> Pipetar 40 ul de gotas da mistura viscosa para os centros das cavidades de uma placa de 24 poços. Manter o nível de placa para evitar que a mistura de correr para o lado do poço. Nota: Uma coluna única na placa de 24 cavidades - 4 poços - é recomendado para cada condição a ser testado. </li><li> Colocar a placa intoa 37 ° C incubadora e deixar em repouso por 30 min. A cultura 3D irá polimerizar durante este período. </li><li> Lentamente submergir as culturas 3D em 1 mL de meios de cultura celular. <ol><li> Certifique-se de que a mídia está quente ao adicioná-lo nos poços para promover ainda mais a polimerização gel. </li><li> Passo crítico: Delicadamente adicionar a mídia para as culturas 3D. Pipetando os meios muito rapidamente nas cavidades pode levar ao descolamento das culturas em 3D a partir da superfície da cultura de tecidos. </li></ol></li></ol> 3. Monitoramento e Análise Spheroid Invasion <ol><li> Invasão imagem dos esferóides na matriz 3D circundante em pontos de tempo decidido pelo investigador. Adquirir fotografias usando um microscópio invertido com a lente objetiva de 20x. Nota: Ideal pontos de tempo irá variar de acordo com a linha de células que está sendo testado. Linhas de células mais invasivos começará sua saída dos esferóides logo após o plaqueamento e, portanto, levar fotografia inicials dentro de um par de horas após o plaqueamento. Geralmente, as fotografias são tiradas a 0 h (após o plaqueamento), 24 horas e 48 horas. Invasão conclui tipicamente de 24 a 48 h após o plaqueamento. </li><li> Quantificar a capacidade invasiva utilizando software de análise de imagem como Imagem J. <ol><li> Analise invasão celular como a distância a partir da borda do esferóide. <ol><li> Use a ferramenta straight draw para marcar o raio e / ou a distância máxima invasiva. </li><li> Clique em &quot;Analisar&quot; no menu superior e clique em &quot;Measure&quot; para exibir a medição do comprimento. </li></ol></li><li> Analisar invasão como a área total invasiva fora do esferóide. <ol><li> Use a ferramenta de desenhar à mão livre para traçar a fronteira do esferóide e / ou total área invasiva. </li><li> Clique em &quot;Analisar&quot; no menu superior e clique em &quot;Measure&quot; para exibir a medição da área. </li></ol></li><li> Use um plugin como ROI Ferramentas do Gerenciador de criar medidas para uma pilha de imagens. </li></ol>
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The authors declare that they have no competing financial interests.

Este estudo foi avaliado o desempenho de um painel de linhas celulares de cancro em um ensaio de invasão esferóide (Tabela 1). De um modo geral, descobrimos que a formação do esferóide é aumentada em mais as linhas de células epiteliais de aspecto, em que a presença de junções célula-célula promove a formação de uma arquitectura do tipo esferóide. Linhas celulares conhecidas que foram submetidos a uma transição epitelial-mesenquimal, tais como MDA-MB-231 não formar esferóides na cultu...

Está provado que a motilidade célula cancerosa é preditiva do potencial metastático, uma vez que tal comportamento facilita a invasão através da membrana basal e da entrada no sistema circulatório 1. Mais investigação sobre a motilidade tem-se centrado na forma como as células se comportam de uma configuração bidimensional (2D), embora se tornando-se amplamente reconhecido que o movimento das células em uma matriz tridimensional (3D) é mais representativo de como estas mesmas células vão realmente 2 comportar in vivo. Sistemas de cultura 3D são cada vez mais usados ​​para estudar comportamentos celulares que vão desde a morfologia celular, a cinética de crescimento e de sensibilidade às drogas 3. O desejo de controlar a invasão de células do cancro no contexto de um meio 3D levou à síntese de técnicas anteriormente estabelecidas, envolvendo a geração de agregados de células de 3D ​​(esferóides) através do método de cultura de gota em suspensão 4, seguido por incorporação destes esferóides numa extracelular 3D matriz (ECM) composta de colágeno e da membrana basal materiais 5. Este método visa aperfeiçoar estas técnicas anteriormente estabelecidas, fornecendo uma abordagem simplificada que pode ser facilmente utilizado para comparar invasão sob uma variedade de condições experimentais. Mais formas tradicionais para avaliar a motilidade celular in vitro são o ensaio da ferida-zero e o ensaio transwell 6. O primeiro ensaio de motilidade celular descreve uma configuração em 2D, e é, por conseguinte, independente de uma variedade de características críticas para a invasão in vivo, por exemplo, actividade de protease de 7. O ensaio de invasão de células Transwell pode melhor modelo, quando os insertos de cavidades são revestidas com substratos ECM, mas apenas um único parâmetro, isto é, o aparecimento de células sobre a superfície oposta da membrana é medida, e muitas nuances de invasão de células não são, portanto, facilmente observáveis. Em contraste com estas técnicas, o ensaio de invasão de células de cancro esferóide (figura 1 &lt;/ forte&gt;) permite a monitorização em tempo real da invasão celular, num ambiente que não só é fisiologicamente relevante, mas também permite características importantes específica da linha de células a serem visualizadas, tais como migração de células indivíduo vs colectiva 8. Este método também proporciona vantagens em relação aos ensaios padrão de crescimento de cultura 3D. A geração de agregados celulares através do método de gota em suspensão inicialmente restringe o movimento celular, de modo a que as células serão incentivados a invadir após esta restrição será levantada. Além disso, uma vez que a restrição é levantada, a saída de células irá prosseguir numa direcção uniforme, que pode então ser convenientemente quantificado. Os materiais de ECM mais populares usados ​​para esferóides ensaios de células de câncer são Matrigel e colágeno tipo I, em que cada um destes componentes tem papéis importantes e distintas em influenciar o comportamento metastático. Matrigel é uma mistura de proteínas segregadas por células de sarcoma produzidos Engelbreth Holm Swarm-rato, e é enriquecido em basemeproteínas da membrana nt, tais como laminina, entactina, e colágeno tipo IV 9. Por esta razão Matrigel é doravante referido como &quot;materiais de membrana basal.&quot; Estes materiais de membrana basal proporcionar ligandos essenciais necessários para adesão integrina durante a invasão de células de cancro 10, além de muitas outras proteínas que exercem uma variedade de efeitos no comportamento das células 11. Em comparação, o colagénio do tipo I, geralmente preparado a partir de digestões de ácido dos tendões e outras estruturas de colagénio densas 12, é um material de matriz muito mais simples que serve como um elemento estrutural do tecido do estroma e tecidos conjuntivos de suporte e órgãos do corpo. Foi demonstrado que as características físicas do colagénio pode regular um número de características de motilidade celular; Por exemplo, o alinhamento de fibras de colagénio na interface tumor-estromal permite que as células cancerosas migram subsequentemente ao longo dessas fibrilas ao invadir o estroma 13 em. No ensaio aqui apresentado, tanto o colágeno tipo I e materiais da membrana basal são utilizados como ferramentas para estudar as interações célula de câncer 3D-estroma. O efeito de inibição ou estimulação de caminhos que controlam invasão pode ser monitorizada após as células terem sido incorporados na matriz 3D. As células podem ser pré-tratados durante o crescimento nas gotas de suspensão ou aquando da transferência para a cultura 3D, dependendo se um tratamento prolongado será necessário para modular a invasão. Para tratamentos mais curtos, recomenda-se que a droga ser misturada com a suspensão esferóide após a recolha, assim como os meios de comunicação que vai rodear as culturas em 3D, para facilitar a exposição adequada da droga para as células. Em seguida, as células normais ou associados a tumores do estroma podem ser misturados com o material de matriz para avaliar o seu papel na modulação da invasão de células tumorais, ou para determinar o comportamento de células influências parácrino e autócrino de sinalização. Esta ideia foi demonstrado em um estudo onde a co-cultura de colsobre câncer e células endoteliais em gotas de suspensão levou a uma rede vascular dentro dos esferóides 14. Finalmente, os componentes ECM também pode ser alterado, como a invasão da célula cancerosa é afetado por diferentes substratos 15. O método apresentado abaixo, assim, fornecer um quadro para a avaliação da invasão da célula cancerosa sob uma variedade de condições. De um modo geral verificou-se que nem todas as linhas de células irá criar esferóides nas gotas de suspensão e linhas de células epiteliais de aspecto tipicamente formar esferas regulares.

<table><tbody><tr><td>Matrigel Growth Factor Reduced</td><td>Corning</td><td>CB-40234</td><td></td></tr><tr><td>Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg</td><td>Millipore</td><td>08-115</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-12</td><td></td></tr><tr><td>100 mm TC-treated Dishes</td><td>Corning Incorporated</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>24-well TC-treated Plates</td><td>NEST Biotechnlology</td><td>702001</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX-71 Inverted Microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and LNCaP cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a cancer cell spheroid assay to assess invasion in a 3d setting

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential. Most traditional assays, however, do not examine these invasive features in a three-dimensional environment and the resulting data suffer from reduced biological applicability. Here an approach is presented to visualize the invasive ability of cell lines in a physiologically relevant setting. The cancer cell spheroid invasion assay first utilizes gravity to generate spheroids within drops of media that hang from the lid of a cell culture dish. Next, these spheroids are embedded in a 3D matrix consisting of a mixture of basement membrane materials and type I collagen. Cancer cell egression from the spheroids into the surrounding matrix is then monitored over time. The method described here can be modified to examine invasion after coculture of different cell types, inclusion of drugs/inhibitors, or alterations in extracellular matrix (ECM) constituents.

Usando o ensaio de invasão esferóide (figura 1), um painel de linhas celulares de cancro foi testado quanto à sua capacidade para formar esferóides, bem como para a quantidade de egresso de células expostas após o implante numa matriz 3D que consiste em materiais de membrana basal e colagénio tipo I (Tabela 1). Estes resultados demonstram que nem toda linha celular de cancro criará esferóides bem formadas, onde as linhas de células que possuem uma morfologia epitelial in v...

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A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting

This method evaluates cancer cell invasion from spheroids into a surrounding 3D matrix. Spheroids are generated via the hanging drop culture method and then embedded in a matrix comprised of basement membrane materials and type I collagen. Invasion out of the spheroids is subsequently monitored.

A Cancer Cell Spheroid Ensaio para avaliar a invasão em um ambiente 3D

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential.  Most traditional assays, however, do not examine these ...

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Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

Ensaio esferóide para TGF-β Medida induzida Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

Medicina

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor microenvironment. To obtain more reliable in vitro results, several three-dimensional (3D) cell culture assays have been introduced. These assays allow cancer cells to interact with the extracellular matrix. This interaction affects cell behavior, such as proliferation and invasion, as well as cell morphology. Additionally, this interaction could induce or suppress the expression of several pro- and anti-tumorigenic molecules. Spheroid invasion assay was developed to provide a suitable 3D in vitro method to study cancer cell invasion. Currently, animal-derived matrices, such as mouse sarcoma-derived matrix (MSDM) and rat tail type I collagen, are mainly used in the spheroid invasion assays. Taking into consideration the differences between the human tumor microenvironment and animal-derived matrices, a human myoma-derived matrix (HMDM) was developed from benign uterus leiomyoma tissue. It has been shown that HMDM induces migration and invasion of carcinoma cells better than MSDM. This protocol provided a simple, reproducible, and reliable 3D human tumor-based spheroid invasion assay using the HMDM/fibrin matrix. It also includes detailed instructions on imaging and analysis. The spheroids grow in a U-shaped ultra-low attachment plate within the HMDM/fibrin matrix and invade through it. The invasion is daily imaged, measured, and analyzed using ilastik and Fiji ImageJ software. The assay platform was demonstrated using human laryngeal primary and metastatic squamous cell carcinoma cell lines. However, the protocol is suitable also for other solid cancer cell lines.

Tumor microenvironment is an essential part of cancer growth and invasion. To mimic carcinoma progression, a biologically relevant human matrix is needed. This protocol introduces an improvement for the in vitro three-dimensional spheroid invasion assay by applying a human leiomyoma-based matrix. The protocol also introduces a computer-based cell invasion analysis.

Matriz tumor-baseada inteiramente humana no ensaio tridimensional da invasão de spheroid

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Pesquisa do câncer

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor stroma, host fibroblasts are stimulated by cancer cells to differentiate. Thus, they acquire a phenotype that contributes to the tumor microenvironment and supports tumor progression. By using the spheroid model, we have set up such a 3D in vitro model system, in which we analyzed the role of laminin-332 and its receptor integrin &#945;3&#946;1 in this differentiation process. This spheroid model system not only reproduces the tumor microenvironment conditions in a more accurate way, but also is a very versatile model since it allows different downstream studies, such as immunofluorescent staining of both intra- and extracellular markers, as well as deposited extracellular matrix proteins. Moreover, transcriptional analyses by qPCR, flow cytometry and cellular invasion can be studied with this model. Here, we describe a protocol of a spheroid model to assess the role of CAFs&#39; integrin &#945;3&#946;1 and its ectopically deposited ligand, laminin-332, in differentiation and in supporting the invasion of pancreatic cancer cells.

The goal of this protocol is to establish a 3D in vitro model to study the differentiation of cancer-associated fibroblasts (CAFs) in a tumor bulk-like environment, which can be addressed in different analysis systems, such as immunofluorescence, transcriptional analysis and life cell imaging.

Um modelo de spheroid 3D como um sistema mais fisiológico para fibroblastos associados ao cancro diferenciação e invasão in vitro estudos

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited number of assays allow for direct monitoring and mechanistic insights into the interactions between tumor and immune cells, amongst which, T-cells play a significant role in executing the cytotoxic response of the adaptive immune system to cancer cells. Most assays are based on two-dimensional (2D) co-culture of cells due to the relative ease of use but with limited representation of the invasive growth phenotype, one of the hallmarks of cancer cells. Current three-dimensional (3D) co-culture systems either require special equipment or separate monitoring for invasion of co-cultured cancer cells and interacting T-cells.
Here we describe an approach to simultaneously monitor the invasive behavior in 3D of cancer cell spheroids and T-cell cytotoxicity in co-culture. Spheroid formation is driven by enhanced cell-cell interactions in scaffold-free agarose microwell casts with U-shaped bottoms. Both T-cell co-culture and cancer cell invasion into type I collagen matrix are performed within the microwells of the agarose casts without the need to transfer the cells, thus maintaining an intact 3D co-culture system throughout the assay. The collagen matrix can be separated from the agarose cast, allowing for immunofluorescence (IF) staining and for confocal imaging of cells. Also, cells can be isolated for further growth or subjected to analyses such as for gene expression or fluorescence activated cell sorting (FACS). Finally, the 3D co-culture can be analyzed by immunohistochemistry (IHC) after embedding and sectioning. Possible modifications of the assay include altered compositions of the extracellular matrix (ECM) as well as the inclusion of different stromal or immune cells with the cancer cells.

The presented approach simultaneously evaluates cancer cell invasion in 3D spheroid assays and T-cell cytotoxicity. Spheroids are generated in a scaffold-free agarose multi-microwell cast. Co-culture and embedding in type I collagen matrix are performed within the same device which allows to monitor cancer cell invasion and T-cell mediated cytotoxicity.

Monitoramento da invasão celular cancerígena e citotoxicidade de células T na cultura 3D

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

Modelos 3D em Biologia do Câncer: Dinâmica de Invasão em Heterosferóides

Alternative Strategy to Analyze In Vitro Cell Invasion of 3D Cultures

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) cultures. Invasion is a cellular outcome of utmost interest in cancer biology. In this protocol, we have devised an alternative strategy for evaluating cancer cell invasion in vitro, employing heterospheroids comprised of oral squamous cell carcinoma (OSCC), cancer-associated fibroblasts (CAF), and monocytes. These heterospheroids aim to mimic the tumor microenvironment (TME), including two relevant non-neoplastic cell types alongside the cancer cells. Each cell type was labeled with vital fluorescent markers emitting in distinct wavelengths before spheroid formation. Once formed, heterospheroids were seeded onto a layer of human leiomyoma-derived extracellular matrix in the upper compartment of a microporous membrane. Invasion was assessed in the z-axis using confocal microscopy. Digital images were obtained in the corresponding fluorescent channels at 10 &#181;m intervals, covering a depth of 90 &#181;m in the z-axis. Analysis was performed using freeware image software by calculating the integrated fluorescence intensity in each image and fluorescence channel. This approach enables a more dynamic analysis of cell invasion patterns in a multilayered context, as well as the examination of spatial co-localization of different cell types during invasion.

Autor em destaque: decifrando a diafonia entre câncer e células imunológicas durante a progressão do câncer de cabeça e pescoço

Invasion is a major biological phenomenon in the development and progression of cancer. This process is influenced by non-neoplastic cells and components of the tumor microenvironment. The purpose of this study is to describe an alternative method for analyzing tumor cell invasion in vitro using three-dimensional (3D) cultures.

Estratégia alternativa para analisar a invasão celular in vitro de culturas 3D

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Tridimensional (3D) Tumor Esferóide Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

<meta charset="utf8"></head><body>Examinando as interações esferoides macrófagos-tumor em uma configuração de matriz de colágeno 3D

A Macrophage-Tumor Spheroid Co-Invasion Assay

The interaction of immune and cancer cells and their respective impact on metastasis represents an important aspect of cancer research. So far, only a few protocols are available that allow an in vitro approximation of the in vivo situation. Here, we present a novel approach to observing the impact of human macrophages on the invasiveness of cancer cells, using tumor spheroids of H1299 non-small cell lung carcinoma cells embedded in a three-dimensional (3D) collagen I matrix. With this co-cultivation setup, we tested the impact of small interfering RNA (siRNA)-based depletion of regulatory factors in macrophages on the 3D invasion of cancer cells from the tumor spheroid compared to controls. This method allows the determination of different parameters, such as spheroid area or the number of invading cancer cells, and thus, to detect differences in cancer cell invasion. In this article, we present the respective setup, discuss the subsequent analysis, as well as the advantages and potential pitfalls of this method.

<meta charset="utf8"></head><body>Um ensaio de co-invasão de esferoides macrófagos-tumores

Here, we present a protocol to investigate the interaction of primary human monocyte-derived macrophages with a tumor spheroid in a three-dimensional (3D) collagen I matrix, with the possibility to compare the impact of soluble and physical properties of the microenvironment on cell invasion.

Um ensaio de co-invasão de esferoides macrófagos-tumores

The interaction of immune and cancer cells and their respective impact on metastasis represents an important aspect of cancer research. So far, only a few ...

A Cancer Cell Spheroid Ensaio para avaliar a invasão em um ambiente 3D

Resumo

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Ensaio esferóide para TGF-β Medida induzida Invasion

Matriz tumor-baseada inteiramente humana no ensaio tridimensional da invasão de spheroid

Um modelo de spheroid 3D como um sistema mais fisiológico para fibroblastos associados ao cancro diferenciação e invasão in vitro estudos

Monitoramento da invasão celular cancerígena e citotoxicidade de células T na cultura 3D

Estratégia alternativa para analisar a invasão celular in vitro de culturas 3D

Estratégia alternativa para analisar a invasão celular in vitro de culturas 3D

Estratégia alternativa para analisar a invasão celular in vitro de culturas 3D

Tridimensional (3D) Tumor Esferóide Invasion Assay

Um ensaio de co-invasão de esferoides macrófagos-tumores

Um ensaio de co-invasão de esferoides macrófagos-tumores