Questo protocollo fornisce un modo semplice ed economico per isolare gli ASC senza l'uso di enzimi aspre o passaggi di centrifugazione, che possono alterare il fenotipo e il comportamento delle cellule. La mancanza di passaggi duri produce cellule meno manipolate di quelle isolate usando enzimi e centrifugazione, riducendo al minimo le domande sul fatto che le osservazioni sperimentali siano un artefatto del metodo di isolamento. Questo metodo di espianto può generare ASC clinici rilevanti da introdurre in un paziente per trattare una varietà di malattie o espandersi nella vita permettersi applicazioni di ricerca.
È difficile spiegare appieno il metodo di tritacarne a parole. La dimostrazione visiva può servire ad altri scienziati il fastidio di imparare a spezzare il tessuto stesso. Metodi di espianto simili possono essere utilizzati per isolare altre popolazioni di MSC, come quelle dei tessuti ombelicali.
Per tritare i campioni di tessuto addominoplastica, prima trasferire il tessuto sul coperchio di una piastra sterile da 100 millimetri. Quindi utilizzare un ago sterile per tenere un pezzo di tessuto in posizione e utilizzare un bisturi sterile per tagliare il tessuto in meno di un millimetro. Trasferire il tessuto su un tubo fresco e invertire o scuotere il campione da cinque a sei volte per garantire la miscelazione di tutti gli strati.
Quindi, con una spatola sterile, trasferire da 2,5 a cinque millilitri di tessuto in una piastra di coltura tissutale trattata con plasma sotto vuoto da 100 millimetri. Misurare il volume del campione versando in un tubo di centrifuga fresco. Quindi, aggiungere un volume equivalente di mezzi di coltura tissutale alla piastra e ruotare delicatamente la piastra per mescolare il contenuto.
Incubare la piastra a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al cinque per cento fino a quando un numero sufficiente di cellule non viene visto sulla base della piastra. Una volta notato un numero sufficiente di cellule sulla piastra o dopo sette giorni, a seconda di quale sia prima, rimuovere tutti i restanti pezzi di tessuto. Successivamente, coltura le ASC nei mezzi di coltura tissutale fino a raggiungere il 70% di confluenza o fino a quando i cluster diventano densi a quel punto le cellule devono essere passaggio.
Risciacquare delicatamente la piastra con 1X soluzione salina tamponata con fosfato. Per tripinare le cellule aderenti, aspirare la salina tamponata dal fosfato, aggiungere un millilitro di tripsina integrato con 0,25%EDTA ad ogni piastra e incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Aggiungere una piccola quantità di supporto alla piastra per disattivare la tripina.
Quindi pipettare delicatamente la tripina media dalla parte superiore della piastra verso il basso, persi tutte le cellule debolmente attaccate dalla piastra. Per seminare le cellule, aggiungere prima il supporto alla piastra. Quindi, aggiungere le celle in modo dropwise e quindi ruotare la piastra per garantire una distribuzione uniforme attraverso la piastra.
Dopo tre passaggi, procedere ai test di citometria e differenziazione del flusso. Dopo tre passaggi, asc isolati da campioni di lipoaspirato e addominoplastica hanno una morfologia e fenotipo MSC, simili alle ASC isolate a seguito di una digestione enzimatica. Come altri MSC, gli ASC isolati di explant sono negativi per CD45 e positivi per CD73, CD90 e CD105.
Quando si trita il tessuto, la superficie di ogni pezzo deve essere sufficientemente grande da far migrare gli ASC dal tessuto. Si tratta di cellule staminali fondamentali che possono essere utilizzate per un'ampia gamma di applicazioni. Gli ASC isolati possono essere utilizzati per qualsiasi applicazione a valle, in vivo o in vitro.
