Ce protocole fournit un moyen simple et rentable d’isoler les ASC sans l’utilisation d’enzymes dures ou d’étapes de centrifugation, ce qui peut modifier le phénotype cellulaire et le comportement. L’absence de mesures sévères donne moins de cellules manipulées que celles isolées à l’aide d’enzymes et de centrifugation, minimisant les questions quant à savoir si les observations expérimentales sont un artefact de la méthode d’isolement. Cette méthode d’explantation peut générer des ASC cliniques pertinentes à introduire dans un patient pour traiter une variété de maladies ou d’élargir dans la vie se permettre des applications de recherche.
Il est difficile d’expliquer pleinement la méthode de hachage en mots. La démonstration visuelle peut servir à d’autres scientifiques les tracas de l’apprentissage de briser le tissu eux-mêmes. Des méthodes d’explantation similaires peuvent être utilisées pour isoler d’autres populations de SMC, comme celles des tissus ombilicaux.
Pour émincer les échantillons de tissu d’abdominoplastie, transférez d’abord le tissu au couvercle d’une plaque stérile de 100 millimètres. Ensuite, utilisez une aiguille stérile pour maintenir un morceau de tissu en place et utilisez un scalpel stérile pour couper le tissu en moins d’un millimètre. Transférer le tissu dans un tube frais et inverser ou secouer l’échantillon cinq à six fois pour assurer le mélange de toutes les couches.
Puis, avec une spatule stérile, transférer 2,5 à cinq millilitres de tissu à une plaque de culture de tissu traitée par plasma à gaz sous vide de 100 millimètres. Mesurer le volume de l’échantillon en versant dans un tube de centrifugeuse fraîche. Ensuite, ajoutez un volume équivalent de supports de culture tissulaire à la plaque et faites pivoter doucement la plaque pour mélanger le contenu.
Incuber la plaque à 37 degrés Celsius en dioxyde de carbone de cinq pour cent jusqu’à ce qu’un nombre suffisant de cellules soient vues sur la base de la plaque. Une fois qu’un nombre suffisant de cellules sont notés sur la plaque ou après sept jours, selon le plus tôt, enlever tous les morceaux de tissu restants. Ensuite, la culture des ASC dans les médias de culture tissulaire jusqu’à ce qu’ils atteignent 70% confluent ou jusqu’à ce que les grappes deviennent denses à quel point les cellules doivent être passages.
Rincer délicatement la plaque avec 1X salin tamponné au phosphate. Pour trypsiniser les cellules adhérentes, aspirer la solution saline tamponnée au phosphate, ajouter un millilitre de trypsine complété par 0,25% EDTA à chaque plaque et incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ajouter une petite quantité de supports à la plaque pour désactiver la trypsine.
Ensuite, pipette doucement la trypsine des médias à partir du haut de la plaque vers le bas, perdre toutes les cellules faiblement attachées de la plaque. Pour ensemencer les cellules, ajoutez d’abord du média à la plaque. Ensuite, ajoutez les cellules d’une manière dropwise, puis faites tourbillonner la plaque pour assurer une distribution uniforme à travers la plaque.
Après trois passages, procéder à des analyses de cytométrie et de différenciation. Après trois passages, des ASCs isolés des échantillons de lipoaspirate et d’abdominoplastie se sont trouvés pour avoir une morphologie et un phénotype de MSC, semblables aux ASCs isolés suivant une digestion enzymatique. Comme d’autres MSC, les ASC isolés d’explant sont négatifs pour CD45 et positifs pour CD73, CD90, et CD105.
Lors du hachage du tissu, la surface de chaque pièce doit être suffisamment grande pour que les ASC migrent hors du tissu. Ce sont des cellules souches fondamentales qui peuvent être utilisées pour un large éventail d’applications. Les ASC isolés peuvent être utilisés pour toute application en aval, in vivo ou in vitro.
